In vitro evaluation of immunomodulatory activity of Bifidobacterium bifidum 791 in the cell model of innate and adaptive immunity

Full Text

Работа выполнена по теме из Плана НИР ИИФ УрО РАН, № гос. регистрации АААА-А18-118020690020-1, и теме из Плана НИР ИКВС УрО РАН, № гос. регистрации 116021510075.

Введение

Функции бифидофлоры разнообразны, но основной является поддержание гомеостаза хозяина. Бифидофлоре принадлежит ведущая роль в синтезе биологически активных веществ, улучшении процессов всасывания и гидролиза жиров, белкового и минерального обмена [1, 6].

В последние десятилетия накоплены данные об иммунотропной активности бифидобактерий. Показан вклад бифидобактерий в развитие и функционирование изолированных лимфоидных фолликулов, специализированных кишечных структур, составленных из дендритных клеток и агрегатов В-клеток. В физиологических условиях штаммы бифидобактерий повышают колонизационную резистентность, подавляют воспалительные реакции и апоптоз [9]. Показано, что первичная дискриминация «чужеродного материала» бифидобактериями – инициальный этап последующего «сигналинга» в регуляции иммунного гомеостаза хозяина. Дальнейшие этапы регуляции осуществляются через дендритные клетки непосредственно бифидобактериями, их метаболитами с последующим воздействием на дифференцировку наивных CD4⁺T-лимфоцитов и поддержанием оптимального цитокинового баланса кишечного биотопа человека [2]. Установлено, что при взаимодействии специфической молекулы бифидобактерий, MAMP, с PRR, представленным на мембране эпителиальных/иммунных клеток, в основном, определяет клеточную структуру слизистой оболочки кишечника [12].

В различных исследованиях отмечено увеличение продукции широкого спектра про- и противовоспалительных цитокинов, сопровождающееся стимуляцией лейкоцитов крови при назначении пациентам пробиотиков содержащих бифидобактерии. Подтверждением иммуномодулирующей функции бифидобактерий являются данные зарубежных авторов о влиянии бифидосодержащих пробиотиков не только на индукцию, но и подавление выработки провоспалительтных цитокинов и хемокинов [1, 7, 10].

С учетом вышеизложенного, интерес к дальнейшим исследованиям иммуномодулирующих свойств пробиотических бактерий очевиден. Это связано не только с фундаментальной проблемой симбиоза человека и микробиоты, но и с перспективой практического применения полученных знаний в направлении создания пробиотиков, влияющих на иммунную систему в желаемом направлении. Данный факт требует разработки моделей для оценки иммуномодулирующего влияния бактерий с целью скрининга штаммов, способных оказывать влияние на иммунитет человека. Несмотря на то, что модели in vitro имеют важные ограничения, они позволяют провести предварительный скрининг эффектов, которые бактериальные клетки или их фракции могут оказывать на различные компоненты иммунного ответа [8]. В большинстве моделей in vitro, основанных на иммунных клетках, используются мононуклеарные клетки периферической крови (МНК).

Целью настоящего исследования явилось изучение влияния супернатанта (СН) и бактериальных клеток (БК) штамма B. bifidum 791 на модели мононуклеарных клетки периферической крови человека (МНК).

Материалы и методы

В работе использовали эталонный штамм B. bifidum 791 (Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИ «Генетика», № депонента АС-1247), использующийся при производстве пробиотика «Бифидумбактерин» (ЗАО «Экополис», г. Ковров). Ранее была доказана антимикробную активность экзометаболитов данного препарата [4].

Для получения СН и БК исследуемого штамма, рабочую концентрацию B. bifidum 791 (5 × 10⁷ КОЕ/мл) инокулировали на дно пробирки с 9 мл бульона Шедлера (HIMEDIA, Индия). Пробирки инкубировали в термостате при температуре 37 °C в течение 48 часов. Для получения супернатанта (экзометаболитов) бульонные культуры бифидобактерий центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 минут, надосадочную культуральную жидкость отделяли от клеток и стерилизовали через мембранные фильтры (Millipore, 0,22 мкм). С целью получения суспензии бактериальных клеток B. bifidum 791, осадок, полученный после центрифугирования бульонной культуры, дважды отмывали 0,9% физиологическим раствором хлорида натрия. Далее готовили бактериальную взвесь на 0,9%-ном физиологическом растворе хлорида натрия с концентрацией микроорганизмов 10⁹ КОЕ/мл (3 McF).

