Association between polymorphic eNOS gene markers and risk of primary open-angle glaucoma in the Perm Region population

Full Text

Введение

Глаз – это иммунно-привилегированный орган, в котором из-за локальных особенностей иммунитета в норме не развиваются воспалительные реакции, приводящие к повреждению тканей глаза, а также, как следствие, к снижению или потере зрительных функций [1].

В настоящее время выделен ряд факторов, обеспечивающих иммунную привилегированность глаза, которые условно делятся на пассивные и активные [3, 16]. К пассивным факторам относят особенности иммуноморфологии, включающие наличие гематоофтальмического барьера, недостаточность афферентного лимфатического дренажа и недостаточность экспрессии молекул главного комплекса гистосовместимости (MHC) I и II классов на тканях глаза. К активным факторам относят конститутивную экспрессию на поверхности интраокулярных клеток ряда мембранных молекул, в том числе молекулы апоптоза Fas-лиганда (Fas-L), ингибиторов активации комплемента (CD59, MCP, DAF) и иммуносупрессивное микроокружение тканей глаза [3, 7, 11, 16, 18, 21].

По данным литературы, известно, что нарушения баланса иммунологических факторов в глазу могут привести к развитию патологии этого органа, в том числе глаукоме, катаракте [2].

Известно, что глаукома занимает ведущие позиции среди причин неизлечимой слепоты и является важной медико-социальной проблемой. По данным ВОЗ, в мире сейчас более 100 млн человек страдают глаукомой, из них 5,2 млн человек слепые на оба глаза вследствие этого заболевания, что составляет 13,5% от всех случаев потери зрения [10, 21].

Процент заболеваемости глаукомой постоянно растет. По прогнозам ВОЗ, число больных глаукомой в мире возрастет к 2040 году до 111,8 млн человек. В России, по разным оценкам, число больных глаукомой составляет от 750 тысяч до 1,3 млн [10].

Глаукома, согласно общепринятой классификации, бывает открытоугольной и закрытоугольной. Первичная открытоугольная глаукома (ПОУГ) представляет собой наиболее распространенный тип глаукомы, на долю которого приходится три четверти всех случаев заболевания [9].

Основным фактором риска развития глаукомы является повышенное внутриглазное давление (ВГД). Однако это не объясняет, по какой причине у пациентов развивается глаукома, в то время как их ВГД находится в норме [5]. В связи с этим в последнее время глаукому изучают с точки зрения иммунопатогенеза.

Среди иммунологических факторов, которые могут играть ключевую роль при глаукоме – факторы врожденного иммунитета, обеспечивающие первую линию защиты организма. Повышенное ВГД запускает иммунные реакции, включающие вспомогательные иммунные клетки, что ведет к активации микроглии, а также инфильтрации макрофагов/моноцитов. На сегодняшний день основные воспалительные сигналы, приводящие к глаукоматозной нейродегенерации, остаются неизвестными [2, 14].

В последние годы доказана важная роль в патогенезе глаукомы нейровоспалительных процессов, опосредованных астроцитами, микроглией, эндотелиальными клетками, а также факторами врожденного иммунного ответа [17].

Окислительный стресс уже давно считается одним из основных факторов, лежащих в основе патофизиологии заболеваний глаз, в том числе глаукомы [4, 6]. Генетические факторы подтверждают эту теорию. За последнее десятилетие было идентифицировано около 40 полиморфизмов в генах, белковые продукты которых связаны с риском развития патологии.

Патогенез ПОУГ связывают с влиянием оксида азота (NO). В норме его действие связано с вазодилатирующим эффектом, улучшением кровотока, перфузии зрительного нерва и усилением оттока внутриглазной жидкости, с другой стороны – его участием в регуляции окислительного стресса и цитотоксического влияния свободных радикалов на ганглиозные клетки сетчатки. Поскольку NO продуцируется эндотелиальной NO-синтазой (eNOS), можно предположить, что eNOS участвует в патогенезе нейродегенеративных изменений при ПОУГ [8, 12, 19, 20]. В последние годы активно изучаются полиморфные варианты гена eNOS, по многим данным литературы найдены взаимосвязи между полиморфизмами этого гена и возникновением заболеваний глаз, в том числе глаукомы [3, 13].

