Effect of tetrapeptide Acetyl-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-amide on immunological and biochemical parameters of Wistar rats using passive smoking models

Full Text

Введение

В настоящее время гуморальные регуляторные факторы иммунной системы, действующие как местно, так и на системном уровне, находятся в центре внимания как потенциальные лекарственные препараты. Особое место среди биорегуляторов иммунной системы занимают низкомолекулярные медиаторы полипептидной природы – пептидные гомологи первичной аминокислотной последовательности фрагмента адренокортикотропного гормона (АКТГ)_15-18 (Lys-Lys-Arg-Arg), в которых одна или две природных аминокислоты заменены на соответствующий D-стереомер. Продемонстрированные в ряде работ их церебропротекторные и нейропротекторные свойства [3, 4] и антиоксидантный эффект [5, 6, 10] характеризуют данные пептидные соединения как перспективные стресспротекторные средства. В то же время исследования практически не коснулись оценки иммунотропных свойств данных тетрапептидов на моделях воздействия ксенобиотиков. Известно, что одним из наиболее часто встречающихся неблагоприятных воздействий окружающей среды на организм является табакокурение. Отрицательное действие пассивного курения на различные системы организма выявлено у экспериментальных животных [8]. В связи с этим, представляет интерес исследование влияния пептидных гомологов первичной аминокислотной последовательности фрагмента АКТГ_15–18, в первую очередь на иммунную систему, используя модель пассивного табакокурения.

Целью настоящего исследования явилась оценка эффективности воздействия тетрапептида Acetyl-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-amide на иммунологические и биохимические параметры самок крыс Wistar при пассивном табакокурении.

Материалы и методы

Экспериментальные исследования были выполнены на 72 самках крыс линии Wistar половозрелого возраста массой 160-200 г. Животных содержали на стандартном пищевом рационе без ограничения доступа к воде. Пептидный гомолог фрагмента АКТГ_15-18 (Acetyl-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-amide, лабораторный шифр КК1) синтезирован в ФГУП «Гос. НИИ ОЧБ» ФМБА России и любезно предоставлен членом-корреспондентом РАН, профессором А.С. Симбирцевым. Животные были разделены на 4 группы: 1-я группа – 26 контрольных самок, 2-я группа – 8 крыс, получавших пептид КК1, 3-я группа – 16 крыс, подвергавшихся пассивному табакокурению, 4-я группа – 10 куривших крыс, получавших пептид КК1. Животным 2-й и 4-й групп вводили тетрапептид КК1 интраназально в виде водного раствора в дозе 40 мкг/кг, через день, 1 раз в сутки на протяжении 10 дней. Крысам 1-й и 3-й групп вводили интраназально физиологический раствор в равных объемах с остальными группами. Опытные крысы 3-й, 4-й группы подвергались фумигации табачным дымом по 8 часов ежедневно в течение 20 дней. Контрольные крысы в аналогичный период помещались в камеру, вентилируемую атмосферным воздухом без табачного дыма. Животные содержались в стандартных условиях, при двенадцатичасовом световом режиме и свободном доступе к воде и корму. Эвтаназию осуществляли дислокацией шейных позвонков под эфирным наркозом.

Для оценки степени воздействия табачного дыма определяли уровень котинина в сыворотке крови крыс методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором на хроматографе Agilent 5977GC/MSD. Идентификацию веществ проводили по библиотекам масс-спектров (NIST 20) MPW5e (DD2019) EKBDRUGS (MS LIBRARY EKBDRUGS) SUDMED MASS SPECTRA (SUDMED MS) Cann_Metab Рub_sav50. В исследуемых объектах идентифицировали пики с временами удерживания следующих веществ: дифениламин внутренний стандарт – 5,36 мин, котинин – 5,69 мин. Полуколичественный расчет концентрации котинина в пробах выполняли по фактору отклика внутреннего стандарта – дифениламина.

