Studying expression of IL-1β gene under the action of siRNA complexes with anti-influenza effect

Full Text

Введение

Среди респираторных вирусных заболеваний гриппозная инфекция на сегодняшний день не теряет своей актуальности. По оценке ВОЗ, ежегодно регистрируется около 1 миллиарда новых случаев гриппа, до 3-5 миллионов случаев осложнений и до 500 000 смертей во всем мире. Наряду с поражением дыхательной системы, грипп (ВГА, IAV) способен вызывать осложнения в работе ряда таких систем органов, как респираторная, сердечно-сосудистая либо иммунная [9].

Вирус гриппа обладает иммуносупрессивными свойствами, что способно приводить к развитию вторичных иммунодефицитов [8]. Вирусы гриппа имеют в своем составе белок NS-1 (nonstructural protein-1), чьей функцией является дисрегуляция механизмов активации системы интерферонов, что приводит к нарушению образования провоспалительных цитокинов [8].

Наиболее важным участником формирования противовирусного иммунитета является IL- 1β [6]. Данный цитокин играет важную роль в повышении экспрессии генов MCP-1 и MCP-3 и созревании макрофагов и дендритных клеток. Индукция выработки IL-1â происходит вследствие взаимодействия лиганда с Toll-подобными рецепторами 3-го типа [1, 2].

В настоящее время существует большое количество препаратов, направленных на профилактику и терапию гриппозной инфекции. Однако достижение эффективного результата от применения лекарственных средств в ряде случаев является затруднительным ввиду высокой мутационной изменчивости вируса гриппа, что делает его резистентным к данным препаратам [5].

Исходя из этого, особо важным является вопрос разработки и создания эффективных методов борьбы с подобными инфекциями. Потенциально перспективным методом терапии и профилактики вирусных респираторных инфекций может являться подавление активности клеточных генов, участвующих в репродукции вируса, с помощью РНК-интерференции.

РНК-интерференция – это процесс подавления экспрессии гена-мишени под влиянием малых интерферирующих РНК (миРНК, siRNA). Также процесс РНК-интерференции часто используется для подавления вирусной репродукции [4]. Наш подход также предполагает использование клеточных генов FLT4, Nup98, Nup205, подавление экспрессии которых приводит к значительному снижению вирусной репродукции in vitro [7].

Целью настоящего исследования является оценка экспрессии гена IL-1β при трансфекции комплексов миРНК, направленных к клеточным генам FLT4, Nup98, Nup205.

