Impairment of natural killer populations in the patients recovered from COVID-19

Full Text

Работа выполнена по теме гос. задания «Иммунофизиологические и патофизиологические механизмы регуляции и коррекции функций организма» № гос. регистрации 122020900136-4 и поддержана грантом РФФИ и NSFC, 20-515-55003).

Введение

При развитии SARS-CoV-2 инфекции практически все компартменты иммунной системы вовлекаются в процесс противодействия инфекции и далеко не всегда успешно. Показано, что пациенты SARS-CoV-2 характеризуются целым рядом нарушений со стороны Т-клеток [6]. Несомненную важность для протекания инфекции играет координация и оптимизация как врожденного, так и адаптивного иммунитета в ответ на вирусные инфекции. В этом очень динамичном сценарии натуральные киллеры (NK-клетки), вероятно, играют определяющую роль в формировании выраженности ответа врожденного иммунитета у пациентов с COVID-19, способствуя сбалансированности прямого ответа на вирус – путем устранения инфицированных клеток (дендритных клеток, моноцитов и Т-клеток). Нарушение этого баланса оказывается критичным в случае SARS-CoV-2, поскольку сверхактивный цитокиновый ответ, типичный для тяжелых случаев заболевания, приводит к развитию системных осложнений, полиорганной недостаточности и, в конечном итоге, к смерти [5].

Различные популяции NK-клеток выступают первой линией защиты при COVID-19 [3]. При анализе крови пациентов COVID-19 с легкой и тяжелой формой болезни было показано, что SARS-CoV-2 также вызывает сильные нарушения регуляторных звеньев иммунной системы, характеризующейся относительной потерей лимфоидных клеток в сочетании с увеличением количества миелоидных клеток. При тяжелом течении заболевания отмечается увеличение количества NK, экспрессирующих KIR2DS4, CD158i, а также изменения со стороны В-клеток, проявляющиеся снижением CD19, CD20 и IgM⁺ [8].

У больных COVID-19 отмечается уменьшение количества CD3⁺CD4⁺T-лимфоцитов, CD3⁺CD8⁺T-лимфоцитов, CD19⁺B-лимфоцитов и CD16⁺CD56⁺NK-клеток в периферической крови [11].

В то же время при особо тяжелом течении заболевания отмечается сверхактивация Т-клеток, повышение CCR4⁺, CCR6⁺, h17 и повышение активности и количества цитотоксических CD8⁺ Т-клеток в периферической крови [12].

Необходимо отметить, что описанные нарушения регуляции CD3⁺CD8⁺Т-лимфоцитов, CD16⁺CD56⁺NK-клеток, C1q, а также повышение в крови IL-6, наряду с бактериальной коинфекцией, являются важными причинами развития бактериальной пневмонии, которая приводит к утяжелению состояния и зачастую – к смерти пациента [11].

Все эти исследования проводились в период развития острого COVID-19 у пациентов. Исследование же NK-клеток у постковидных пациентов практически не проводятся. В то же время пациенты, страдающие от осложнений COVID-19, включая госпитализацию и изоляцию от членов своей семьи, испытывают сильный психологический и социальный стресс. Изоляция аналогична стрессу физической иммобилизации, который связан с резким повышением уровня кортизола и стероидов [9]. Экстремальные уровни стресса также повышают уровень цитокинов и способствуют медицинским осложнениям у пациентов с COVID-19, которые уже испытывают повреждение органов из-за цитокинового шторма [5]. Длительное стрессорное воздействие также способствует формированию иммунной недостаточности [4, 10]. Все это приводит к развитию постковидного синдрома у большого процента пациентов, перенесших COVID-19.

Отсутствие фундаментальных исследований состояния иммунной системы у таких пациентов и разработки мер их терапии может серьезно осложнить сроки реабилитации, а также ухудшить прогноз их дальнейшей выживаемости при последующих вирусных (в том числе и сезонных) заболеваниях.

Учитывая, что NK-клетки являются одними из ключевых клеток иммунной системы, участвующие в противовирусной защите, мы сочли необходимым изучить параметры иммунной системы, связанные с нарушением уровня NK-клеток у постковидных пациентов.

Цель исследования – изучить уровень NK-клеток, уровень кортизола и особенности нарушений иммунной системы у пациентов, перенесших SARS-CoV-2 инфекцию.

Материалы и методы

Было обследовано 78 пациентов, перенесших SARS-CoV-2 инфекцию. Критерием включения в группы исследований были: подтвержденный диагноз SARS-CoV-2 инфекции методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), наличие IgA, M, G к вирусу SARS-CoV-2 инфекции, данные компьютерной томографии о перенесенной пневмонии (варианты: КТ1 – поражение до 25% легких, КТ2 – поражение до 50% легких, КТ3 – поражением до 75% легких, КТ4 – поражение свыше 75% легких). Исследование проводилось не менее чем через 6 месяцев после перенесенной пневмонии вызванной SARS-CoV-2 инфекцией.

