Content of myeloid-derived suppressor cells in autoimmune diseases in children

Full Text

Введение

Клетки-супрессоры миелоидного происхождения (MDSCs) происходят из гемопоэтических стволовых клеток в результате измененного миелопоэза в ответ на патогенные сигналы, такие как TLR, DAMPs, PAMPs, вызывая активацию различных воспалительных цитокинов. [8]. При патологических состояниях MDSCs, в отличие от физиологически дифференцированных миелоидных клеток, имеют незрелый фенотип, слабую фагоцитарную активность и обладают иммуносупрессивной функцией [11]. Охарактеризованы две основные популяции MDSCs с экспрессией маркеров LIN^–HLA-DR^–CD33⁺CD11b⁺: моноцитарные (M-MDSCs) с экспрессией CD14⁺ и полиморфноядерные (или гранулоцитарные) (PMN-MDSCs или G-MDSCs) с экспрессией CD15⁺ [3]. Кроме того, была идентифицирована новая субпопуляция MDSCs – фиброцитоидная MDSCs (F-MDSCs) с фенотипом CD11b^low CD11c^low CD33⁺IL-4ra⁺ в пуповинной крови или периферической крови пациентов с метастатической детской саркомой [15]. Иммуносупрессорная функция MDSCs реализуется за счет прямого контакта с клетками, а также вследствие истощения запасов аминокислот, необходимых для метаболизма Т-лимфоцитов. Так, в результате повышенной секреции аргиназы (Arg- 1), индуцибельной синтазы оксида азота (iNOS) и индоламиндиоксигеназы (IDO), ингибируется синтез æ-цепи в TCR, что приводит к апоптозу Т-клеток [4]. Иммуносупрессивная активность MDSCs при раке и инфекционных заболеваниях неблагоприятна для прогноза заболевания [4]. Роль MDSCs при аутоиммунных заболеваниях противоречива. Имеются данные о роли MDSC в регуляции прогрессирования различных аутоиммунных заболеваний. У пациентов с рассеянным склерозом (РС) с рецидивирующе-ремиттирующим течением в обострении заболевания количество MDSC увеличивалось. У пациентов со вторично-прогрессирующим РС при обострении содержание MDSC в крови было снижено [5]. В эксперименальных работах показано, что MDSCs ускоряют анергию и апоптоз инфильтрированных Т-клеток. Легкое течение РС у животных было связано с более высоким содержанием MDSCs на периферии и меньшими демиелинизирующими поражениями в центральной нервной системе [7]. Для взрослых пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника (ВЗК) показано, что увеличение количества M-MDSCs клеток было связано с активностью заболевания [12]. В одной из экспериментальных работ адоптивный перенос MDSCs уменьшал воспаление и способствовал эффективному восстановлению слизистой оболочки толстой кишки за счет экспансии Treg, подавления секреции цитокинов, таких как IL-17A и TNFá. Элиминация MDSCs приводила к ухудшению симптомов колита [13]. С другой стороны, G-MDSCs из периферической крови пациентов с ВЗК не только не подавляли ответ аутологичных Т-клеток, но усиливали пролиферацию Т-клеток in vitro [14]. Также было продемонстрировано, что делеция Arg-1 в миелоидных клетках способствует прогрессированию колита у экспериментальных животных [6]. Выявлена роль MDSCs в поляризации Th17-клеток, являющаяся Arg-1-зависимой. Продемонстрировано на моделях мышей и у пациентов с системной красной волчанкой и артритом, что Arg-1 и IL-1â, секретируемые MDSCs, управляют дифференцировкой T-хелперов 17-го типа (Th17). Количество MDSCs положительно коррелировало с активностью Arg-1 в сыворотке крови, с содержанием Th17 клеток и тяжестью заболевания у пациентов с СКВ [10]. MDSC, выделенные от пациентов с псориазом (ПС), не способны подавлять активацию Т-клеток с одной стороны [9]. С другой стороны, в эксперименте показано, что истощение MDSCs с помощью гемцитабина значительно подавляло псориатическое воспаление и утолщение эпидермиса, а также накопление клеток Th17 и Treg. Воздействие на MDSCs предлагается в качестве новой стратегии терапии псориаза [2].