Материалы и методы

Исследование выполнено с использованием научного оборудования центра коллективного пользования «НИИВС им. И.И. Мечникова» – при финансовой поддержке проекта Российской Федерацией в лице Министерства образования и науки России, Соглашение № 075-15-2021-676 от 28.07.2021. Дизайн миРНК осуществляли с помощью программы siDirect2.0. Все олигонуклеотиды синтезированы в «Синтол» (Россия). Подготовка миРНК к работе, а также их последовательности представлены в нашем более раннем исследовании [8]. В качестве неспецифического контроля использовалась миРНК L2, специфичная к гену светляковой люциферазы и не влияющая на жизненный цикл клеток А549. В работе использован вирус гриппа А/WSN/33 (H1N1) (Детский исследовательский госпиталь Святого Джуда, США). Культивирование и определение титра вируса проводилось на культуре клеток MDCK. Заражение культур клеток осуществлялось при множественности инфицирования 0,01. В работе использовались клетки почек кокер-спаниеля MDCK (Институт Пастера, Франция) и клетки аденокарциномы человеческого легкого A549 (ATCC^® CCL-185, США). Клетки MDCK выращивали в среде MEM («ПанЭко», Россия), содержащей 5% эмбриональной сыворотки коров (ЭСК) (Gibco, США), 40 мкг/мл гентамицина («ПанЭко», Россия), и 300 мкг/мл L-глутамина («ПанЭко», Россия) при 37 °С в CO₂-инкубаторе. Клетки А549 выращивали в среде DMEM («ПанЭко», Россия), содержащей 5% ЭСК (Gibco, США), 40 мкг/мл гентамицина («ПанЭко», Россия) и 300 мкг/мл L-глутамина («ПанЭко», Россия) при 37 °С в CO₂-инкубаторе. Для оценки цитотоксичности трансфицируемых комплексов миРНК был использован МТТ-тест. На 1-е, 2-е, 3-е сутки после трансфекции в лунки с клетками 96-луночного планшета добавляли по 20 мкл раствора МТТ с концентрацией 5 мг/мл («ПанЭко», Россия) и инкубировали при 37 °C в атмосфере 5% CO₂ в течение 2 ч. Далее культуральную жидкость отбирали и добавляли в лунки по 100 мкл изопропанола (Sigma-Aldrich, США) в каждую лунку. С помощью планшетного спектрофотометра (Varioscan, Thermo Fisher Scientific, США) определяли оптическую плотность каждой лунки при 530 нм с учетом фоновых значений при 620 нм. Для трансфекции комплексов миРНК, клетки А549 высевали на 24-луночные планшеты в посевной концентрации 1:3. После образования 80% клеточного монослоя, клетки промывались раствором Хенкса («ПанЭко», Россия). Далее смесь Lipofectamin 2000 (Thermo Fisher Scientific, США) и Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific, США) добавляли к раствору миРНК в среде Opti-MEM и инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин. Суммарная концентрация каждого из четырех комплексов миРНК, необходимая для нокдауна генов, составила 20 пмоль/мкл на лунку. Составы комплексов миРНК указаны в таблице 1. После инкубации комплексы добавляли к клеткам. миРНК siL2 была использована в качестве неспецифического контроля. Затем клетки инкубировали при 37 °С в CO₂-инкубаторе. Спустя 4 ч культуральную среду удаляли из всех лунок, кроме отрицательного контроля и добавляли по 0,5 мл вируссодержащей жидкости с множественностью заражения (MOI) 0,01, состоящей из среды DMEM, 0,001% тозилфенилаланилхлорметилкетона (Tosyl phenylalanyl chloromethyl ketone, TPCK) (Sigma-Aldrich, Германия), 40 мкг/ мл гентамицина. После этого клетки вновь помещали в CO₂-инкубатор. В течение трех последующих суток отбирались образцы супернатанта для последующего титрования и клеточный лизат для оценки изменений экспрессии IL-1β методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ). Комплексы миРНК, использованные в исследовании, представлены в таблице 1.

 

ТАБЛИЦА 1. КОМПЛЕКСЫ миРНК, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В РАБОТЕ

TABLE 1. COMPLEX siRNA USED IN THE WORK

Комплекс миРНК Complex siRNA	Процессы вирусной репродукции, на которые влияет комплекс миРНК Virus reproduction processes in which siRNA complexes are found
Nup98 + FLT4	Ядерный импорт вРНК / вирусный эндоцитоз vRNA nuclear import / viral endocytosis
Nup205 + Nup98	Ядерный импорт вРНК vRNA nuclear import
Nup205 + FLT4	Ядерный импорт вРНК / вирусный эндоцитоз vRNA nuclear import / viral endocytosis
FLT4 + Nup205 + Nup98	Ядерный импорт вРНК / вирусный эндоцитоз vRNA nuclear import/viral endocytosis

 

Общую РНК выделяли из клеточного лизата набором ExtractRNA («Евроген», Россия). Для постановки реакции обратной транскрипции применяли набор реагентов «ОТ-1» («Синтол», Россия). Для оценки экспрессии IL-1b использовали ОТ-ПЦР-РВ, а также 2^-∆∆Ct метод. Вирусный титр определялся по крайней точке визуального проявления цитопатического эффекта в культуре клеток MDCK. Клетки MDCK сеяли в 96-луночные планшеты с посевной концентрацией 1 × 10⁴/ см². Через 2 суток питательная среда удалялась из лунок, вносились 10-кратные последовательные разведения вирусного материала в поддерживающей среде без трипсина и инкубировали на протяжении 4 суток в СО₂-инкубаторе при 37 °С. На четвертые сутки проводили визуальный учет результатов титрования под микроскопом на наличие специфического цитопатического эффекта для вируса гриппа (изменение, деформация, открепление мертвых клеток со дна лунки). Статистическую значимость полученных результатов определяли с помощью критерия Манна–Уитни. Разница считалась достоверной при p ≤ 0,01 и p ≤ 0,05. Показатели достоверности рассчитывались с использованием ПО Minitab 2.0 (Minitab, США).

