Studies of CD45+ and CD46+ expression on the peripheral blood lymphocyte subsets of the post-COVID patients

Full Text

Введение

Известно, что развитие SARS-CoV-2-инфекции обусловлено связыванием SARS-CoV-2 с ангиотензинпревращающим ферментом 2 (ACE2) и является критическим шагом в патофизиологии клинических проявлений у пациентов с COVID-19 [13]. Согласно литературе, вирус SARS-Cov-2 может проникать в клетки не только с помощью S1 вирусного шипового (S) белка через связывание с ACE2, но и через другие рецепторы клеток. К таким кандидатным рецепторам относится CD46, который, так же как и CD45, относится к панлейкоцитарным рецепторам и экспрессируется на всех видах лимфоцитов [8, 11]. CD46 представляет собой мембранный гликопротеин I типа, экспрессируемый на всех ядерных клетках, характеризующийся как регуляторный белок комплемента и как рецептор для ряда патогенов человека, включая вакцинный штамм вируса кори, аденовирусов (группы B и D) и вирусов герпеса 6 типа [12].

В то же время SARS-CoV-2-инфекция сопровождается повреждением практически всех компартментов иммунной системы и в первую очередь Т-лимфоцитов [3, 4]. При этом именно нарушение лимфоцитарного звена иммунной системы оказывается критичным в случае SARS-CoV-2, поскольку сверх активный цитокиновый ответ, типичный для тяжелых случаев заболевания, приводит к развитию системных осложнений, полиорганной недостаточности и, в конечном итоге, к смерти [9]. У больных COVID-19 отмечается уменьшение количества CD3⁺CD4⁺T-лимфоцитов, CD3⁺CD8⁺T-лимфоцитов, CD19⁺B- лимфоцитов и CD16⁺CD56⁺NK-клеток в периферической крови [7, 14].

В свою очередь, известно, что при дефиците CD46 или его лиганда (C3/C3b) отмечается нарушение Th1-ответа и увеличивается риск рецидивирующих инфекций [6], в то время как нарушения со стороны Т-клеточного ответа отмечаются как входе самого заболевания [7], так и спустя длительные промежутки времени после клинического выздоровления [10].

Работ, определявших экспрессию СD46⁺ на лимфоцитах у пациентов с постковидным синдромом, в доступной литературе обнаружено не было.

Однако полученные фундаментальные знания о панлейкоцитарных маркерах лимфоцитов и их субпопуляций у постковидных пациентов являются крайне востребованными, так как могут позволить разработать новые подходы к лечению и реабилитации больных, в том числе и при иных вирусных (в том числе и сезонных) заболеваниях.

Таким образом, учитывая роль активации системы комплемента при COVID-19, регуляторные свойства CD46 и его потенциальную вовлеченность в процессы проникновения вируса в клетку, мы сочли необходимым изучить параметры иммунной системы, связанные с нарушением уровней CD45⁺ и CD46⁺ на различных субпопуляциях лейкоцитов у постковидных пациентов.

Цель исследования – изучить уровень экспрессии CD45⁺ и CD46⁺ на различных субпопуляциях лимфоцитов у пациентов, перенесших SARS-CoV-2-инфекцию.

Материалы и методы

Было обследовано 72 пациента, перенесших SARS-CoV-2-инфекцию. Критерием включения в группы исследований были: подтвержденный диагноз SARS-CoV-2-инфекции методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), наличие IgA, IgM, IgG к вирусу SARS-CoV-2-инфекции, данные компьютерной томографии о перенесенной пневмонии (варианты: КТ1 – поражение до 25% легких, КТ2 – поражение до 50% легких, КТ3 – поражением до 75% легких, КТ4 – поражение свыше 75% легких). Исследование проводилось не менее чем через 6 месяцев после перенесенной пневмонии вызванной SARS-CoV-2-инфекцией.

