Differences in the skin microbiota spectrum and parameters of local immunity in the areas of inflammation in skin diseases and healthy people

Full Text

Введение

В последнее время большое внимание в патогенезе различных заболеваний уделяется микробиоте. Исследования, проводимые в разных областях, показали, что микробиота активно влияет на гомеостаз барьерных тканей и участвует в воспалительных реакциях иммунитета. Микробиота в различных сайтах барьерных тканей сильно варьирует. Так, на здоровой коже преобладает четыре типа: Actinobacteria (51,8%), Firmicutes (24,4%), Proteobacteria (16,5%) и Bacteroidetes (6,3%). Наиболее распространенными родами являются Corynebacterium spp. (22,8% от Actinobacteria), Propionibacterium spp. (23,0% от Actinobacteria) и Staphilococcus spp. (16,8% от Firmicutes) [1].

Нарушение состава нормальной микробиоты является триггерным, а иногда и этиологическим фактором развития некоторых хронических заболеваний кожи. Например, псориаз – это хроническое иммуноассоциированное воспалительное заболевание кожи мультифакториальной природы. Показано, что нарушения в составе кожной микробиоты выступают в качестве основного триггера, запускающего развитие заболевания [2]. Распознавание микрофлоры с помощью Toll-подобных рецепторов кератиноцитами и иммунокомпетентными клетками врожденного иммунитета приводит к продукции антимикробных пептидов, таких как LL37, β-дефенсин и S100A7, а также хемокинов и ростовых факторов [3, 4]. Эти механизмы в норме позволяют противостоять патогенам, но из-за сбоя в регуляции механизмов врожденного и адаптивного иммунитета, защитные механизмы превращаются в аутоагрессивные [5]. LL37, связываясь с ДНК из разрушенных кератиноцитов, стимулирует плазмоцитоидные дендритные клетки к синтезу интерферонов I типа, которые запускают созревание классических дендритных клеток. Те, в свою очередь, презентируют аутоантигены Т-лимфоцитам, которые дифференцируются в аутоагрессивные эффекторы Th1-, Th17- и Th22-типов, реализующие аутоиммунное воспаление в псориатической бляшке. Этим сложным процессом дирижирует система цитокинов. На данный момент считается доказанным, что цитокиновая ось интерлейкинов (IL)-23/IL-17/IL-22 является ведущей в иммунопатогенезе псориаза. Эти цитокины, а также вовлеченные в процесс IFNγ, IL-21 и TNF вызывают активную пролиферацию кератиноцитов, привлекают новые провоспалительные клетки в зону псориатической бляшки, что приводит к утолщению эпидермиса и гиперкератозу, которые и формируют клинические симптомы – красные, зудящие, возвышающиеся над кожей бляшки, покрытые серебристыми чешуйками. Указанные цитокины формируют петлю обратной положительной связи, поддерживающую хроническое воспаление в псориатической бляшке [6].

Другим заболеванием кожи, напрямую связанным с нарушением микробиоты является экзема. Она относится к группе аллергодерматозов и является хроническим рецидивирующим заболеванием, характеризующимся полиморфизмом высыпаний [7]. Нарушение микробиоты с преобладанием S. aureus и C. albicans является триггером, запускающим воспаление, но затем эти микроорганизмы часто превращаются из антигена в аллерген в результате сенсибилизации и становятся этиологическим фактором экземы [8].

Целью работы было исследование различий в спектре микробиоты кожи и параметров локального иммунитета в капиллярной крови, взятой рядом с очагом воспаления у больных с аутоиммунным (псориаз) и аллергическим (экзема) заболеванием по сравнению с параметрами здоровых людей.

Материалы и методы

В рамках простого сравнительного исследования были обследованы 24 больных (19 мужчин и 5 женщин) с клинически подтвержденным диагнозом ладонно-подошвенный или обыкновенный псориаз с локализацией высыпаний на коже кистей рук легкой и средней степени тяжести – группа 1. Средний возраст пациентов составил 44,85 лет. Для оценки степени тяжести использовали индекс PASI (Psoriasis Area and Severity Index), среднее значение которого составило 11,1±0,44 и дерматологический индекс шкалы симптомов (ДИШС), составивший 21,5±0,53. В группу 2 вошли 20 больных (14 мужчин, 6 женщин), средний возраст пациентов составил 49,4 года с диагнозом хроническая экзема кожи ладонно-тыльной поверхности кистей рук острой стадии заболевания. Индекс тяжести EASI (Eczema Area and Severity Index) составил 3,21±0,9 балла, а ДИШС – 20,05±0,82. Критерием включения в группы пациентов было отсутствие использования топических средств в течение 1 месяца. Контрольную группу 3 составили 20 здоровых взрослых (15 мужчин и 5 женщин), средний возраст 46,6 года. Исследование было одобрено локальным этическим комитетом ФБУН МНИИЭМ им Г.Н. Габричевского (протокол № 52 от 29.01.2020), обследованные подписывали информированное согласие.