Массу крыс, тимуса и селезенки, количество лейкоцитов, тимоцитов, спленоцитов, миелокариоцитов, циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) определяли в соответствии с лабораторными методами исследования экспериментальных животных [2]. Продукцию цитокинов IL-6 и IFNã исследовали в супернатантах культур спленоцитов после 48-часовой инкубации клеток при 37 °С в атмосфере 5% СО₂ в полной культуральной среде (RPMI-1640 с добавлением 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина и 80 мкг/мл гентамицина). Оценивали спонтанную и индуцированную конканавалином А (Кон А) в конечной концентрации 10 мкг/мл секрецию спленоцитами IL-6 и IFNã. Определение концентрации цитокинов в супернатантах проводили с использованием иммуноферментных тест-систем (IFN gamma Rat ELISA Kit, США, IL-6 Rat ELISA Kit, США). Активность ферментов аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ) определяли в сыворотке крови на автоматическом биохимическом анализаторе BioSystems А-25 (Испания) с помощью наборов Bio Systems (Испания). Для изучения элементного статуса организма животных в качестве биосубстратов использовали периферическую кровь и образцы печеночной ткани. В образцах определяли Cu, Zn, Fe, Mn, Cd, Pb, Ni, Co, Cr методом атомно-абсорбционный спектрометрии на приборе «Квант-2А» (ООО «КОРТЭК»).

Эксперименты были проведены с учетом этических норм и рекомендаций по гуманизации работы с лабораторными животными, отраженными в «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей» (Страсбург, 1998); приказом МЗ РФ N267 от 19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторной практики». Результаты представлены в виде медианы и интерквартильного размаха – Mе (Q_0,25-Q_0,75). Группы сравнивали с помощью U-критерия Манна–Уитни с использованием пакета прикладных программ Statistica for Windows v. 6.0, StatSoft Inc. (США). Различия считали достоверными при р < 0,05.

Результаты и обсуждение

В качестве биомаркера пассивного табакокурения, отражающего уровень воздействия курения на организм, в сыворотке крови был определен уровень котинина, основного метаболита никотина in vivo. Так, у крыс опытных групп уровень котинина составил 17 (9-25) нг/мл, что подтверждает воздействие табачного дыма на организм экспериментальных животных. У животных 1-й и 2-й контрольных групп котинин не детектировался.

При одинаковом содержании и питании животных средняя масса крыс была достоверно снижена у животных 3-й группы (160 (157-165) г) и 4-й группы (177 (174-185) г) по сравнению с аналогичным параметром контрольной группы (200 (191-205) г). Анализ периферической крови крыс показал отсутствие выраженных изменений числа лейкоцитов и лейкоцитарной формулы у всех исследуемых групп животных.

В таблице 1 представлены иммунологические параметры пассивно куривших крыс Вистар, получавших тетрапептид КК1. Как видно из данных таблицы 1, пассивное курение крыс 3 опытной группы приводило к негативному эффекту, выражающемуся в снижении массы тимуса и селезенки, а также количества тимоцитов, спленоцитов и миелокариоцитов и напротив, увеличении ЦИК. Введение пептида КК1 некурившим крысам 2 группы способствовало увеличению массы тимуса у крыс 2 группы. Важно отметить, что аналогичное введение КК1 пассивно курившим крысам 4 группы способствовало восстановлению иммунологических параметров, которое выражалось в увеличении массы тимуса и количества спленоцитов, и, напротив, снижении ЦИК по отношению к параметрам курящих крыс 3 группы.

 

Таблица 1. Иммунологические параметры пассивно куривших крыс Wistar, получавших пептид КК1, Mе (Q_0.25-Q_0.75)

Table 1. Immunological parameters of passively smoking Wistar rats given peptide KK1, Me (Q_0.25-Q_0.75)

 

