Experimental in vitro reprogramming of transformed phenotype of neutrophil granulocyte subpopulations in women with chronic recurrent infectious and inflammatory conditions of genital tract

Svetlana V. Kovaleva; Ковалева С. В.; S. N. Pikturno; Пиктурно C. Н.; G. A. Chudilova; Чудилова Г. А.; L. V. Lomtatidze; Ломтатидзе Л. В.; V. A. Krutova; Крутова В. А.; V. V. Malinovskaya; Малиновская В. В.; I. V. Nesterova; Нестерова И. В.

doi:10.46235/1028-7221-1205-EIV

Experimental in vitro reprogramming of transformed phenotype of neutrophil granulocyte subpopulations in women with chronic recurrent infectious and inflammatory conditions of genital tract

Authors: Kovaleva S.V.¹, Pikturno S.N.¹, Chudilova G.A.¹, Lomtatidze L.V.¹, Krutova V.A.¹, Malinovskaya V.V.², Nesterova I.V.¹^,3
Affiliations:
1. Kuban State Medical University
2. N. Gamaleya National Research Center for Epidemiology and Microbiology
3. Peoples’ Friendship University of Russia
Issue: Vol 25, No 4 (2022)
Pages: 445-452
Section: SHORT COMMUNICATIONS
Submitted: 15.07.2022
Accepted: 28.07.2022
Published: 07.10.2022
URL: https://rusimmun.ru/jour/article/view/1205
DOI: https://doi.org/10.46235/1028-7221-1205-EIV
ID: 1205

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Chronic inflammatory diseases of the pelvic organs (CIDPO) in women represent one of the urgent and insufficiently studied problems in gynecology across the world. These disorders are followed by adverse medical and socio-economic consequences, i.e., chronic local inflammatory process, chronic pelvic pain syndrome, ectopic pregnancy, infertility. Due to increasing chronicity and recurrence rates of genital infections and inflammatory diseases, there is a need for further studying the effector and regulatory mechanisms of immune system. Of special relevance are the studies of the receptor transformation in neutrophilic granulocytes (NG), the basic population of antimicrobial defense, with further substantiation of targeted immunomodulatory therapy. Purpose of the present study was to assess transformation of neutrophilic granulocytes from CD11b⁺CD64^-CD32⁺CD16⁺to that CD11b⁺CD64⁺CD32⁺CD16⁺ phenotype in immunocompromised women with CIDPO exacerbation, as well as to evaluate the possibility of in vitro reprogramming the neutrophile phenotype under the action of recombinant interferon (recIFNα2b). Peripheral blood neutrophils were tested in the comparison group of 10 conditionally healthy women 20 to 40 years old, and in 17 women (20-40 years old) with the CIDPO exacerbation (group 1). The in vitro effect of recIFNa2b on the blood neutrophils was evaluated for 17 women with CIDPO (group 2). Flow cytometric technique (FCT, CYTOMICS FC500, Beckman Coulter, USA) was used to determine the number of NGs and cell receptor expression levels of neutrophilic CD11b⁺CD64^-CD32⁺CD16⁺NG and CD11b⁺CD64⁺CD32⁺CD16⁺ subpopulations. In peripheral blood of women with CIDPO exacerbation, an increased expression density of surface membrane molecules was revealed by means of FCT: in the subpopulation CD11b⁺CD64^-CD32⁺CD16⁺NG, CD16 proved to be 91.7% higher; in CD11b⁺CD64⁺CD32⁺CD16⁺NG subpopulation, CD16 was increased by 116%, and CD32 being higher by 81% against the comparison group. In the in vitro system, during the incubation of PB with recIFNα2b (group 2), we have revealed an increased number of CD11b⁺CD64^-CD32⁺CD16⁺ subpopulation relative to the comparison group and group 1, and significantly increased expression density of CD16 (by 212%); CD11b (by 56%), and CD32 (by 83%) than in comparison group, as well as higher density of CD16 expression by 163%; CD11b (by 223%) compared to group 1. The changes in expression density of membrane molecules was also detected by FCT for the activated subpopulation CD11b⁺CD64⁺CD32⁺CD16⁺NG, i.e., an increase in CD16 by 232% against control group, and decreased expression density of CD64 by 150% against the background, along with increased density of CD16 expression (by 54%), and CD11b (by 103%), relative to group 1, thus suggesting a reprogramming of negatively transformed NC phenotype. These findings may be considered a positive immunomodulatory effect providing a basis for further research in order to develop new integrated approaches to treatment of CIDPO of various etiologies.