У всех вошедших в исследование людей был взят биологический материал: с площади 1 см² мазок стерильным сухим тампоном с очагов воспаления на коже кистей рук у пациентов или мазок с кожи кистей рук у здоровых обследуемых в транспортную систему Amies с активированным углем (Himedia, Индия). Также произведено взятие капиллярной крови из пальца руки у здоровых или рядом с очагом воспаления у пациентов в 2 микроветы по 200 мкл (Microvette 200 K3 EDTA).

Для исследования микрофлоры проводили посев исследуемого материала методом истощающего штриха на 5% кровяной агар с дефибрированной бараньей кровью (Blood Agar Base, Himedia, Индия), маннитно-солевой агар (Himedia, Индия), HiChrome UTI Agar (Himedia, Индия). Для выделения чистой культуры грибов использовался 1,5% декстрозный агар Сабуро (Himedia, Индия). Для выделения анаэробных микроорганизмов использовали агар Шедлера (Himedia, Индия). Посевы инкубировали в термостате в течение 18-24 часов в аэробных и анаэробных условиях. Видовую идентификацию микроорганизмов проводили с использованием микроскопии окрашенных по Граму препаратов чистых культур, дифференциально-диагностических питательных сред и биохимических тест систем. Видовую идентификацию также проводили на микробиологическом анализаторе BactoSCREEN (НПФ «Литех», Россия).

Иммунофенотипирование 19 субпопуляций лимфоцитов и 3 субпопуляций моноцитов проводили путем четырехцветного окрашивания цельной капиллярной крови с лизированием эритроцитов и оценкой субпопуляций на проточном цитометре BD FacsCantoII, программа сбора и обработки информации FACSDiva (BD, США). Использовали следующие маркеры: CD16-FITC, CD14-PE, CD45PerCP, CD3- FITC, CD16/56- PE, CD4-PerCP, CD8- APC, CD45RA- FITC, CD45R0- PE, CD161-APC, CD25- FITC, CD127-PE, CD249-APC, CXCR5- APC, CD27- FITC, CD1d-PE, CD5-PerCP, CD19-APC (BD Biosciences, США). Цитокины в плазме крови (IL-1β, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, IL-17F, IL- 21, IL-22, IL-23, IL-25, IL-31, IL-33, IFNγ, TNF, sCD40L) определяли мультиплексным методом (MagPix, Bio Rad, США). Полученные результаты подвергли статистическим методам обработки. Уровень р < 0,05 считали значимым.