Несмотря на большое количество исследований в области окислительного стресса и врожденного иммунитета, некоторые вопросы остаются без ответа. По это причине целью настоящего исследования было изучение ассоциации полиморфных маркеров гена eNOS с риском развития первичной открытоугольной глаукомы у жителей Пермского края.

Материалы и методы

Для исследования ассоциации полиморфных маркеров в генах были изучены данные 188 пациентов в возрасте от 39 до 89 лет. Из них основную группу составили 90 человек, у которых была диагностирована первичная открытоугольная глаукома. При этом у 80 человек этой группы была диагностирована катаракта различной степени зрелости; сопутствующее заболевание (гипертоническая болезнь) было у 67 человек. Группу сравнения составили 98 человек, у которых была диагностирована возрастная катаракта различной степени зрелости и отсутствовали признаки глаукомы, при этом гипертоническая болезнь в качестве сопутствующей патологии была у 54 человек. Все пациенты были жителями Пермского края и проходили лечение в Центре микрохирургии глаза Пермской краевой клинической больницы по поводу катаракты или глаукомы. Всем больным при поступлении в стационар разъяснялась суть проводимого исследования, ими подписывалось добровольное согласие на участие в нем. В качестве материала использовалась периферическая кровь, из которой набором К-СОРБ, фирмы «Синтол» (Россия) по протоколу была выделена ДНК, потом проводили полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени (ПЦР-РВ) с использованием наборов для определения полиморфных маркеров T786C, C774T, Glu 298 Asp в гене eNOS фирмы «Синтол» (Россия).

Для описания количественных переменных использовали среднее со стандартным отклонением (М±SD) и медиану с межквартильным размахом – Me (Q_0,25-Q_0,75). Сравнение групп по возрасту проводился с помощью u-критерия Манна–Уитни, сравнение групп по частоте гендерного распределения, а также по частоте встречаемости аллелей поводилось с помощью критерия хи-квадрат.

Распределение аллелей и генотипов по группам описывалось с помощью процентных долей. Распределение долей генотипов поверялось с помощью критерия хи-квадрат.

Анализ взаимосвязи генотипов и наличия глаукомы у пациентов проводили с помощью бинарной логистической регрессии. Результаты описаны с помощью отношения шансов (ОШ) и 95% доверительного интервала для ОШ (ДИ). ОШ равное единице показывает равенство сравниваемых шансов. Если доверительный интервал ОШ включает единицу, то отсутствует статистически значимая связь между генотипом и наличием глаукомы у пациента. Для анализа совместного действия генотипов на наличие глаукомы использовался байесовский подход к построению логистической регрессии.

При оценке результатов статистически значимыми считали результаты при значениях р < 0,05. Анализ и визуализацию полученных данных проводили с использованием компьютерной программы для статистической обработки данных – статистического пакета для социальных наук SPSS (Statistical Package for the Social Science).

Результаты

Средний возраст пациентов основной группы составил 71±7 лет (медиана 70 лет, 66-73 года), из них 50% – пациенты женского пола и 50% – мужского. Средний возраст в группе сравнения составил 69±9 лет (медиана 69 лет, 64-75 лет), из них 58% – пациенты женского пола и 42% – мужского. Статистически значимые различия между основной группой и группой сравнения по возрасту и по соотношению мужского и женского пола выявлены не были (р = 0,36 и р = 0,42 соответственно).

Для пациентов обеих групп проводилось генотипирование полиморфизмов Glu298Asp, C774T, T786C по гену eNOS. Результаты анализа представлены в таблице 1.