Таким образом, MDSCs обладают как провоспалительными, так и противоспалительными функциями. Объяснение разных функций MDSCs может заключаться в том, что иммунное микроокружение влияет на развитие и функцию MDSCs, M-MDSC и G-MDSC. Популяции MDSCs, вероятно, имеют разные иммуносупрессивные функции на разных стадиях аутоиммунного заболевания и по-разному регулируют иммунный ответ [14].

Цель – оценить содержание MDSCs, их субпопуляций и активность аргиназы-1 в MDSCs у детей с аутоиммунными заболеваниями.

Материалы и методы

Обследовано 75 детей с ВЗК в возрасте Me-14,7 (10,1-16,7) лет, 60 детей с рецидивирующе-ремиттирующим РС (РС) в возрасте Me-16,8 (15-17,6) лет, 69 детей с вульгарным псориазом в возрасте Me-12,6 (9,4-14,4) лет. По течению заболевания пациенты были поделены на группы «обострение» и «ремиссия» с использованием клинико-анамнестических данных, а также специальных индексов и методов. Пациенты с ВЗК были разделены на группы с использованием педиатрических индексов активности болезни PCDAI для БК (≤ 10 – ремиссия, > 10 – обострение) и PUCAI для ЯК (≤ 10 – ремиссия, > 10 – обострение). Для оценки состояния пациентов с псориазом применяли индекс распространенности и тяжести псориаза PASI (≤ 10 – ремиссия, > 10 – обострение). Состояние пациентов с РС оценивали по результатам МРТ: пациенты с контрастнегативными очагами демиелинизации (ремиссия); с контрастпозитивными очагами демиелинизации (обострение). Группу сравнения составили 62 здоровых ребенка в возрасте Me-12,2 (10,3-17,3) без отклонений в стандартном клиническом и биохимическом исследованиях, а также при отсутствии острых или обострения хронических состояний, травм, аутоиммунных, онкологических и психических заболеваний.

Обследование всех групп детей проводилось согласно этическим и нормативным документам Российской Федерации. Исследование получило одобрение локального этического комитета ФГАУ НМИЦ здоровья детей. Перед исследованием было получено информированное согласие родителей для всех обследованных детей в соответствии с Хельсинкской декларацией. Образцы венозной крови для исследования получали натощак путем забора из локтевой вены в пробирки BDVacutainer^® с антикоагулянтом К₂ЭДТА.

Содержание основных и малых популяций лимфоцитов, MDSC, популяций MDSCs, оценку активности Arg-1 проводили методом проточной лазерной цитофлуориметрии (Novocyte, ACEA Biosciences, США). Использовали панель моноклональных антител, конъюгированных с различными флюорохромами (Beckman Coulter, Sony Biotechnology, США). Для выделения определенных популяций использовали тактику пошагового гейтирования: для выделения Тreg и Thact выделяли «лимфоидный» регион по параметрам прямого (FSC) и бокового (SSC) светорассеяния, выделяли CD4⁺ лимфоциты, среди CD4⁺ клеток выделяли Treg по маркерам (CD4⁺CD25^highCD127^low), Thact (CD4⁺CD25^highCD127^high), Th17-лимфоцитах (CD4⁺CD161⁺CD3⁺). Для оценки содержания MDSCs использовали следующую тактику гейтирования: выделяли «лимфоидно-моноцитарный» регион (МНК), далее выделяли популяцию клеток, не несущих на себе линейные лимфоцитарные маркеры CD3, CD19, CD56 и негативные по HLA-DR, из этой популяции выделяли двойную позитивную популяцию по маркерам CD11b и CD33; M-MDSCs и G-MDSCs разделяли по экспрессии CD14 и CD15 соответственно. Оценивали относительное количество (% от МНК) и абсолютное количество (кл/мкл) для популяций MDSCs. Количественную оценку активности аргиназы в MDSCs проводили в предварительно выделенных пермеабилизированных МНК из периферической крови пациентов после добавления соответствующей панели для выделения MDSCs, а также антител к Arg-1: коктейль – (CD3, CD19, CD56, HLA-DR)^- FITC, CD11b APC-Cy7 и CD33 PE-Cy7, Arg-1PE.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием программы Statistica 10.0 (StatSoft, США). Описательная статистика количественных признаков представлена в формате: медиана (нижние и верхние квартили) – Me (Q_0,25-Q_0,75). Достоверность различий между группами оценивали с помощью непараметрического U-критерия Манна–Уитни. Статистически значимыми считали различия при р < 0,05.