Keywords

neutrophil granulocytes, phenotype, chronic inflammatory diseases, pelvic organs, recombinant IFNα2b

Full Text

Введение

К хроническим воспалительным заболеваниям органов малого таза (ХВЗОМТ) относят все воспалительные процессы верхнего отдела генитального тракта у женщин (метрит, сальпингит, эндометрит, оофорит). Они могут проявляться в виде отдельных нозологических форм или в различных сочетаниях. Согласно исследованиям последних лет эти заболевания носят полимикробный характер, нередко ассоциированы с условно-патогенными микроорганизмами и вирусами [6]. Принципиальное значение в патогенезе ХВЗОМТ отводится иммунной системе (ИС), от адекватного или дефектного функционирования которой зависят особенности течения и исход заболевания [4]. Обращает на себя внимание тот факт, что, несмотря на оптимизацию методов диагностики и лечения, современные научные исследования свидетельствуют об увеличении количества женщин с хроническими вялотекущими формами воспалительных процессов генитального тракта в амбулаторной практике до 60-65% и в стационарах до 30% [5]. Отмечается увеличение заболеваний с тяжелым и осложненным течением, упорным рецидивированием воспалительного процесса и отсутствием позитивного эффекта на проводимую адекватную этиотропную и патогенетическую терапию, что свидетельствует о присутствии клинических признаков иммунокомпрометированности, совокупность которых подтверждает наличие приобретенной дисрегуляции ИС. Следует подчеркнуть, что именно нарушения функционирования ИС системного и локального характера таких женщин предрасполагают к возникновению нетипично протекающих острых или хронических инфекционно-воспалительных заболеваний репродуктивного тракта, становятся причиной хронизации инфекционно-воспалительных процессов генитальной и экстрагенитальной локализации различной этиологии, которые отличаются резистентностью к общепринятой терапии – противовирусной, антибактериальной, противогрибковой и противовоспалительной [3]. В первую очередь это может быть связано с нарушением функционирования нейтрофильных гранулоцитов (НГ). Известно, что НГ первыми реагируют на вторжение патогенных и преобладание в микробиоме условно-патогенных микроорганизмов, а представители нормальной микрофлоры (лакто- и бифидобактерии) оказывают регулирующее действие на состояние микробиоценоза органов малого таза, стимулируя образование NET [7]. Согласно современным научным данным существует целый ряд субпопуляций НГ с различным фенотипом и, как следствие, различными функциями, как иммуностимулирующими, так и иммуносупрессивными [1].

Противомикробная активность НГ ассоциирована с ведущими поверхностными мембранными рецепторами. СD16 (FcγRIII) – рецептор, отвечающий за цитотоксическое действие, дегрануляцию, кислородный взрыв и пролиферацию [2]. Повышение уровня экспрессии CD16 подтверждает функциональную активность НГ, а его низкий уровень на мембранной поверхности НГ характерен для незрелых НГ [10]. «CD32 (FcγRII) – цитоплазматический иммунорецептор активации тирозина, экспрессия которого приводит в действие NADPH-оксидазный комплекс, опосредует эндоцитоз, стимулирует секреторную активность, цитотоксическое действие и иммуномодулирующую функцию НГ» [11]. «CD11b (Mac-1 или рецептор к компоненту комплемента CR3а) – сигнальный партнер для других рецепторов, регулирует хемотаксис НГ в очаг воспаления, адгезию, фагоцитоз, респираторный взрыв и дегрануляцию. Следствием блокировки CD11b является дефект в активации Fcγ-рецепторов и нарушение фагоцитарной функции НГ» [8]. «CD64 (FcγRI) – рецептор практически, не экспрессируется на мембране НГ периферической крови здоровых лиц, а только на активированных НГ. Повышение экспрессии СD64 на мембране НГ происходит при бактериальной инфекции. Рецепторы CD64 и CD11b являются диагностическими маркерами бактериальной инфекции, тяжести заболевания, продолжительности и исхода воспалительного процесса» [9, 12]. Значимость экспрессии всех этих рецепторов в диагностике различных заболеваний неоднозначна, что требует дополнительных экспериментальных и клинических исследований.

Исходя из вышеизложенного, повышенный интерес представляют субпопуляции НГ с поверхностными мембранными маркерами CD11b, CD64, CD32, CD16, а также возможности их переоснащения под действием иммунотропных субстанций при рецидивирующих ХВЗОМТ у женщин.

Цель исследования – оценить эффект влияния рекомбинантного интерферона IFNα2b (рекIFNα2b) в системе in vitro на негативно трансформированный фенотип субпопуляций нейтрофильных гранулоцитов CD11b⁺CD64^-CD32⁺CD16⁺, CD11b⁺CD64⁺CD32⁺CD16⁺ у иммунокомпрометированных женщин в период обострения ХВЗОМТ.

Материалы и методы

Исследование проводилось в три этапа.