 

Таблица 1. Распределение частот генотипов и аллелей по полиморфным локусам гена eNOS

Table 1. Distribution of frequencies of genotypes and alleles by polymorphism of the eNOS gene

Полиморфизм Polymorphism	Генотип/ аллель Genotype/allele	Группы Group
		Пациенты с ПОУГ Patients with POAG	Группа сравнения Control group
T786C	ТТ	0,58	0,38	χ2 = 6,478 р = 0,039
	СС	0,11	0,17	χ2 = 1,130 р = 0,301
	ТС	0,31	0,45	χ2 = 3,464 р = 0,071
	Т	0,68	0,58	χ2 = 1,130 р = 0,301
	С	0,32	0,42	χ2 = 6,471 р = 0,013
C774T	ТТ	0,08	0,08	χ2 = 0,392 р = 0,838
	CС	0,53	0,49
	ТС	0,39	0,43
	Т	0,48	0,65	χ2 = 0,644 р = 0,456
	С	0,52	0,35
Glu298Asp	TT	0,48	0,47	χ2 = 0,008 р = 0,967
	CC	0,12	0,13
	TC	0,4	0,4
	T	0,63	0,63	χ2 = 0,04 р = 1
	C	0,37	0,37

 

При анализе частоты встречаемости аллелей гена eNOS по полиморфному локусу T786C в основной группе были вывялены процентные доли аллелей: 67,5% для аллеля Т и 32,5% для аллеля С. В группе сравнения эти процентные доли составили 43,31,3% для аллеля Т и 31,5% для аллеля С. У пациентов с глаукомой наблюдалось достоверное снижение встречаемости аллеля С по сравнению с контрольной группой (р = 0,013), по частоте встречаемости аллеля Т статистически значимых отличий не вывялено (p > 0,05). На рисунке 1 представлено распределение долей аллелей для основной группы и для группы сравнения.

 

Рисунок 1. Распределение долей аллелей полиморфизма T786C в группах

Figure 1. Distribution of allele shares T786C polymorphism in groups

 

При исследовании распределения генотипов по полиморфному локусу T786C гена eNOS в основной группе доля гомозигот по аллелю Т составила 57,9%, доля гомозигот по аллелю С составила 11,4% и доля гетерозигот составила 30,7%. Распределение генотипов для группы сравнения составило 38,5% для ТТ, 16,7% для ТС и 44,8% для СС. Соответствие равновесию Харди–Вайнберга также не было нарушено. В группе пациентов с ПОУГ установлено достоверное повышение частоты встречаемости гомозиготного генотипа ТТ по сравнению с контрольной группой (р = 0,039). При этом шанс развития ПОУГ в 2,12 раза выше по сравнению с контрольной группой (95% ДИ: 1,18-3,81), различия были статистически значимыми. Кроме того, у пациентов с ПОУГ выявлена тенденция к снижению встречаемости генотипов ТС и СС гена eNOS (T786C) по сравнению с контрольной группой (р > 0,05). На рисунке 2 представлено распределение генотипов для основной группы и для группы сравнения.

 

Рисунок 2. Ассоциация различных генотипов полиморфизма T786C с глаукомой

Figure 2. Association of different genotypes of T786C polymorphism with glaucoma

 

При анализе распределения аллелей по полиморфному локусу С774Т гена eNOS в основной группе были выявлены процентные доли аллелей: 66,1% для аллеля Т и 33,9% для аллеля С. В группе сравнения эти процентные доли составили: 65% для аллеля Т и 35% для аллеля С. По частоте встречаемости аллелей основная группа и группа сравнения статистически значимо не различались (p > 0,05). На рисунке 3 представлено распределение долей аллелей для основной группы и для группы сравнения.

 

Рисунок 3. Распределение долей аллелей полиморфизма C774T в группах

Figure 3. Distribution of allele shares of C774T polymorphism in groups

 

При анализе распределения генотипов по полиморфному локусу C774T гена eNOS у пациентов с ПОУГ выявлено снижение встречаемости генотипа ТС, по генотипам СС и ТТ различий не было. Полученные данные по распределению частот генотипов и аллелей оказались статистически недостоверными (р > 0,05). На рисунке 4 представлено соотношение пациентов в основной группе и группе сравнения для каждого генотипа С774Т гена eNOS.