Результаты и обсуждение

Содержание MDSCs, G-MDSCs, M-MDSCs, MDSCs (M-G-) у пациентов с ВЗК, РС, ПС

Относительное количество MDSCs у пациентов исследованных патологий было достоверно выше, чем в группе сравнения и зависело от состояния обострение/ремиссия (табл. 1). У пациентов с РС относительное содержание популяций M-MDSCs (Me-15,2 (8,2-22,9) % MDSCs) и G-MDSCs (Me-40,9 (31,5-64,3)) было достоверно выше, а MDSC(M^-G^-) (Me-29,3 (20,4-48,6)) значимо ниже относительно группы сравнения. Для пациентов с ВЗК характерно повышение популяции MDSCs за счет моноцитарной составляющей Ме-21,5 (11,8-45,1) %. При анализе содержания MDSСs, M-MDSCs, G-MDSCs и MDSCs(M^-G^-) между пациентами с разными патологиями выявлено, что дети с РС значимо отличались от пациентов с ВЗК и ПС по популяциям клеток-супрессоров миелоидного происхождения. У детей с РС в обострении выявлено наибольшее содержание общей популяции MDSCs за счет G-MDSCs, которая составляла 53,3% от всех MDSCs. Дети с ВЗК относительно ПС имели более высокое содержание M-MDSCs и более низкое содержание двойных незрелых клеток-супрессоров.

 

ТАБЛИЦА 1. Содержание популяций mdscs у пациентов с взк, рс, пс в состоянии обострения и ремиссии относительно группы сравнения

TABLE 1. Content of populations of mdscs in patients with ibd, ms, ps in the state of exacerbation and remission related to the comparison group

Параметр Parameter	Группы пациентов Patient groups	ВЗК1 IBD1	РС2 MS2	ПС3 PS3	Группа сравнения Comparison group
MDSCs, %	Обострение Exacerbation	3,17* (2,34-4,70)	3,5* (2,5-5,6)	3,2* (1,9-3,9)	1,6 (0,9-2,5)
	Ремиссия Remission	2,3* (1,6-3,2) p1 = 0,014	2,7* (2,1-4,5) p2 = 0,088	2,5* (1,5-3,4) p3 = 0,197
M-MDSCs, кл/мкл M-MDSCs, cells/ìL	Обострение Exacerbation	104* (54-166)	80* (68-115)	87* (52-123)	44 (25,4-53,9)
	Ремиссия Remission	73* (57-109) p1 = 0,077	64* (41-79) p2 = 0,018	76* (47-94) p3 = 0,228
M-MDSCs, %	Обострение Exacerbation	29* (13,0-65,1)	16,3 (8,8-22,9)	16,6 (3,2-29,5)	9,8 (5,6-16,7)
	Ремиссия Remission	17,1* (5,1-38,5) p1 = 0,045	14,1 (6,8-27,8) p2 = 0,467	10,6 (4,8-20,3) p3 = 0,262
M-MDSCs, кл/мкл M-MDSCs, cells/ìL	Обострение Exacerbation	27* (9-76)	10* (6-17)	11* (3-30)	3,2 (1,3-7,5)
	Ремиссия Remission	10* (4-28) p1 = 0,024	8* (4-16) p2 = 0,082	7* (2-20) p3 = 0,197
G-MDSCs, %	Обострение Exacerbation	13,1 (5,1-38,7)	53,3* (35,5-64,7)	28,9 (17,6-40,5)	20,2 (12,3-41,3)
	Ремиссия Remission	22,7 (4,5-32,9) p1 = 0,574	38,1* (30,2-55,9) p2 = 0,096	20,9 (11,1-33,0) p3 = 0,146
G-MDSCs, кл/мкл G-MDSCs,cells/ìL	Обострение Exacerbation	13* (5-41)	38* (25-68)	29* (15-40)	8,5 (4,2-15,9)
	Ремиссия Remission	13 (4-26) p1 = 0,712	22* (15-43) p2 = 0,022	13* (5-27) p3 = 0,055
MDSCs (М-G-), %	Обострение Exacerbation	33,5* (18,7-51,7)	28* (20,2-43,8)	51,2* (36,3-62,3)	66,3 (46,5-77,2)
	Ремиссия Remission	54,3 (26,5-67,9) p1 = 0,037	40,3* (20,6-58,5) p2 = 0,230	64,6 (44,6-76,3) p3 = 0,059
MDSCs (М-G-), кл/мкл MDSCs (М-G-), cells/ìL	Обострение Exacerbation	37 (19-56)	20 (12-34)	32* (23-53)	27,4 (12,3-35,0)
	Ремиссия Remission	37* (19-53) p1 = 0,95	19 (13-29) p2 = 0,843	38* (25-53) p3 = 0,645