	1 группа Group 1 n=26	2 группа Group 2 n=8	3 группа Group 3 n=16	4 группа Group 4 n=10
Лейкоциты, ×109 White blood cells, ×109	5,4 [4, 3; 7, 9]	5,8 [5, 3; 6, 5]	5,8 [5, 0; 6, 3]	5,2 [4, 7; 6, 4]
Масса тимуса, мг Thymus, weight, mg	231 [212; 283]	280* [255; 297]	123* [120; 147]	180** [156; 191]
Число тимоцитов, ×106/орган Number of thymocyte ×106/organ	352 [320; 386]	340 [320; 376]	209* [161; 219]	225* [161; 219]
Масса селезенки, мг Spleen, weight, mg	444 [382; 501]	486 [443; 523]	317* [305; 328]	352* [321; 377]
Число кариоцитов, ×106/орган Number of karyocytes ×106/organ	496 [413; 560]	426 [382; 465]	251* [209; 284]	320** [315; 345]
Число миелокариоцитов, ×106/орган Number of myelocaryocytes, ×106/organ	88 [78; 101]	79 [67; 90]	58* [48; 70]	62* [58; 69]
ФП Phagocytic parameter	38 [32; 41]	32 [21; 37]	27* [18; 32]	30* [28; 32]
ФИ Phagocytic index	5,8 [5, 0;6, 1]	5,4 [4, 7;6, 1]	4,1* [3, 4; 5, 3]	4,9 [3, 9; 5, 4]
ЦИК, у.е. CIC, c.u.	70 [66; 71]	80 [78; 84]	96* [90; 103]	74** [68; 79]
IFNγ (спонтанная) (пг/мл) IFNγ (pg/mL)	30 [29; 31]	28 [28; 29]	21* [21; 22]	26 [23; 28]
IFNγ (КонА) (пг/мл) IFNγ - Induced Con A (pg/mL)	67 [66; 68]	64 [64; 66]	45* [43; 48]	52 [52; 54]
IL-6 (спонтанная) (пг/мл) IL-6 (pg/mL)	83 [76; 94]	80 [75; 83]	73 [69; 75]	92 [87; 96]
IL-6  (пг/мл) (КонА) IL-6 - Induced Con A (pg/mL)	137 [118; 141]	128 [115; 136]	105* [93; 117]	120 [115; 129]

Оценивая фагоцитарные параметры, необходимо отметить снижение фагоцитарного показателя и фагоцитарного индекса у животных 3-й опытной группы по сравнению с параметрами контрольной группы. Введение иммуномодулятора КК1 некурившим крысам достоверно не изменяло данные параметры. При введении КК1 пассивно курившим крысам сохранялось значимое снижение фагоцитарного показателя, тогда как фагоцитарный индекс имел тенденцию к нормализации.

Анализ количества IFNã, продуцируемого спленоцитами, выявил угнетение спонтанной и индуцированной продукции IFNã у пассивно куривших крыс 3-й группы по сравнению с аналогичным показателем у контрольных крыс. Важно отметить, что интенсивность спонтанной и индуцированной продукции IFNã у куривших крыс, получавших КК1, статистически значимо не отличалась от контрольной группы. Анализ индуцированной продукции IL-6 спленоцитами показал снижение данного показателя у опытных животных 3-й группы. Вместе с тем введение КК1 пассивно курившим крысам способствовало нормализации данного показателя до уровня контрольной группы. Введение пептида КК1 контрольным животным 2-й группы значимого влияния на спонтанную и индуцированную продукцию цитокинов IFNã и IL-6 не оказывало. Полученные данные показывают, что спонтанная и индуцированная секреция клетками селезенки IFNã при воздействии пассивного табакокурения снижается.

Биохимический анализ активности АЛТ и АСТ показал отсутствие значимых изменений данных показателей у животных всех исследуемых групп. Вместе с тем необходимо отметить тенденцию к повышению активности АЛТ в 1,4 раза (119,7 (111,3-136,7) ед/л) и АСТ в 1,1 раза (251,0 (223,7-265,3) ед/л) у животных опытной группы, по сравнению с аналогичными параметрами контрольной группы (81,2 (77,5-85,9) ед/л и 228,0 (218,0-246,6) ед/л соответственно), что может служить маркером развития патологии печени у животных, подвигавшихся воздействию пассивного табакокурения.