 

Рисунок 4. Ассоциация различных генотипов полиморфизма С774Т с глаукомой

Figure 4. Association of various genotypes of C774T polymorphism with glaucoma

 

В ходе анализа полиморфного варианта Glu298Asp также было выявлено отсутствие статистически значимых различий между основной группой и группой сравнения по частотам встречаемости аллелей (р > 0,05). И в основной группе, и в группе сравнения частота встречаемости аллеля С составила 32%, а аллеля Т составила 68%. Распределение аллелей по группам представлено на рисунке 5.

 

Рисунок 5. Распределение долей аллелей полиморфизма Glu298Asp в группах

Figure 5. Distribution of allele shares of Glu298Asp polymorphism in groups

 

При анализе частот генотипов было выявлено одинаковое распределение аллелей в обеих группах: для генотипа ТТ – 48%, для генотипа СТ – 39%, для генотипа СС – 13%.

В ходе сравнения генотипов для полиморфизма Glu298Asp гена eNOS были определены отношения шансов наличия глаукомы и соответствующие р-значения.

По данной выборке шансы наличия глаукомы для генотипов полиморфизма Glu298Asp статистически значимо не различались. При анализе распределения генотипов по полиморфному локусу Glu298Asp гена eNOS у пациентов с ПОУГ выявлено снижение встречаемости всех генотипов по сравнению с обследованными контрольной группы. Однако полученные данные по распределению частот генотипов и аллелей оказались статистически недостоверными (р > 0,05). На рисунке 6 представлено соотношение пациентов с глаукомой и без нее для каждого генотипа.

Обсуждение

По литературным данным известно, что эндотелиальная NO-синтаза участвует в патогенезе нейродегенеративных изменений при ПОУГ. В проведенном исследовании показано, что в группе пациентов с открытоугольной глаукомой генотип ТТ (по полиморфному локусу T786C гена eNOS) ассоциирован с риском развития глаукомы, в то время как аллель С (T786C гена eNOS) играет протективную роль. Кроме того, выявлено совместное влияние генотипов ТТ по полиморфному локусу Т786С гена eNOS и ТС по полиморфному локусу Glu298Asp гена eNOS на развитие первичной открытоугольной глаукомы у исследуемых больных. Гипертоническая болезнь усиливала негативное влияние повышенного внутриглазного давления на глаукомную оптическую нейропатию.

Заключение

По результатам проведенного исследования было показано, что прогностическими маркерами являются генотип ТТ по полиморфному локусу T786C гена eNOS, повышающий вероятность развития первичной открытоугольной глаукомы у жителей Пермского края, и аллель С (T786C гена eNOS), играя, наоборот, протективную роль при этом заболевании.

About the authors

Tatyana V. Gavrilova

E. Wagner State Medical University

Email: mech.inst@mail.ru

PhD, MD (Medicine), Professor, Head, Department of Ophtalmology

Russian Federation, 105064, Moscow, Maly Kasennyi lane, 5a, bldg 1

Aliya R. Kinkulkina

I. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University); I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: mech.inst@mail.ru

Postgraduate Student, Department of Microbiology, Virology and Immunology, Junior Research Associate

Russian Federation, 105064, Moscow, Maly Kasennyi lane, 5a, bldg 1; Moscow

Hasmik S. Avagyan

I. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University); I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: mech.inst@mail.ru

Student, Laboratory Assistant, Laboratory of Molecular Immunology

Russian Federation, 105064, Moscow, Maly Kasennyi lane, 5a, bldg 1; Moscow

Oksana A. Svitich

I. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University); I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Author for correspondence.
Email: mech.inst@mail.ru

PhD, MD (Medicine), Corresponding Member, Russian Academy of Sciences, Professor, Department of Microbiology, Virology and Immunology, Director, F. Erismann Institute of Public Health, I. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), Director, I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Russian Federation, 105064, Moscow, Maly Kasennyi lane, 5a, bldg 1; Moscow

References

Supplementary files