Примечание. p₁ – достоверность различий между состоянием обострения и ремиссией у пациентов с ВЗК, p₂ – достоверность различий между состоянием обострения и ремиссией у пациентов с РС, p₃ – достоверность различий между состоянием обострения и ремиссией у пациентов с ПС, * – достоверность различий между состоянием обострения и ремиссией у пациентов по сравнению со здоровыми детьми.

Note. p₁, significance of differences between the state of exacerbation and remission in patients with IBD; p₂, significance of differences between the state of exacerbation and remission in patients with MS; p₃, significance of differences between the state of exacerbation and remission in patients with PS; *, significance of differences between the state exacerbations and remissions in patients compared with healthy children.

 

Анализ содержания популяций клеток-супрессоров миелоидного происхождения показал достоверное повышение % содержания MDSCs в группах детей в обострении и в ремиссии заболевания для исследованных патологий по сравнению со здоровыми детьми (табл. 1). Наибольшие значения MDSCs наблюдались у пациентов в обострении РС по сравнению со здоровыми детьми (Me-3,5 (2,5-5,6) % МНК против Me-1,6 (0,9-2,5), p = 0,000). Кроме того, у пациентов с РС как в обострении, так и в ремиссии заболевания содержание G-MDSC, M-MDSC было достоверно выше, а MDSC(M^-G^-) достоверно ниже показателей здоровых детей. Работ по исследованию MDSCs у пациентов с РС сравнительно немного и они противоречивы. У взрослых пациентов сообщалось о снижении содержания в циркуляции MDSCs по сравнению со здоровыми донорами [1]. Кроме того, было показано, что увеличение содержания G-MDSC у пациентов с РС связано с активностью заболевания [1]. В нашем исследовании достоверные отличия между группами детей с РС в обострении и ремиссии были получены для абсолютного количества G-MDSC (Me-38,2 (24,9-67,5) кл/мкл против Me-22,1 (14,9-42,9) кл/мкл, p = 0,022).

У пациентов с ВЗК значимое увеличение относительного содержания MDSCs (Me-3,17 (2,34-4,7) % МНК против Me-2,3 (1,6-3,2), p = 0,014) и увеличение доли популяции M-MDSC (Me-29 (13-65,1) % MDSCs против Me-17,1 (5,1-38,5), p = 0,045) между группами пациентов в обострении и ремиссии были выявлены. Наши данные согласуются с данными, полученными у взрослых пациентов о прямой зависимости между увеличением количества M-MDSCs и активностью заболевания [12]. Кроме того, в нашем исследовании получено, что содержание MDSC(M^-G^-) у пациентов с ВЗК было достоверно выше в состоянии ремиссии по сравнению с группой детей в обострении (Me-33,5 (18,7-51,7) % MDSCs против Me-54,3 (26,5-67,9), p = 0,037).