Результаты и обсуждение

Результаты исследования спектра микробиоты представлены в таблице 1. У больных псориазом было выделено 56 штаммов микроорганизмов. При этом преобладала кокковая флора: Staphylococcus spp. – 50,0% и Micrococcus spp. – 23,2%. Выявлен широкий видовой спектр коагулазотрицательных стафилококков, представленных такими видами как: S. Epidermidis – 12,37%, S. Haemolyticus – 7,25%, S. Hominis – 12,35%, S. Capitis – 5,52%, а S. aureus – только 3,17%, тогда как в группе здоровых – лишь 36,96% были отнесены к Staphilococcus spp., при этом выделялись в основном S. Epidermidis – 15,4% и другие коагулазотрицательные стафилококки. Известно, что S. epidermidis поддерживает гомеостаз кожи и препятствует росту условно патогенного S. aureus [11]. Почти в 2 раза чаще в группе 1 встречались Micrococcus spp., и, напротив, в 2 раза реже Bacillus spp. и Corynebacterium spp., чем в группе 3. Похожие результаты были получены группой H.W. Chang, изменения в микробиоте у больных псориазом индуцировали ответ Th17 [12]. Более того, у больных псориазом вообще не были обнаружены Lactobacillus spp., Candida spp., Brachybacterium spp., Kocuria spp., Neisseria spp. и Rothia spp., составившие в группе здорового контроля 23,91% от состава микробиоты. В то же время, в группе больных псориазом были обнаружены отсутствовавшие в группе здорового контроля Moraxella spp., Actinomyces spp., Cryptococcus spp., Paenibacillus spp. и Pseudomonas spp., составившие 10,73% от состава микробиоты. В группе больных экземой было выделено 36 штаммов микроорганизмов. Доминировала кокковая флора, представленная Staphylococcus spp. – 55,5% и Micrococcus spp. – 17,7%, S. aureus – 12,6%, что превышало уровень не только здоровых, но и больных псориазом. В группе коагулазоторицательных стафилококков преобладал S. epidermidis – 27,8%, в единичных случаях выявлялись S. haemolyticus, S. hominis и S. warneri. Bacillus spp. и Corynebacterium spp. были снижены по сравнению с группой 3. У отдельных пациентов выявлялись такие условно-патогенные микроорганизмы как B. cereus, Moraxella osloensis, Propionibacterium acnes, Pseudomonas monteilii.

 

ТАБЛИЦА 1. СПЕКТР МИКРОБИОТЫ КОЖИ РУК ИЗ ОЧАГА ВОСПАЛЕНИЯ У ДЕРМАТОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ И ЗДОРОВЫХ ЛЮДЕЙ

TABLE 1. SPECTRUM OF THE HANDS SKIN MICROBIOTA FROM THE FOCUS OF INFLAMMATION IN DERMATOLOGICAL PATIENTS AND HEALTHY PEOPLE

	Группа 1 Group 1	Группа 2 Group 2	Группа 3 Group 3
Staphilococcus spp.	50%	55,55%	36,96%
Micrococcus spp.	23,21%	16,67%	13,04%
Acinetobacter spp.	3,57%	0%	4,35%
Bacillus spp.	3,57%	2,78%	8,70%
Corynebacterium spp.	3,57%	5,55%	8,70%
Enterobacterales	3,57%	0%	2,17%
Moraxella spp.	3,57%	2,78%	0%
Actinomyces spp.	1,79%	0%	0%
Cryptococcus spp.	1,79%	0%	0%
Paenibacillus spp.	1,79%	0%	0%
Pseudomonas spp.	1,79%	2,78%	0%
Streptococcus spp.	1,78%	0%	2,17%
Lactobacillus spp.	0%	0%	8,70%
Candida spp.	0%	0%	6,52%
Brachybacterium spp.	0%	0%	2,18%
Kocuria spp.	0%	0%	2,17%
Neisseria spp.	0%	0%	2,17%
Rothia spp.	0%	5,55%	2,17%
Massilia spp.	0%	2,78%	0%
Microbacterium spp.	0%	2,78%	0%
Propionibacterium spp.	0%	2,78%	0%

 

В капиллярной крови были оценены 22 субпопуляции мононуклеаров, однако для 9 субпопуляций значимых различий с группой здорового контроля не выявлено. Сопоставление параметров клеточного иммунитета значимо различающихся у больных с псориазом и экземой и здоровых людей представлены в таблице 2. Для некоторых субпопуляций значимые различия с группой здоровых были выявлены в обеих группах больных. Так, обнаружено значимое увеличение субпопуляций лимфоцитов CD45RA⁺/CD45RO⁺, CD25⁺CD127⁺CD4⁺ (активированные хелперы), CD25⁺CD127^-CD4⁺ (Treg), CD3⁺CD16/56⁺ (NKT). Первые 2 субпопуляции – это Т-лимфоциты, активно вовлеченные в процесс воспаления. Повышение Treg в обеих группах больных свидетельствует о попытках иммунной системы затормозить воспалительный процесс. В то же время наблюдалось значимое повышение уровней субпопуляций CD19⁺ (В-клетки), CD5⁺CD19⁺ (В1-клетки), CD1d⁺CD5⁺CD19⁺ (Breg) и значимое снижение субпопуляции CD27⁺CD19⁺ (В-клетки памяти) только в группе больных псориазом, а в группе больных экземой уровень этих субпопуляций не отличался от группы здорового контроля. Для группы больных экземой, но не для больных псориазом было характерно значимое увеличение уровней субпопуляций CD4⁺CD294⁺ (Th2) и CD45R0⁺CD4⁺CD161⁺ (Th17), что свидетельствует о вовлечении этих субпопуляций в патогенез экземы. Для моноцитов в обеих группах больных обнаружено значимое повышение уровней субпопуляции CD14^loCD16^hi (M2) и значимое снижение уровней CD14⁺CD16^int (M-промежуточные). А в группе больных псориазом еще и значимое снижение моноцитов М1 (CD14^hiCD16^-).