Все пациенты были предварительно обследованы врачом терапевтом и иммунологом-аллергологом, для выявления сопутствующих заболеваний. Группы были рандомизированы по полу, возрасту, сопутствующим заболеваниям по критерию χ2. Пациенты были разделены на 2 группы сравнения по гейтированию панлейкоцитарными маркерами: 1. Пациенты с уровнем CD45⁺ больше уровня CD46⁺ на Т-лимфоцитах (n = 52). 2. Пациенты с CD45⁺, равным или меньшим уровня CD46⁺ на Т-лимфоцитах (n = 20). Критерием общие Т-лимфоциты были выбраны в связи с тем, что их повреждение наиболее часто встречается при обследовании как ковидных, так и постковидных пациентов [7, 10]. Все исследования были одобрены Независимым локальным этическим комитетом при ГАУЗ ОТКЗ «Городская клиническая больница № 1» г. Челябинска, протокол № 8 от 11.04.2022, на базе которой проводились данные исследования.

Иммунологические исследования

Общий анализ крови (исследовано 25 параметров: лейкоцитарный, эритроцитарный и тромбоцитарный ростки кроветворения), количественный и качественный состав ростков кроветворения проведен стандартизованным методом на гематологическом анализаторе Medonic M20 (Швеция).

Методом проточной цитометрии CD45⁺и CD46⁺ (панлейкоцитарный маркер для гейтирования лимфоцитов), CD45⁺ и CD46⁺, CD3⁺ (Т-лимфоциты), CD45⁺ и CD46⁺, CD3⁺,CD4⁺ (хелперы индукторы), CD45⁺ и CD46⁺, CD3⁺, CD8⁺ (цитотоксические Т-лимфоциты,), CD45⁺ и CD46⁺, CD3⁺, CD56⁺ (TNK-клетки) CD45⁺ и CD46⁺, CD3^-, CD56⁺ (натуральные киллеры), CD45⁺ и CD46⁺, CD3^-, CD19⁺, CD5⁺ (В-лимфоциты), CD45⁺ и CD46⁺, CD3⁺, CD4⁺, CD25⁺ (активированные хелперы, ранняя активация лимфоцитов), CD45⁺ и CD46⁺, CD3⁺, HLA- DR (активированные Т-лимфоциты – поздняя активация лимфоцитов), Beckman Coulter, BioLegend (США). Оценку иммунного статуса осуществляют методом проточной цитометрии на цитофлюориметре Navios (Beckman Coulter, США) по стандартизованной технологии оценки лимфоцитарного звена иммунитета [1, 2].

Обработка и анализ данных осуществлялись с помощью R 3.1.1 12 (R Foundation for Statistical Computing, Вена, Австрия) и Microsoft Excel версии 14.0. Так как распределение в количественных данных было не нормальным (p-value теста Шапиро–Уилка < 0,05), то использованные статистические критерии были непараметрическими.

Результаты и обсуждение

На первом этапе исследования было выявлено, что при гейтировании лимфоцитов по CD45⁺ по сравнению с CD46⁺ у части пациентов процент Т-лимфоцитов несущих рецептор CD45⁺ был достоверно выше, чем при гейтировании CD46⁺, из 72 пациентов таких было 52 человека (72,2%), у остальных 20 человек процент Т-лимфоцитов несущих рецептор CD45⁺ был равен или несколько ниже, чем при гейтировании CD46⁺ (см. табл. 1). По этому критерию пациенты были разбиты на 2 группы, как это было написано выше.

Как показали наши исследования, снижение экспрессии CD46⁺ на Т-лимфоцитах (CD3⁺) сопровождается, таким же уменьшением его экспрессии на цитотоксических Т-лимфоцитах (CD3⁺, CD8⁺), TNK (CD3⁺, CD56⁺), а также Т-хелперах, несущих маркеры ранней активации (CD3⁺, CD4⁺, CD25⁺). При этом наиболее выраженное снижение отмечалось как среди общих Т-лимфоцитов, так и цитотоксических. У этих больных несколько повышался уровень экспрессии CD46⁺ на В-лимфоцитах. Последние данные говорят об отсутствии вовлечения в нарушении рецептора CD46 на В-лимфоцитах (см. табл. 1).