Мононуклеарные клетки (МНК) выделяли в стерильных условиях из периферической крови 20 практически здоровых доноров (10 мужчин и 10 женщин). Кровь забирали из локтевой вены в стерильную вакуумную пробирку с К3ЭДТА. МНК получали методом градиентного центрифугирования (400 g) в градиенте плотности фиколл-верографин (Pharmacia, Швеция) – 1,077 г/см³. МНК доведенные до 2 × 10⁶ клеток/мл, инкубировали в 24-луночных планшетах в присутствии бактерий в соотношении 1:1 и экзометаболитов в полной культуральной среде в течение 72 ч при 37 °C в атмосфере 5% CO₂. Нестимулированные МНК использовали в качестве отрицательного контроля.

Для окрашивания МНК использовали моноклональные антитела CD4, CD8, CD3, CD25, CD69, CD56 (Beckman Coulter, США). Анализ субпопуляционного состава проводили методом многоцветной проточной цитометрии на приборе Cytomics FC500 (Beckman Coulter, США).

Эксперименты проводили в двух повторах. Статистическую обработку полученных данных проводили средствами пакета Statistica 10 (StatSoft, США). Статистические результаты выражали в виде средней ошибки средней величины (m). Различия считались статистически достоверными при р < 0,05.

Результаты и обсуждение

Для оценки влияния бифидобактерий наиммунокомпетентные клетки, супернатант и клеточные экстракты бактерий B. bifidum 791 соинкубировали с МНК в соотношении 1:1. Результаты оценивали методом многоцветной проточной цитометрии.

На первом этапе с целью создания модели in vitro было проведено исследование жизнеспособности МНК с использованием витального красителя 7AAD после 72 часов инкубации с СН и БК B. bifidum 791. Установлено, что жизнеспособность иммунокомпетентных клеток составила 91±2,6% при соинкубации с полной инкубационной средой, 74±3,9% – с СН B. bifidum 791 и 49±5,1% – с КЭ B. bifidum 791. Далее, исследование влияния бифидобактерий на маркеры активации и активность NK-клеток оценивали только в жизнеспособных клетках. Маркеры активации и пролиферация Т-лимфоцитов обычно являются параметрами для оценки иммунной функции CD69 и CD25 представляют собой клеточные молекулы, экспрессия которых может быть индуцирована на Т-клетках, В-клетках, NK-клетках и других клетках путем стимуляции патогенами во время воспаления или митогенами. Следовательно, их поверхностная экспрессия может быть использована для оценки активации лимфоцитов.

На втором этапе исследований клетки окрашивали соответствующими комбинациями флуоресцентно меченных мышиных моноклональных антител против человека для различия субпопуляций лимфоцитов. При оценке иммуномодулирующей активности бифидобактерий на модели МНК in vitro, было установлено, что супернатант, и суспензия бактериальных клеток исследуемого штамма бифидобактерий были способны увеличивать экспрессию CD69 Т-клетками (CD3⁺, составляющие 79% лимфоцитов) (p > 0,05). При этом БК B. bifidum 791 не влияли на экспрессию CD69 (в CD3⁺CD4⁺Th-клетками (составляющими 51% лимфоцитов от CD3⁺), а СН исследуемого штамма – незначительно увеличивали экспрессию CD69 Th-клетками (3,24±0,98% и 0,69±0,2% соответственно) (р < 0,05). Примечательно, что и бактериальные клетки и супернатант B. bifidum 791 увеличивали % CD69⁺ клеток в субпопуляции CD3⁺CD8⁺Т-лимфоцитов, в норме составляющих 27% популяции Т-лимфоцитов (6,88±2,13% и 11,34±2,29% против 1,92±0,64% в контроле соответственно) (p < 0,05).

Также было выявлено, что БК и СН B. bifidum 791 преимущественно усиливали активацию цитотоксических лимфоцитов, что, по-видимому, является общей чертой пробиотических штаммов и подтверждается данными зарубежных исследователей [5]. Бактериальные клетки исследуемого пробиотического штамма бифидобактерий не влияли на экспрессию CD25 Т-клетками, Th или Ts-клетками. При этом супернатант B. bifidum 791 индуцировал экспрессию CD25 Т-цитотоксическими клетками (7,62±1,33% против 2,59±0,88% в контроле) (р < 0,05).