Первый этап – исследовали НГ в образцах периферической крови (ПК) 17 женщин от 20 до 40 лет в период обострения ХВЗОМТ различной этиологии (бактериальной, вирусной, грибковой или их ассоциаций) с клиническими признаками иммунокомпрометированности – длительность анамнеза заболевания более 5 лет, частые обострения (3 и более раз в год) или вялотекущее затяжное течение обострений, отсутствие выраженного клинического эффекта на фоне системной и местной противовоспалительной терапии. Из них 7 женщин наблюдались с диагнозом первичное бесплодие с применением в анамнезе в комплексном лечении программ вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), завершившихся неоднократными неудачами экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) (группа 1).

На втором этапе исследованы образцы ПК 10 условно здоровых женщин репродуктивного возраста от 20-40 лет (группа сравнения), обратившихся в клинику с целью выбора метода контрацепции.

Третий этап – в системе in vitro оценивали влияние рекIFNα2b на НГ ПК женщин в период обострения ХВЗОМТ (группа 2) – инкубировали НГ ПК с рекIFNα2b в конечной концентрации 50 МЕ/мкл при температуре 37 °С в течение 60 минут.

Во всех 3 группах определяли процентное содержание субпопуляций НГ (%НГ), одномоментно несущих CD11b, CD64, CD16, CD32 рецепторы, и плотность экспрессии данных рецепторов по MFI методом проточной цитометрии (CYTOMICS FC500, США) с применением соответствующих моноклональных антител. Для статистической обработка полученных данных использовались пакеты программ Microsoft Exel 2016, StatPlus 2010 и непараметрические тесты – критерии Вилкоксона и Манна–Уитни. Результаты выражали в виде медианы (верхний и нижний квартиль) – Me (Q_0,25-Q_0,75). Статистически значимыми различия принимали при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

При оценке результатов исследования показано, что в образцах ПК группы сравнения (условно здоровые женщины) субпопуляция CD11b⁺CD64^-CD32⁺CD16⁺НГ представлена в 96,60 (94,85-97,51) %, а субпопуляция CD11b⁺CD64⁺CD32⁺CD16⁺НГ в 0,30 (0,12-0,95) % и при этом плотность экспрессии мембранных молекул была вариабельной.

При сравнении относительного содержания субпопуляций НГ CD11b⁺CD64^-CD32⁺CD16⁺НГ и CD11b⁺CD64⁺CD32⁺CD16⁺НГ не выявлено значимых изменений в группе 1 и группе сравнения. Однако, выявлены статистически значимые различия в фенотипе данных субпопуляций, в частности увеличение плотности экспрессии поверхностных мембранных молекул по MFI: СD16 на 91,7% в «сторожевой» субпопуляции CD11b⁺CD64^-CD32⁺CD16⁺НГ, СD16 на 116% и СD32 на 81% в активированной субпопуляции CD11b⁺CD64⁺CD32⁺CD16⁺НГ (р_1-3 < 0,05) (табл. 1).

ТАБЛИЦА 1. ИЗМЕНЕНИЕ СУБПОПУЛЯЦИЙ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ И ПЛОТНОСТИ ЭКСПРЕССИИ ПОВЕРХНОСТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ СD64, CD16, CD32, CD11b У УСЛОВНО ЗДОРОВЫХ ЖЕНЩИН, ЖЕНЩИН В ПЕРИОД ОБОСТРЕНИЯ ХВЗОМТ И ПОД ВЛИЯНИЕМ рекIFNα2b В ЭКСПЕРИМЕНТЕ IN VITRO В ПЕРИОД ОБОСТРЕНИЯ ХВЗОМТ, Me (Q_0,25-Q_0,75)

TABLE 1. CHANGES IN NEUTROPHIL GRANULOCYTE SUBPOPULATIONS AND THE EXPRESSION DENSITY OF CD64, CD16, CD32, CD11b SURFACE RECEPTORS IN CONDITIONALLY HEALTHY WOMEN, WOMEN DURING THE PERIOD OF EXACERBATION OF CIDPO AND UNDER THE INFLUENCE OF recIFNα2b IN AN IN VITRO EXPERIMENT DURING THE PERIOD OF EXACERBATION OF CIDPO, Me (Q_0.25-Q_0.75)