 

ТАБЛИЦА 1. СРАВНЕНИЕ ПОКАЗАТЕЛЕЙ СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ ПОСТКОВИДНЫХ ПАЦИЕНТОВ ПРИ ГЕЙТИРОВАНИИ ПАНЛЕЙКОЦИТАРНЫМИ МАРКЕРАМИ CD45⁺ И CD46⁺, M±m

TABLE 1. COMPARISON OF INDICES OF LYMPHOCYTE SUBPOPULATIONS IN POST-COVID PATIENTS WHEN GATED WITH CD45⁺ AND CD46⁺ PANLEUKOCYTE MARKERS, M±m

Показатели субпопуляций лимфоцитов Indicators of subpopulations of lymphocytes	Группа 1. Постковидные пациенты с уровнем CD45+ больше уровня CD46+ Group 1. Post-COVID patients with CD45+ level greater than CD46+ level, n = 52	Группа 2. Постковидные пациенты с CD45+, равным или меньшим, чем уровень CD46+ Group 2. Post-COVID patients with CD45+ equal to or less than CD46+, n = 20
T-лимфоциты (CD3+CD19-) отн. (%) T lymphocytes (CD3+CD19-) rel. (%)	68,35±0,69*	74,40±1,01
T-лимфоциты (CD3+CD19-) абс. (109 кл/л) T lymphocytes (CD3+CD19-) abs. (109 cell/L)	1427,46±57,93*	1753,30±112,49
T-цитотоксические (CD3+CD8+) отн. (%) T cytotoxic (CD3+CD8+) rel. (%)	23,32±0,95*	26,31±1,06
T-цитотоксические (CD3+CD8+) абс. (109 кл/л) T cytotoxic (CD3+CD8+) abs. (109 cell/L)	465,96±21,16*	611,90±45,91
ТNK-клетки (CD3+CD16+CD56+) отн. (%) TNK cells (CD3+CD16+CD56+) rel. (%)	6,080±0,385	7,28±0,88
TNK-клетки (CD3+CD16+CD56+) абс. (109 кл/л) TNK cells (CD3+CD16+CD56+) abs. (109 cell/L)	114,62±6,55*	185,30±32,06
B-лимфоциты (CD3-CD19+) отн. (%) B lymphocytes (CD3-CD19+) rel. (%)	10,50±0,36*	9,04±0,68
B-лимфоциты (CD3-CD19+) абс. (109 кл/л) B-lymphocytes (CD3-CD19+) abs. (109 cell/L)	218,00±11,55	194,40±8,76
T-лимфоциты (CD3+CD4+CD25+) (ранняя активация) отн. (%) T lymphocytes (CD3+CD4+CD25+) (early activation) rel. (%)	6,58±0,38	6,700±0,448
T-лимфоциты (CD3+CD4+CD25+) (ранняя активация) абс. (109 кл/л) T lymphocytes (CD3+CD4+CD25+) (early activation) abs. (109 cell/L)	56,27±4,04*	72,10±5,91

Примечание. * – достоверность различий между группами р < 0,05.

Note. *, significance of differences between groups p < 0.05.

 

Как показали наши исследования, более чем у 70% обследованных пациентов с постковидным синдромом выявляется значительное снижение экспрессии CD46⁺ на Т-лимфоцитах. При этом наиболее страдают как общее количество этих клеток, так и клетки, отвечающие за противовирусный иммунитет (Т-цитотоксические и TNK-клетки) и раннюю активацию Т-хелперов. Выявлено, что В-лимфоциты в этой ситуации не страдают, а даже несколько усиливают экспрессию CD46⁺ на мембране клеток. Полученные нами данные говорят о том, что вирус SARS-CoV-2 может воздействовать на рецептор CD46.

Более того, наблюдаемые изменения вполне могут быть вызваны взаимодействием вируса и CD46. Так, согласно литературным данным, CD46 вовлечен в контроль по меньшей мере трех ключевых метаболических событий: обработанный λ-секретазой внутриклеточный домен CYT- 1 CD46 перемещается в ядро, где он индуцирует экспрессию белков-переносчиков (GLUT1, LAT1 и CAT1) и сборку mTORC1. Активация CD46 индуцирует повышенную экспрессию метаболических ферментов, включая синтазы жирных кислот, GAPD; также CD46 увеличивает активацию внутриклеточных пулов C5 с внутриклеточно генерируемым C5a, стимулирующим митохондриальный C5aR1, который управляет продукцией ROS и активацией NLRP3 инфламмасом в CD4⁺T-клетках. Все это лежит в основе повышения гликолиза и увеличения продукции OXPHOS и ROS, необходимых для индукции продукции IFNã и экспрессии гранзима B, и, как следствие, реализации защитных эффекторных ответов Th1 Т-киллеров [5].