Результаты и обсуждение

С целью определения эффективности противовирусного действия миРНК и снижения вирусной репродукции, на культуре клеток MDCK выполнялось титрование вируссодержащей жидкости на 1-е, 2-е и 3-и сутки с момента трансфекции. Было установлено, что при множественности заражения 0,01 использование всех комплексов миРНК, направленных к клеточным генам, приводит к достоверному снижению вирусной репродукции на первые сутки после заражения. Применение комплексов Nup205 + FLT4 и FLT4 + Nup205 + Nup98 приводило к снижению вирусной репродукции на 1,8 и 2 lg ТЦД₅₀/ мл на первые и на 1,8 и 2,5 lg ТЦД₅₀/мл на вторые сутки (р < 0,05) соответственно по сравнению с неспецифическим и вирусным контролями.

Оценка экспрессии IL-1β проводилась с использованием метода ОТ-ПЦР-РВ и оценочного критерия 2^-∆∆Ct. В таблице 2 показаны результаты оценки экспрессии IL-1β. Было выявлено, что при MOI = 0,01, достоверное повышение экспрессии IL-1β на 28% (Nup98 + FLT4), 58% (Nup205 + Nup98), 62% (Nup205 + FLT4) и 33% (FLT4 + Nup205 + Nup98) наблюдалось относительно неспецифической миРНК L2 на первые сутки (р ≤ 0,05). При трансфекции комплексов А и В также отмечалось достоверное повышение экспрессии IL-1β на вторые и третьи сутки. На вторые сутки рост экспрессии составил 84% для комплекса А и 77% для комплекса В относительно миРНК L2 (р ≤ 0,05). На третьи сутки повышенная экспрессия IL-1β также отмечалась в клетках, трансфицированных комплексами А и В, и составила 90% для комплекса А и 332% для комплекса В относительно миРНК L2.

 

ТАБЛИЦА 2. ДИНАМИКА ЭКСПРЕССИИ ГЕНА IL-1β В ТЕЧЕНИЕ ТРЕХ СУТОК С МОМЕНТА ТРАНСФЕКЦИИ И ЗАРАЖЕНИЯ, % (* – р ≤ 0,05 ОТНОСИТЕЛЬНО НЕСПЕЦИФИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ L2)

TABLE 2. DYNAMICS OF IL-1β GENE EXPRESSION DURING THREE DAYS WITH THE MOMENTS OF TRANSFECTION AND INFECTION, % (*, р ≤ 0.05 RELATIVE TO NON-SPECIFIC CONTROL L2)

Комплекс миРНК Complex siRNA	Сутки Day
	1	2	3
Nup98 + FLT4 / IAV	32±6*	96±9*	112±8*
Nup205 + Nup98 / IAV	62±38*	89±15*	354±69*
Nup205 + FLT4 / IAV	66±50*	20±4	103±86
FLT4 + Nup205 + Nup98 / IAV	37±7*	32±3	56±3
L2 / IAV	4±5	12±6	22±12
IAV	10±7	35±10	18±16
Отриц. контроль Negative control	100±20	105±26	105±26

Примечание. * – данные в таблице приведены в процентном соотношении. За 100 процентов принято экспрессия гена IL-1β в незараженных клетках (отриц. контроль). Расчет достоверности результатов проводился относительно зараженных клеток с неспецифической миРНК L2 (L2/IAV).