В исследовании зарубежных авторов также было показано увеличение как MDSCs, так и G-MDSCs у взрослых пациентов с РС в обострении заболевания [7]. Мы также показали, что у детей с РС в обострении по сравнению с группой детей в ремиссии были достоверно выше % содержание M-MDSCs и G-MDSCs. Как уже упоминалось, MDSCs в зависимости от микроокружения могут выполнять как провоспалительные, так и противоспалительные функции. Иммунное микроокружение может влиять на развитие и функцию G-MDSCs, M-MDSCs и MDSCs(M^-G^-), которые выполняют разные функции на разных стадиях аутоиммунного заболевания и по-разному регулируют иммунный ответ [14].

Активность Arg-1 в MDSCs у пациентов с ВЗК РС, ПС

Для определения функциональной состоятельности популяций MDSCs были проанализированы результаты активности внутриклеточного фермента аргиназы-1. Выявлено достоверное увеличение активности Arg-1 у пациентов с ВЗК (Me-1676 (1284,5-2540) MFI) и ПС (Me-1603 (1020,5-3030) MFI) по сравнению с группой здоровых детей (Me-980,5 (897-1113,8) MFI), p = 0,000. Активность Arg-1 между группами пациентов с ВЗК и ПС не отличалась, но была значимо выше, чем в группе детей с РС (Me-1096 (642-2534)) (p < 0,05).

Анализ активности Arg-1 в MDSCs в зависимости от состояний обострение/ремиссии выявил достоверное увеличение ферментативной активности при снижении % содержания MDSCs у пациентов в ремиссии относительно обострения заболевания для исследованных патологий (рис. 1А, Б).

 

Рисунок 1. Относительное содержание MDSCs (A) и активность Arg-1 (Б) у пациентов с ВЗК, РС, ПС при обострении (1) и ремиссии (2)

Примечание. p – достоверность различий между группами обострение и ремиссия. Штрих-линией показан диапазон содержания MDSCs и Arg-1 у здоровых детей.

Figure 1. Relative content of MDSCs (A) and Arg-1 activity (B) in patients with IBD, MS, PS during exacerbation (1) and remission (2)

Note. p is the significance of differences between exacerbation and remission groups. The dashed line shows the range of MDSCs and Arg-1 content in healthy children.

 

Наибольшая активность Arg-1 относительно группы сравнения отмечена у пациентов с ПС (Me-2968 (1397,5-3311,5) MFI против Me-980,5 (897-1113,8) MFI, p = 0,000). Между группами пациентов в обострении при исследованных патологиях наблюдались достоверные отличия (рис. 1Б). У пациентов в ремиссии наблюдалось значимое отличие (p < 0,01) активности аргиназы: активность фермента у пациентов с ВЗК и ПС была выше, чем у пациентов с РС. Полученные нами данные согласуются с экспериментальными исследованиями, в которых пониженное содержание Arg-1 усугубляло проявления колита у мышей [6]. Наименьшая активность Arg-1 наблюдалась у пациентов в обострении с РС (Me-600 (381,9-1125) MFI) и была достоверно ниже по сравнению с группами пациентов в обострении с ВЗК (Me-1467 (1002-1785) MFI), ПС (Me-1490 (830-1723) MFI) и группой здоровых детей (p < 0,01). Таким образом, активность Arg-1 была значимо увеличена в состоянии ремиссии относительно обострения заболевания при ВЗК, РС и ПС. Интересно отметить, что у пациентов с РС в обострении заболевания содержание общей популяции MDSCs было наибольшим, а активность Arg-1 – минимальная. Вероятно, увеличение количества MDSCs при данной патологии компенсирует недостаточную функциональность этих клеток.