Особо стоит отметить, что выявленный комплекс изменений сохраняется у значительного числа переболевших пациентов на протяжении длительного времени, что подчеркивается нарушениями экспрессии этого маркера на различных субпопуляциях Т-лимфоцитов. В целом же, полученные данные подтверждают гипотезу участия рецептора CD46 в патогенезе COVID-19. Более того, такое воздействие приводит к усилению симптомов лонг-ковида (постковидного синдрома) у таких пациентов и требует формирования новых подходов к коррекции этих нарушений.

Выводы

1. У 72,2% постковидных пациентов выявляется значительное снижением экспрессии CD46⁺ на Т-лимфоцитах.
2. Снижение уровня CD46⁺ у постковидных пациентов наблюдается также на Т-цитотоксических и TNK-клетках и Т-хелперах, несущих маркеры «Ранней активации».
3. Снижение экспрессии CD46⁺ на Т-лимфоцитах не сопровождается падением уровня этого маркера на В-лимфоцитах.

Работа выполнена по теме гос. задания «Иммунофизиологические и патофизиологические механизмы регуляции и коррекции функций организма» № гос. регистрации 122020900136-4 и поддержана грантом РФФИ и NSFC, 20-515-55003.

About the authors

M. A. Dobrynina

Institute of Immunology and Physiology, Ural Branch, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: mzurochka@mail.ru

PhD (Medicine), Junior Research Associate, Laboratory of Inflammation Immunology

Russian Federation, Ekaterinburg

A. V. Zurochka

Institute of Immunology and Physiology, Ural Branch, Russian Academy of Sciences; South Ural State University (National Research University)

Email: mzurochka@mail.ru

PhD, MD (Medicine), Professor, Leading Research Associate, Laboratory of Inflammation Immunology; Head, Laboratory of Immune Biotechnology, Russian-Chinese Educational Center

Russian Federation, Ekaterinburg; Chelyabinsk

M. V. Komelkova

Institute of Immunology and Physiology, Ural Branch, Russian Academy of Sciences; South Ural State University (National Research University)

Email: mzurochka@mail.ru

PhD (Biology), Head, Laboratory of Systemic Pathology and Prospective Medical Drugs, Russian-Chinese Educational Center; Senior Research Associate, Laboratory of Immune Physiology and Immunopharmacology

Russian Federation, Ekaterinburg; Chelyabinsk

Sh. Luo

University of Science and Technology

Email: mzurochka@mail.ru

Professor, Institute of Hematology, Union Hospital, Tongji Medical College

China, Wuhan

V. A. Zurochka

Institute of Immunology and Physiology, Ural Branch, Russian Academy of Sciences; South Ural State University (National Research University)

Email: mzurochka@mail.ru

PhD, MD (Medicine), Senior Research Associate, Laboratory of Inflammation Immunology; Senior Research Associate, Laboratory of Immune Biotechnology, Russian-Chinese Educational Center 

Russian Federation, Ekaterinburg; Chelyabinsk

Hu Desheng

University of Science and Technology

Email: mzurochka@mail.ru

Professor, Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Union Hospital, Tongji Medical College

China, Wuhan

L. V. Ryabova

South Ural State Medical University

Email: mzurochka@mail.ru

PhD, MD (Medicine), Professor, Department of Life Security, Emergency Medicine, First Aid and Urgent Care

Russian Federation, Chelyabinsk

A. P. Sarapultsev

Institute of Immunology and Physiology, Ural Branch, Russian Academy of Sciences; South Ural State University (National Research University)

Email: mzurochka@mail.ru

PhD, MD (Biology) Leading Research Associate, Laboratory of Immunopathophysiology; Director, Russian-Chinese Educational Center 

Russian Federation, Ekaterinburg; Chelyabinsk

References

Supplementary files