Note. *, the data in the table are given as a percentage. The expression of the IL-1β gene in uninfected cells was taken as 100 percent (negative control). The calculation of the reliability of the results was carried out in relation to infected cells with non-specific miRNA L2 (L2/IAV).

 

Настоящая работа является исследованием по изучению экспрессии гена IL-1β как основного провоспалительного цитокина и в качестве одного из критериев эффективности применения миРНК в отношении клеточных генов, принимающих непосредственное участие в репродукции вируса гриппа. IL-1β является основным провоспалительным цитокином. Данный цитокин играет важную роль в повышении экспрессии генов MCP-1 и MCP-3 и созревании макрофагов и дендритных клеток. Это приводит к более выраженной воспалительной реакции и активации эффективной системы презентации антигена [3]. Параллельно с этим, IL-1β обладает и другими иммунологическими функциями: способствует дифференцировке и пролиферации B- и T-лимфоцитов (преимущественно Т-хелперов), повышение продукции белков острой фазы и стимуляция активности клеток эндотелия. Также IL- 1β служит индуктором активации для Т-клеток через систему АПК [3].

В ходе исследования было установлено, что подавление активности клеточных генов FLT4, Nup98 и Nup205, необходимых для вирусной репродукции, приводило к достоверному снижению вирусной активности и росту экспрессии IL-1β. Важно, однако, учитывать, что комплексы миРНК по-разному влияли на экспрессию IL-1β. Можно сделать предположение, что подобный результат обусловлен тем фактом, что каждый комплекс миРНК уникален и имеет собственную нуклеотидную последовательность и способен по-разному взаимодействовать с Toll-подобными рецепторами 3-го типа, поскольку именно они взаимодействуют с двухцепочечной молекулой РНК. Совокупность этих факторов может приводить, по-нашему мнению, к неоднородному росту экспрессии IL-1β.

Заключение

Применение миРНК в качестве лекарственного средства не ограничивается респираторными или иными вирусными инфекциями, но также может находить применение в терапии соматических и наследственных заболеваний, поскольку роль Toll-подобные рецепторы принимают непосредственное участие в развитии многих патологий, в том числе и неинфекционных.

About the authors

E. A. Pashkov

I. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University); I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera

Author for correspondence.
Email: pashckov.j@yandex.ru

Assistant Professor, Department of Microbiology, Virology and Immunology; Junior Research Associate, Laboratory of Molecular Immunology

Russian Federation, Moscow; Moscow

A. V. Pak

I. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: pashckov.j@yandex.ru

Student

Russian Federation, Moscow

N. D. Abramova

I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera

Email: pashckov.j@yandex.ru

Junior Research Associate, Laboratory of Molecular Immunology

Russian Federation, Moscow

I. V. Yakovleva

I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera

Email: pashckov.j@yandex.ru

PhD (Biology), Research Associate, Laboratory of Cell Hybridomas

Russian Federation, Moscow

N. O. Vartanova

I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera

Email: pashckov.j@yandex.ru

PhD (Biology), Senior Research Associate, Laboratory of Microbiology of Opportunistic Bacteria

Russian Federation, Moscow

E. A. Bogdanova

I. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: pashckov.j@yandex.ru

PhD (Medicine), Associate Professor, Department of Microbiology, Virology and Immunology

Russian Federation, Moscow

E. P. Pashkov

I. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: pashckov.j@yandex.ru

PhD, MD (Medicine), Professor, Department of Microbiology, Virology and Immunology

Russian Federation, Moscow

O. A. Svitich

I. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University); I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera

Email: pashckov.j@yandex.ru

PhD, MD (Medicine), Corresponding Member, Russian Academy of Sciences, Director; Professor, Department of Microbiology, Virology and Immunology

Russian Federation, Moscow; Moscow

V. V. Zverev

I. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University); I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera

Email: pashckov.j@yandex.ru

PhD, MD (Biology), Full Member, Russian Academy of Sciences, Scientific Advisor; Professor, Head, Department of Microbiology, Virology and Immunology

Russian Federation, Moscow; Moscow

References

Supplementary files