Учитывая данные литературы о том, что изменение уровня отдельных микроэлементов влияет на иммунологические параметры [1, 7], представляло интерес исследование уровня микроэлементов в крови и печени крыс для выяснения их участия в механизмах, лежащих в основе изменений иммунологических показателей. Установлено, что введение тетрапептида КК1 существенно не изменяло уровень исследуемых микроэлементов в периферической крови и печени экспериментальных животных 1-й и 2-й групп. Вместе с тем выявлено, что пассивное табакокурение крыс 3-й и 4-й групп сопровождалось общей тенденцией к кумуляции железа, свинца и никеля в периферической крови (табл. 2). Микроэлементный состав печени крыс 3-й и 4-й опытных групп характеризовался увеличением концентрации железа, кадмия, свинца, кобальта, и напротив, снижением уровня цинка. Важно отметить более выраженное увеличение концентрации кадмия, свинца и кобальта у крыс 3-й опытной группы по сравнению с содержанием данных микроэлементов в печени куривших животных, которым вводили тетрапептид КК1. Установленные изменения могут быть связаны с синергическими (железо и никель) и антагонистическими (цинк и медь, железо, хром) взаимодействиями микроэлементов [9].

 

Таблица 2. Уровень микроэлементов в крови и печени пассивно куривших крыс Wistar, получавших пептид КК1, Mе (Q_0.25-Q_0.75)

Table 2. The level of elements in the blood and liver of passively smoking Wistar rats given peptide KK1, Mе (Q_0.25-Q_0.75)

	Cu	Zn	Fe	Mn	Cd	Pb	Ni	Co	Cr
Кровь Blood
1 гр. gr.1 n=8	1,2 [1, 1;1, 4]	5,1 [4, 4;5, 4]	271,0 [247;286]	0,14 [0, 13;0, 16]	0,00 [0;0]	0,011 [0, 002;0, 02]	0,020 [0, 02;0, 03]	0,000 [0;0, 006]	0,17 [0, 12;0, 18]
2 гр. gr.2 n=8	1,0 [0, 8;1, 2]	5,6 [5, 1;6, 0]	294,5 [282;326]	0,12 [0, 10;0, 15]	0,00 [0, 0;0, 005]	0,010 [0, 0;0, 01]	0,022 [0, 01;0, 04]	0,000 [0, 0;0, 002]	0,17 [0, 14;0, 20]
3 гр. gr.3 n=8	1,4 [1, 4;1, 5]	4,9 [4, 5;5, 6]	362,0* [319;414]	0,13 [0, 09;0, 18]	0,00 [0;0, 008]	0,030* [0, 02;0, 04]	0,080* [0, 06;0, 10]	0,006 [0;0, 008]	0,20 [0, 16;0, 25]
4 гр. gr.4 n=8	1,35 [1, 3;1, 5]	5,6 [5, 3;5, 9]	403,0* [327;442]	0,18 [0, 11;0, 21]	0,000 [0;0, 002]	0,025* [0, 02;0, 04]	0,120* [0, 06;0, 13]	0,003 [0, 0;0, 005]	0,25 [0, 21;0, 26]
Печень Liver
1 гр. gr.1 n=8	3,5 [3, 5;3, 6]	32,2 [29, 4;35, 6]	126,9 [123;130]	1,80 [1, 70;1, 85]	0,008 [0, 006;0, 008]	0,080 [0, 07;0, 10]	0,125 [0, 085;0, 283]	0,007 [0, 006;0, 007]	0,185 [0, 16;0, 21]
2 гр. gr.2 n=8	3,6 [3, 4;3, 8]	35,8 [34, 0;38, 5]	134,1 [128;137]	1,65 [1, 40;1, 82]	0,007 [0, 005;0, 009]	0,095 [0, 08;0, 10]	0,130 [0, 10;0, 16]	0,0070 [0, 006;0, 008]	0,190 [0, 16;0, 20]
3 гр. gr.3 n=8	3,8 [3, 7;4, 0]	27,5* [26, 1;28, 6]	153,5 [131;169]	2,00 [1, 90;2, 22]	0,013* [0, 01;0, 014]	0,150* [0, 12;0, 17]	0,195 [0, 18;0, 22]	0,0080* [0, 008;0, 009]	0,225 [0, 19;0, 24]
4 гр. gr.4 n=8	3,7 [3, 5;3, 9]	36,1 [30, 7;37, 5]	157,3* [146;163]	2,00 [1, 88;2, 10]	0,009 [0, 01;0, 013]	0,120* [0, 09;0, 145]	0,195 [0, 17;0, 23]	0,0070 [0, 006;0, 008]	0,265 [0, 23;0, 31]