 

ТАБЛИЦА 2. ПАРАМЕТРЫ КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА КАПИЛЛЯРНОЙ КРОВИ ДЕРМАТОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ В СРАВНЕНИИ СО ЗДОРОВЫМИ (M±SE, %)

TABLE 2. PARAMETERS OF CELLULAR IMMUNITY IN CAPILLARY BLOOD OF DERMATOLOGICAL PATIENTS COMPARED WITH HEALTHY ONES (M±SE, %)

	Группа 1 Group 1	Группа 2 Group 2	Группа 3 Group 3
CD45RA+/CD45RO+	14,17±0,93*	15,77±0,96*	8,06±0,73
CD4+CD294+	1,28±0,11	3,88±0,18*	1,68±0,19
CD25+CD127+CD4+	11,45±1,03*	10,04±1,01*	7,93±0,64
CD25+CD127-CD4+	9,29±0,58*	7,57±0,47*	5,91±0,36
CD45R0+CD4+CD161+	15,66±1,47	22,35±1,84*	13,17±1,16
CD19+	14,69±1,16*	9,50±0,79	9,73±0,76
CD5+CD19+	21,68±2,13*	13,54±0,97	13,33±1,07
CD1d+CD5+CD19+	9,85±0,81*	7,21±0,69	6,29±0,53
CD27+CD19+	15,79±1,17*	17,69±1,46	20,60±1,48
CD3+CD16/56+	3,90±0,28*	6,91±0,43*	1,13±0,08
CD14hiCD16-	80,67±1,73*	83,03±2,27	86,09±2,56
CD14loCD16hi	8,15±0,66*	7,96±0,57*	4,88±0,30
CD14+CD16int	6,96±0,45*	5,85±0,42*	8,95±0,55

Примечание. * p < 0,05 по сравнению с соответствующим параметром группы здоровых людей.

Note. * p < 0.05 compared with the corresponding parameter of a group of healthy people.

 

Результаты сопоставления цитокинового профиля капиллярной крови больных псориазом, экземой и здоровых людей представлены в таблице 3. Из 15 исследованных цитокинов в группе больных псориазом не отличались от группы здорового контроля только концентрации IL-10 и IL-31. Все остальные цитокины значимо превышали соответствующие показатели группы 3. В группе больных экземой не отличались от параметров группы 3 только IFNγ и sCD40L, тогда как остальные 13 цитокинов значимо превышали контрольные уровни. Эти особенности в профилях цитокинов, видимо, отражают тонкие механизмы иммунопатогенеза исследованных заболеваний. Помимо общей для них воспалительной реакции и повышения провоспалительных цитокинов, таких как IL-1, IL-6, IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-22, IL-23 и TNF, отмечается также повышение цитокинов, секретируемых поврежденными кератиноцитами (IL-25 и IL-33), сигнализирующими о своем повреждении триггерными факторами. Выявляются также некоторые особенности. Так, для аутоиммунного (псориаз) заболевания типичным оказалось отсутствие подъема уровня IL-10 при увеличении количества Treg и Breg, его синтезирующего, что говорит о дефекте регуляторного звена при псориазе [10]. Тогда как при аллергическом заболевании (экзема) увеличение уровня Treg сопровождалось повышенной продукцией IL-10. Более того, для больных с экземой типичным было отсутствие повышения концентрации IFNγ, так как это цитокин Th1-хелперов, а аллергическое воспаление развивается по Th2- или Th17-типу, чьи цитокины были значимо повышены в этой группе больных. Так, уровень IL-4 в группе больных с экземой превышал уровень контрольной группы в 6,8 раза. Интересно, что у них, но не у больных псориазом, также был повышен уровень IL-31, который отвечает за чувство зуда у аллергических больных, тогда как у больных псориазом за это ощущение отвечает IL-33 [9].