Все пациенты были предварительно обследованы врачом-терапевтом и иммунологом-аллергологом, для выявления сопутствующих заболеваний. Группы были рандомизированы по полу, возрасту, сопутствующим заболеваниям по критерию χ². Пациенты были разделены на 2 группы сравнения: 1. Пациенты с уровнем NK-клеток ниже нормы. 2. Пациенты с нормальным уровнем NK-клеток. За норму NK-клеток были приняты данные, представленные в монографии Зурочка А.В. и соавт. (2018) [1]. Все исследования были одобрены Независимым локальным этическим комитетом при ГАУЗ ОТКЗ «Городская клиническая больница №1» г. Челябинска, протокол № 8 от 11.04.2022, на базе которой проводились данные исследования.

Иммунологические исследования

Общий анализ крови (исследовано 25 параметров: лейкоцитарный, эритроцитарный и тромбоцитарный ростки кроветворения), количественный и качественный состав ростков кроветворения проведен стандартизованным методом на гематологическом анализаторе Medonic M20 (Швеция).

Методом проточной цитометрии CD45⁺ (панлейкоцитарный маркер для гейтирования лимфоцитов), CD45⁺, CD3⁺ (Т-лимфоциты), CD45⁺, CD3⁺, CD4⁺ (хелперы индукторы), CD45⁺, CD3⁺, CD8⁺ (цитотоксические Т-лимфоциты,), CD45⁺, CD3⁺ CD16⁺, CD56⁺ (TNK-клетки) CD45⁺, CD3^-, CD16⁺, CD56⁺ (натуральные киллеры), CD45⁺, CD3^-, CD19⁺ CD5⁺ (В-лимфоциты), CD45⁺, CD3⁺, CD4⁺, CD25⁺, CD127^- (Т-регуляторные клетки/супрессоры), CD45⁺, CD3⁺, CD4⁺, CD25⁺ (активированные хелперы, ранняя активация лимфоцитов), CD45⁺, CD3⁺, HLA-DR (активированные Т-лимфоциты – поздняя активация лимфоцитов), В-клеток памяти CD27⁺, Beckman Coulter, BioLegend (США). Оценку иммунного статуса осуществляют методом проточной цитометрии на цитофлюориметре Navios (Beckman Coulter, США) по стандартизованной технологии оценки лимфоцитарного звена иммунитета [1, 2].

Оценка фагоцитарной активности частиц латекса диаметром 1,7 мкм нейтрофилами (активность фагоцитоза, интенсивность фагоцитоза, фагоцитарное число); спонтанная и индуцированная НСТ-активность нейтрофилов морфологическим методом (световая микроскопия с использованием микроскопов Olimpus (Япония). Исследование проводится общепринятыми методами оценки функциональной активности фагоцитов.

Уровни общих IgA, IgG, IgM, специфические IgM, IgG к коронавирусу COVID-19, C1-ингибитора, С3а- и С5а-компонентов комплемента методом иммуноферментного и иммунофлюоресцентного анализа на иммуноферментном анализаторе Multiscan FC Thermoscientific (Китай). Исследование проводилось общепринятыми стандартизованными методами иммуноферментного анализа (АО «Вектор-Бест», Россия).

Также у пациентов был определен уровень кортизола, как маркера стресса методом иммуноферментного анализа (АО «Вектор-Бест», Россия).

Обработка и анализ данных осуществлялись с помощью R 3.1.1 12 (R Foundation for Statistical Computing, Вена, Австрия) и Microsoft Excel версии 14.0. Так как распределение в количественных данных было не нормальным (p-value теста Шапиро–Уилка < 0,05), то использованные статистические критерии были непараметрическими.

Результаты и обсуждение

При сравнении показателей между группами КТ 1, 2, 3, 4 через 6 месяцев после перенесенного заболевания мы не выявили достоверных различий между группами. Поэтому мы остановились на другом виде анализов, объединив различные группы пациентов по другому принципу – по нарушению в тех или иных компартментах иммунной системы. В этой части исследований мы предоставляем данные по пациентам, у которых были выявлены нарушения со стороны NK-клеток (критерии включения в группы нами описаны выше в материалах и методах).

Как показали наши исследования, нарушения уровня NK-клеток нами были выявлены у 29 пациентов (37,1%) из 78 обследованных. При этом снижение уровней натуральных киллеров у этой группы пациентов было резко, более чем в 3 раза, ниже, чем у постковидных пациентов, не имеющих такого нарушения. Очень важно, что это нарушение практически не связано с другими компартментами иммунной системы, за исключением относительного количества Т-лимфоцитов и Т-хелперов. Данные показатели были достоверно выше, чем у пациентов без нарушения уровня NK-клеток. Абсолютное количество этих клеток также повышалось, но не имело достоверных различий при сравнении групп.