Известно, что NK-клетки являются компонентом неспецифического иммунного ответа, участвующего в разрушении опухолевых клеток и инфицированных вирусом клеток и составляют примерно 15% лимфоцитов. В эксперименте было получено значительное увеличение экспрессии CD69 (%) и CD25 (%) NK-клетками при сокультивировании как с БК, так и с СН исследуемого штамма бифидобактерий: полученные значения варьировали от 57,55 до 82,52% и от 8,08 до 22,26% соответственно при значениях в контрольных пробах 4,0 и 0,19 соответственно.

В настоящее время большинство пробиотических продуктов и препаратов создается на основе бифидобактерий, являющихся «ключевым» звеном кишечной микробиоты человека и выполняющих многофункциональную роль в поддержании гомеостаза хозяина. Это обусловлено тем, что бифидобактерии обеспечивают «устойчивость к заселению» (колонизации) тканей и органов человека патогенными и условно-патогенными микроорганизмами, обладают иммунотропной активностью и огромным потенциалом метаболических функций, что позволяет рассматривать их как эффективный «биокорректор» и основу для создания лечебно-профилактических препаратов [2, 11].

В проведенном исследовании установлено, что пробиотический штамм B. bifidum 791, использующийся в производстве бифидосодержащих препаратов, оказывает иммуномодулирующее действие на клетки неспецифического и адаптивного иммунитета. При этом результат воздействия на МНК различался при воздействии бактериальных клеток и супернатанта бифидобактерий. Полученные данные подтверждают значение супернатанта культур бифидобактерий в поддержании иммунного гомеостаза, показанный ранее на модели микросимбиоценоза кишечника человека, реализуемый через цитокиновый и антицитокиновый профиль хозяина [1].

Исследования показали, что пробиотические штаммы способны оказывать активизирующее и модулирующее воздействие на иммунокомпетентные клетки, что, возможно обеспечивает защиту против кишечных инфекций [3].

Таким образом, полученные материалы способствуют пониманию механизмов иммунорегуляторного влияния нормобиоты (на модели бифидобактерий) при формировании симбиотических взаимодействий «микробиота – хозяин» и вносят вклад в развитие нового направления – «инфекционная симбиология». С другой стороны, дальнейшее развитие исследований имеет практическую значимость, поскольку использование предложенной модели можно использовать для отбора штаммов бифидобактерий с высокой иммуномодулирующей активностью с целью создания пробиотических препаратов таргетного действия.

Выводы

1. Разработана модель in vitro сокультивирования МНК и клеточного концентрата bifidum.
2. Пробиотический штамм 791 оказывает иммуномодулирующее действие на клетки неспецефического и адаптивного иммунитета: увеличивает % CD69⁺ клеток в субпопуляции CD3⁺CD8⁺Т-лимфоцитов, CD69 (%) и CD25 (%) NK-клетками, а также усиливает активацию цитотоксических лимфоцитов.
3. Супернатант бифидобактерий оказывает более выраженное влияние на МНК (увеличивает экспрессию CD69 Th-клетками, индуцирует экспрессию CD25 Т-цитотоксическими клетками и увеличивает экспрессию CD69 (%) и CD25 (%) NK-клетками), в сравнении с бактериальными клетками bifidum 791.

About the authors

Elena G. Kostolomova

Tyumen State Medical University

Author for correspondence.
Email: lenakost@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0237-5522

PhD (Biology), Associate Professor, Department of Microbiology

Russian Federation, 5/2, Kotovsky str., Tyumen, 625027

Tatyana Kh. Timokhina

Tyumen State Medical University

Email: tanklaeva52@mail.ru

PhD, MD (Biology), Associate Professor, Department of Microbiology

Russian Federation, Tyumen

Natalia B. Perunova

Tyumen State Medical University; Instutute of Cellular and Intracellular Symbiosis

Email: perunovanb@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-6352-8879
SPIN-code: 9625-1578
Scopus Author ID: 6603461107

PhD, MD (Medicine), Professor, Leading Research Associate, University Institute of Medical Biotechnologies and Biomedicine, Leading Research Associate, Laboratory of Infectious Symbiology

Russian Federation, Tyumen; Orenburg

Elizabeth D. Polyanskikh

Tyumen State Medical University

Email: polyanskih.li@mail.ru

Student

Russian Federation, Tyumen

Roman A. Sakharov

Tyumen State Medical University

Email: bigsalad@mail.ru

Student

Russian Federation, Tyumen

Anastasia V. Komarova

Tyumen State Medical University

Email: filosov.03@mail.ru

Student

Russian Federation, Tyumen

References

Supplementary files