 

ТАБЛИЦА 3. КОНЦЕНТРАЦИЯ ЦИТОКИНОВ (ПГ/МЛ) В ПЛАЗМЕ КАПИЛЛЯРНОЙ КРОВИ ДЕРМАТОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ И ЗДОРОВЫХ ЛЮДЕЙ

TABLE 3. CONCENTRATION OF CYTOKINES (PG/ML) IN CAPILLARY BLOOD PLASMA OF DERMATOLOGICAL PATIENTS AND HEALTHY PEOPLE

	Группа 1 Group 1	Группа 2 Group 2	Группа 3 Group 3
IL-1	57,34±4,57*	47,31±3,15*	1,89±0,27
IL-4	15,40±1,31*	17,21±1,43*	2,53±0,31
IL-6	7,44±0,63*	8,15±0,77*	4,13±0,49
IL-10	3,67±0,47	6,73±0,56*	4,24±0,53
IL-17A	5,50±0,44*	8,84±0,63*	1,36±0,17
IL-17F	23,48±2,14*	21,93±2,09*	12,53±1,53
IL-21	55,68±4,23*	49,31±4,94*	7,99±1,11
IL-22	13,19±1,11*	12,63±1,21*	4,52±0,46
IL-23	26,71±2,12*	28,22±2,33*	6,86±0,89
IL-25	4,68±0,38*	5,17±0,42*	1,77±0,23
IL-31	519,40±48,47	697,43±49,12*	571,10±41,78
IL-33	44,19±4,22*	43,76±3,88*	19,22±2,11
IFNγ	16,54±1,39*	11,72±1,47	11,60±1,28
TNF	10,35±0,98*	9,78±0,89*	2,12±0,29
sCD40L	806,89±77,78*	350,64±31,48	340,34±32,13

Примечание. См. примечание к таблице 2.

Note. As for Table 2.

 

Заключение

Таким образом, удалось показать, что спектр микрофлоры кожи рук обследованных контрольной группы был более разнообразным по видовому составу – 38,4%, микроорганизмов, представителей нормальной микрофлоры, не выявлялись у пациентов с псориазом и экземой. У пациентов с псориазом и экземой наблюдалось доминирование кокковой флоры, и выявлен сдвиг спектра микробиоты в сторону условно патогенных микроорганизмов, таких как Acinetobacter spp., Enterobacteriales spp., Moraxella spp., Pseudomonas spp. При этом дисбиоз кожи у больных сопровождается активацией Т- и В-клеток, продукцией провоспалительных цитокинов, цитокинов оси IL-23/IL-17/IL-22 и цитокинов – маркеров повреждения клеток эпителия (IL-25 и IL-33), а также недостаточностью противовоспалительных факторов (отсутствие повышения концентрации IL-10, несмотря на повышенный уровень Treg и Breg). Выявлены различия в изменениях параметров локального иммунного статуса у больных с аутоиммунным (псориаз) и аллергическим (экзема) заболеваниями, отражающие особенности иммунопатогенеза этих заболеваний.

About the authors

S. V. Sennikova

G. Gabrichevsky Research Institute for Epidemiology and Microbiology

Email: drsennikova@mail.ru

Postgraduate Student, Laboratory of Cytokines, G. Gabrichevsky Research Institute for Epidemiology and Microbiology

Russian Federation, Moscow

Anna P. Toptygina

G. Gabrichevsky Research Institute for Epidemiology and Microbiology; Lomonosov Moscow State University

Author for correspondence.
Email: toptyginaanna@rambler.ru

PhD, MD (Medicine), Professor, Chief Research Associate, Head of Laboratory of Cytokines, G. Gabrichevsky Research Institute for Epidemiology and Microbiology; Professor, Department of Immunology, Faculty of Biology, Lomonosov Moscow State University

Russian Federation, Moscow; Moscow

E. A. Voropaeva

G. Gabrichevsky Research Institute for Epidemiology and Microbiology; N. Pirogov Russian National Research Medical University

Email: voropaeva@gabrich.ru

PhD, MD (Biology), Chief Research Associate, Head of the Medical Biotechnology Department, G. Gabrichevsky Research Institute for Epidemiology and Microbiology; Professor, Department of Microbiology and Virology, Faculty of Biology, N. Pirogov Russian National Research Medical University

Russian Federation, Moscow; Moscow

References

Supplementary files