Кроме того, отмечено, что у пациентов со сниженным уровнем NK-клеток сохраняется более высокий уровень кортизола (табл. 1.). Еще одной особенностью является тот факт, что у этих пациентов достоверно выше уровень тромбоцитов (252,379±15,575 против 206,327±6,576, р < 0,01) и тромбоцитокрита (0,199±0,011 против 0,168±0,005, р < 0,01).

 

Таблица 1. Показатели иммунной системы и уровня кортизола у постковидных пациентов с нарушением уровня NK-клеток, M±m / Table 1. Immune and cortisol scores in post-COVID patients with impaired NK cell levels, M±m

Показатели иммунной системы Immune system indicators	Группа 1. Постковидные пациенты со сниженным уровнем NK-клеток Group 1. Post-COVID patients with reduced levels of NK cells n = 29	Группа 2. Постковидные пациенты с нормальным уровнем NK-клеток Group 2. Post-COVID patients with normal levels of NK cells n = 49
NK-клетки (CD45+CD3-CD16+CD56+) отн. (%) NK cells (CD45+CD3-CD16+CD56+) rel. (%)	6,028±0,395*	16,071±0,803
NK-клетки (CD45+CD3-CD16+CD56+) абс. (109 кл/л) NK cells (CD45+CD3-CD16+CD56+) abs. (109 cell/L)	125,310±12,008*	371,694±33,265
T-лимфоциты (CD45+CD3+CD19-) отн. (%) T lymphocytes (CD45+CD3+CD19-) rel. (%)	77,872±0,966*	68,173±1,015
T-лимфоциты (CD45+CD3+CD19-) абс.(109 кл/л) T lymphocytes (CD45+CD3+CD19-) abs. (109 cells/L)	1656,897±127,242	1514,551±75,103
T-хелперы (CD45+CD3+CD4+) отн. (%) T helpers (CD45+CD3+CD4+) rel. (%)	51,324±1,801*	44,504±1,057
T-хелперы (CD45+CD3+CD4+) абс. (109 кл/л) T helpers (CD45+CD3+CD4+) abs. (109 cell/L)	1108,724±100,164	985,347±51,788
Кортизол Cortisol	604,974±49,812*	543,813±38,251

Примечание. * – достоверность различий между группами р < 0,05.

Note. *, significance of differences between groups p < 0.05.

 

Как показали наши исследования, более чем у трети обследованных лиц выявляется резкое, трехкратное снижение количества натуральных киллеров. Это снижение сопровождается более высоким относительным уровнем Т-лимфоцитов и Т-хелперов, последнее, вероятно, связано с компенсаторным повышением Т-лимфоцитов и нарушением регуляции Т-клеточного звена иммунной системы, что требует более детального исследования и, скорее всего, изучения цитокинового профиля у таких пациентов. Более того, у части постковидных пациентов сохраняется высокий уровень кортизола, что свидетельствует о сохранении уровня напряженности хронического стресса. Также важным является выявленные изменения в тромбоцитарном звене кроветворения (повышение уровня тромбоцитов и тромбоцитокрита), которые могут приводить к поздним нарушениям системы свертывания крови и образованию тромбозов.

Выводы

1. У 37,1% постковидных пациентов выявляется значительное, более чем в 3 раза, снижение уровня NK-клеток.
2. Снижение уровня NK-клеток у постковидных пациентов сопровождается более высоким уровнем Т-лифоцитов, Т-хелперов.
3. Низкий уровень NK-клеток у постковидных пациентов сопровождается более высоким уровнем кортизола, тромбоцитов и тромбоцитокрита.

About the authors

Maria A. Dobrynina

Research Institute of Immunology and Physiology, Ural Branch, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: mzurochka@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1852-9650

PhD (Medicine), Research Associate, Laboratory of Inflammation Immunology

Russian Federation, 106, Pervomayskaya str., Yekaterinburg, 620049

Aleksandr V. Zurochka

Research Institute of Immunology and Physiology, Ural Branch, Russian Academy of Sciences; South Ural State University

Email: av_zurochka@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4371-4161

PhD, MD (Medicine), Professor, Head, Laboratory of Immune Biotechnology, Leading Research Associate

Russian Federation, 106, Pervomayskaya str., Yekaterinburg, 620049; Chelyabinsk

M. V. Komelkova

Research Institute of Immunology and Physiology, Ural Branch, Russian Academy of Sciences; South Ural State University

Email: mzurochka@mail.ru

PhD (Biology), Head, Laboratory of Systemic Pathology and Prospective Medical Drugs, Senior Research Associate, Laboratory of Immune Physiology and Immunopharmacology

Russian Federation, 106, Pervomayskaya str., Yekaterinburg, 620049; Chelyabinsk

Shanshan Luo

Institute of Hematology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology

Email: mzurochka@mail.ru

Professor

Taiwan, Province of China, Wuhan

References

Supplementary files