 

Обсуждая полученные результаты, необходимо отметить, что в основе сдвигов параметров иммунной системы, выявленных в данной работе, может лежать ряд возможных причин. С одной стороны, известно, что один из компонентов табачного дыма – бензол оказывает выраженное гематотоксическое действие, при этом в наибольшей степени страдает лимфоидная линия клеток, так как полигидроокисленные метаболиты бензола аккумулируются в костном мозге и лимфоидных органах, вызывая гипоплазию центральных и периферических органов иммунитета. Видимый признак такого явления – это уменьшение клеточности в органах кроветворения и лимфоидных органах (селезенка, тимус) [13], что установлено в настоящей работе. Наряду с этим, снижение количества тимоцитов может быть обусловлено их миграцией из коркового вещества сначала в мозговое вещество, а затем в кровоток. С другой стороны, содержащиеся в табачном дыме кадмий, хром и железо, действуя прооксидантно, могут нарушать клеточный окислительно-восстановительный гомеостаз, вызывая необратимые повреждения ДНК или РНК [11, 14] и перекисное окисление липидов полиненасыщенных жирных кислот, вызывая повреждение клеточных мембран [12], приводя в итоге к некрозу или апоптозу, что объясняет выявленное уменьшение количества тимоцитов, спленокариоцитов и снижение веса органов. В основе нормализующего действия олигопептидов-гомологов фрагмента (АКТГ)_15–18 может лежать показанное в ряде работ выраженное антиоксидантное и стресспротекторное действие, приводящее к снижению токсического действия экотоксикантов [3, 5].

Заключение

Таким образом, полученные результаты позволяют использовать экспериментальную модель пассивного табакокурения для оценки эффективности тетрапептидов. Введение тетрапептида Acetyl-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-amide пассивно курившим крысам способствует тенденции к нормализации массы тимуса и селезенки, числа тимоцитов и спленоцитов, снижении ЦИК. Целесообразным является дальнейшее изучение механизмов действия тетрапептидов на иммунную систему.

About the authors

Natalia A. Kuzmicheva

Orenburg State Medical University

Author for correspondence.
Email: natalie-vip@list.ru
ORCID iD: 0000-0003-4144-1470

Senior Lecturer, Department of Pharmaceutical Chemistry

Russian Federation, 6 Sovetskaya St., Orenburg, 460000

Irina V. Mikhailova

Orenburg State Medical University

Email: michaylova74@yandex.ru

PhD, MD (Biology), Associate Professor, Head, Pharmaceutical Chemistry Department

Russian Federation, 6 Sovetskaya St., Orenburg, 460000

Julia V. Filippova

Orenburg State Medical University

Email: yuliaf78@mail.ru

PhD (Medicine), Associate Professor, Department of Pharmaceutical Chemistry

Russian Federation, 6 Sovetskaya St., Orenburg, 460000

Aleksandr Smolyagin

Orenburg State Medical University

Email: a.i.smolyagin@mail.ru

PhD, MD (Medicine), Professor, Department of Clinical Laboratory Diagnostics

Russian Federation, 6 Sovetskaya St., Orenburg, 460000

Natalia M. Livshic

Orenburg State Medical University

Email: probllab.orenburg@mail.ru

PhD (Medicine), Senior Laboratory Assistant, Immunological Laboratory

Russian Federation, 6 Sovetskaya St., Orenburg, 460000

Igor V. Miroshnichenko

Orenburg State Medical University

Email: k_normphys@orgma.ru

PhD, MD (Medicine), Professor, Head, Department of Normal Physiology

Russian Federation, 6 Sovetskaya St., Orenburg, 460000

References

Supplementary files