Показатель Indicator	Группа сравнения – ПК условно здоровых женщин Comparison group – PBs of conditionally healthy women	Группа 1 – ПК женщин в период обострения ХВЗОМТ Group 1 – PB of women in the period of exacerbation of CIDPO	Группа 2 – ПК женщин в период обострения ХВЗОМТ + рекIFNá2b Group 2 – PB of women in the period of exacerbation of CIDPO + recIFNá2b
CD11b⁺СD64^-СD32⁺СD16⁺
%НГ %NG	96,60 (94,85-97,51)	94,8 (92,39-95,86)	99,10 (98,00-99,43)* ^
MFI CD16	47,00 (35,60-58,10)	90,1 (77,82-116,75)*	147,00 (139,00-162,00)* ^
MFI СD32	3,44 (2,59-4,29)	4,68 (4,13-6,12)	6,31 (5,05-9,48)*
MFI CD11b	48,60 (33,42-56,02)	23,4 (19,52-28,97)	75,70 (57,15-80,20)* ^
CD11b⁺СD64⁺СD32⁺CD16⁺
%НГ %NG	0,30 (0,12-0,95)	0,95 (0,75-2,06)	0,87 (0,50-1,93)
MFI CD64	6,47 (3,80-10,60)	8,9 (6,60-17,62)	3,48 (3,24-5,90)^
MFI CD16	46,30 (40,30-69,00)	99,7 (88,47-127,00)*	154,00 (137,00-176,00)* ^
MFI СD32	8,71 (4,65-11,45)	15,8 (12,60-21,17)*	13,90 (11,25-17,70)
MFI CD11b	33,70 (27,50-56,70)	34,15 (20,95-48,52)	69,60 (55,95-90,27)^

Примечание. * – достоверность различий показателей от значений группы сравнения, р < 0,05; ^ – достоверность различий показателей по отношению к группе 1 р < 0,05.

Note. *, the reliability of differences in indicators from the values of the comparison group, p < 0.05; ^, the reliability of differences in indicators in relation to group 1 p < 0.05.

При анализе результатов влияния рекIFNα2b в ПК в системе in vitro на содержание и мембранную экспрессию рецепторов субпопуляций НГ CD11b⁺CD64^-CD32⁺CD16⁺ и CD11b⁺CD64⁺CD32⁺CD16⁺ также наблюдается увеличение ряда показателей. Статистически значимое увеличение количества НГ «сторожевой» субпопуляции CD11b⁺CD64^-CD32⁺CD16⁺НГ на 2% и 4% соответственно по сравнению с их уровнем в группе сравнения и в группе 1 (р_1-2 < 0,05). Также установлено изменение фенотипических характеристик субпопуляции CD11b⁺CD64^-CD32⁺CD16⁺НГ: увеличилась плотность экспрессии CD16 на 212%, CD11b на 56% и CD32 на 83% относительно группы сравнения и увеличилась плотность экспрессии CD16 на 163%, CD11b на 223% относительно группы 1 (р_1-5 < 0,05). В активационной субпопуляции CD11b⁺CD64⁺CD32⁺CD16⁺НГ также прослеживается изменение плотности экспрессии мембранных молекул по MFI: статистически значимое увеличение CD16 на 232% относительно группы сравнения и снижение плотности экспрессии CD64 на 150% на фоне увеличения плотности экспрессии CD16 на 54% и CD11b на 103% относительно группы 1.

Заключение

На основании вышеизложенного у им- мунокомпрометированных женщин с период обострения ХВЗОМТ выявлены варианты негативной перестройки фенотипа субпопуляций НГ как сторожевой и преобладающей CD11b⁺CD64^-CD32⁺CD16⁺ НГ, так и минорной CD11b⁺CD64⁺CD32⁺CD16⁺НГ. Фенотипический профиль субпопуляции CD11b⁺CD64^-CD32⁺CD16⁺НГ характеризуется усилением экспрессии CD16, что говорит о ее активации. Увеличение плотности экспрессии CD16, CD32 прослеживается и в субпопуляции CD11b⁺CD64⁺CD32⁺CD16⁺НГ, что также свидетельствует о ее активации. При этом уровень CD64 в минорной субпопуляции статистически значимо не увеличивался, что не способствует полноценному осуществлению эффекторных функций НГ и может быть причиной поддержания хронического воспалительного процесса и отсутствия позитивного эффекта от проведенной этиопатогенетической терапии.

Перепрограммирование трансформированного фенотипа субпопуляций НГ под влиянием рекIFNα2b в эксперименте in vitro связано с изменением субпопуляционного состава НГ и приростом «сторожевой» субпопуляции CD11b⁺CD64^-CD32⁺CD16⁺ НГ, значительным изменением плотности экспрессии рецепторов, ответственных за эффекторные функции НГ, – CD16, СD32, CD11b, в сторону их увеличения, а также снижением плотности экспрессии СD64 – маркера остроты и тяжести бактериального процесса [10], что указывает на позитивный иммуномодулирующий эффект и является основой для создания новых комплексных подходов к лечению ХВЗОМТ у женщин.

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и администрации Краснодарского края в рамках научного проекта № 19-415-230001 р_а.