Заключение

Количество общей популяции MDSCs у детей с ВЗК, РС и ПС было значимо выше относительно группы сравнения как в обострении, так и в ремиссии заболевания. Для разных патологических состояний характерно перераспределение относительного количества популяций MDSCs, которое ассоциировано с активностью заболевания. Для детей с ВЗК характерно повышение моноцитарной популяции MDSCs, а для детей с РС – гранулоцитарной популяции MDSCs. Содержание общей популяции MDSCs у детей с ВЗК в обострении заболевания значимо выше, чем в ремиссии. Иммуносупрессорная активность MDSCs (активность аргиназы-1) увеличена в состоянии ремиссии заболевания при ВЗК, РС и ПС.

About the authors

Tatiana V. Radygina

National Medical Research Center for Children’s Health

Author for correspondence.
Email: tvradigina@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4704-6885

Ph.D. (Medicine), Senior  Research  Associate, Laboratory of Experimental Immunology and Virology

Russian Federation, 2/1, Lomonosovskiy Pr-t, Moscow, 119991

Daria G. Kuptsova

National Medical Research Center for Children’s Health

Email: dg.kuptsova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-7771-3314

Junior Researcher, Laboratory of Experimental Immunology and Virology

Russian Federation, 2/1, Lomonosovskiy Pr-t, Moscow, 119991

Svetlana V. Petrichuk

National Medical Research Center for Children’s Health

Email: cito@list.ru
ORCID iD: 0000-0003-0896-6996

PhD, MD (Biology), Professor,  Chief Scientist,  Laboratory of  Experimental Immunology and Virology

Russian Federation, 2/1, Lomonosovskiy Pr-t, Moscow, 119991

Alexander S. Potapov

National Medical Research Center for Children’s Health; I. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: potapov@nczd.ru
ORCID iD: 0000-0003-4905-2373

PhD, MD (Medicine), Professor, Chief Research Associate, Laboratory of Scientific Foundations of Pediatric Gastroenterology and Hepatology, Head of the Center for Inflammatory Bowel Diseases in Children, Head of Gastroenterology Department with Hepatology Group, National Medical Research Center for Children’s Health, Professor, Department of Pediatrics and Pediatric Rheumatology

Russian Federation, 1/2, Lomonosovskiy Pr-t, Moscow, 119991; 8/2, st. Trubetskaya, Moscow, 119991

Nikolay N. Murashkin

National Medical Research Center for Children’s Health; I. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University); Central State Medical Academy of Department of Presidential Affairs

Email: m_nn2001@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2252-8570

PhD, MD (Medicine), Professor, Head, Research Institute of Pediatric Dermatology, Dermatology Department with Laser Surgery Unit and Children’s Skin Pathology Laboratory, Professor, Department of Dermatovenereology and Cosmetology, Professor, Department of Pediatrics and Pediatric Rheumatology

Russian Federation, 1/2, Lomonosovskiy Pr-t, Moscow, 119991; 8/2, st. Trubetskaya, Moscow, 119991; 19/1A, Marshal Tymoshenko st., Moscow, 19991

Luizat М. Abdullaeva

National Medical Research Center for Children’s Health

Email: instorm@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0003-1574-2050

Junior Research assistant, Laboratory of rare hereditary diseases in children of the medical genetic center, neurologist of the Department of Psychoneurology and Psychosomatic Pathology

Russian Federation, 2/1, Lomonosovskiy Pr-t, Moscow, 119991

Olga V. Kurbatova

National Medical Research Center for Children’s Health

Email: putintseva@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9213-5281

PhD (Medicine), Senior Research Associate, Head, Laboratory of Experimental Immunology and Virology

Russian Federation, 2/1, Lomonosovskiy Pr-t, Moscow, 119991

Valeriya S. Tsvetkova

National Medical Research Center for Children’s Health

Email: tsvetkova.valerie@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-8162-2957

PhD (Medicine), Research Associate, Gastroenterologist, Gastroenterology Department with Hepatology Group

Russian Federation, 2/1, Lomonosovskiy Pr-t, Moscow, 119991

References

Supplementary files