Сytokines as non-hormonal regulators in the pathogenesis of endocrinopathies

Full Text

Введение

Цитокины регулируют активность гормональной оси «гипоталамус – гипофиз – надпочечники», воздействуя на гипоталамус, усиливают синтез либеринов, повышает выработку гормонов гипофиза, в том числе и тиреотропина (ТТГ) [8]. ТТГ, в свою очередь, влияет непосредственно на тиреоциты щитовидной железы и иммуноциты, так как рецепторы к нему имеются практически на всех клетках иммунной системы. Отношения между гипоталамо-гипофизарно-щитовидной осью и ожирением также сложны и включают различные гормонально-цитокиновые взаимодействия [12].

О взаимосвязи иммунных и эндокринных нарушений при патологии щитовидной железы (ЩЖ), ожирении и других эндокринопатиях свидетельствуют данные о том, что избыток цитокинов и гормонов жировой ткани может инициировать липотоксичность и воспалительный процесс в ЩЖ и других железах внутренней секреции, а лептин играет роль в канцерогенезе ЩЖ, стимулируя рост и инвазию опухолевых клеток [14], изменение секреции адипокинов и цитокинов при абдоминальном ожирении значимо влияет на функцию ЩЖ [1, 12]. Гормоны щитовидной железы (ТГ) и ТТГ, в свою очередь, влияют на массу и функцию жировой ткани в организме человека [5, 12]. В адипоцитах, экспрессирующих рецептор ТТГ, тиреотропин стимулирует секрецию не только лептина, но и IL-6, TNFα, моноцитарный хемоаттрактантный белок-1 (МСР-1), что может играть негативную роль при синдроме поликистозных яичников в сочетании с тиреоидной патологией и ожирением [7, 14]. Более того, исследования in vivo и in vitro показали, что высвобождение IL-6 из дифференцированных адипоцитов активируется ТТГ, а значительно повышенные концентрации IL-6, CRP, MCP-1 были обнаружены у субъектов с субклиническим гипотиреозом, более высокие концентрации ТТГ и IL-6 были зафиксированы при метаболическом синдроме [8, 9, 11].

Значение хронического латентного асептического воспаления при синдроме поликистозных яичников (СПКЯ) неоднократно обсуждалось в основе морфофункциональных нарушений фертильности при данной эндокринопатии [4, 7, 10]. Висцеральное ожирение, сопровождающее СПКЯ в 38-88% случаев [7, 10], и избыток андрогенов стимулируют интенсивную дифференцировку преадипоцитов в адипоциты, способствуя дальнейшему прогрессированию ожирения [3, 4]. В исследовании 2021 года при СПКЯ была выявлена прямая связь между повышенным уровнем СРБ, IL-18, TNFα, IL-6 и ферритином [4]. В научных трудах, посвященных изучению роли IL-6 как промоутера СРБ в печени, опубликованные результаты остаются неоднозначными, часть авторов приходит к выводам о незначительном значении IL-6 в патогенезе СПКЯ [4, 7]. Однако на животных моделях СПКЯ выявлено резкое увеличение уровней IL-6 и IL-1β в крови животных на фоне гиперандрогении, запускающее каскад реакций, приводящих к пироптозной гибели гранулезных клеток яичника, фолликулярной дисфункции и фиброзу интерстициальных клеток яичника [13], что весьма актуализирует изучение системной продукции цитокинов при СПКЯ.

Целью работы явилось изучение роли цитокинов во взаимосвязи с гормонами в патогенезе аутоиммунных и неаутоиммунных эндокринопатий – аутоиммунного тиреоидита, болезни Грейвса, узлового и многоузлового зоба, синдрома поликистозных яичников.

Материалы и методы

Исследование проводилось с 2019 по 2023 гг. на базе Приморской краевой клинической больницы № 1 и № 2; клиник г. Владивостока. Всего обследовано: 101 пациент с болезнью Грейвса и 105 пациентов с АИТ, 110 пациенток с СПКЯ; 51 пациент с узловым и многоузловым эутиреоидным зобом; 50 здоровых лиц составили контрольную группу; средний возраст составил (34,5±2,9 года). Все участники исследования были сопоставимы по возрасту, полу, без острых и хронических заболеваний, не курящие, не употребляющие каких-либо лекарственные препараты и алкоголь, не беременные, не имели сахарного диабета и другой хронической патологии. Все пациенты и здоровые лица дали письменное согласие на участие в исследовании, которое выполнялось с учетом требований Хельсинкской декларации Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2000 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Министерства РФ от 19.06.2003 г. № 266. Проведение исследование одобрено Междисциплинарным этическим комитетом ФГБОУ ВО ТГМУ Минздрава России (протокол № 4, 2019 г. и № 9, 2022 г.). Принцип формирования групп – параллельный, открытый, стратифицированный.

У пациентов с БГ и АИТ, узловыми образованиями ЩЖ исследовали тиреоидные гормоны, ТТГ, антитела к рецептору ТТГ и антитела к тиреопероксидазе, кальцитонин. Пациентки с СПКЯ были разделены на 2 группы: I – женщины с ожирением (ИМТ 30,75±0,18 кг/м²), II – с СПКЯ и нормальным ИМТ 23,2±0,3 кг/м², всем исследовали половые и гонадотропные гормоны, ТТГ. Всем пациентам исследовали цитокины в сыворотке крови и при СПКЯ, изучали содержание цитокинов в фолликулярной жидкости (ФЖ) и культуральной среде – методом ИФА с иммунохемилюминисцентной и электрохемилюминисцентной детекцией. Генетическое исследование проводилось методом ПЦР лаборатория BGG, ультрасонография ЩЖ и трансвагинальное исследование органов малого таза на аппарате LOGIQ S8 датчиком 10 МГц. Метод клеточных культур с ежедневным наблюдением за клетками при помощи инвертированного микроскопа CKX41 (Olympus, Япония), оснащенного системой фазового контраста. Съемку проводили камерой AxioCam5 (Carl Zeiss, Германия) с помощью лицензионного программного обеспечения Zen 2, Blue Edition (Carl Zeiss).

Результаты и обсуждение

Показатели содержания в крови ЛГ, прогестерона, андростендиона и IL-6, IL-10, IFNγ, TNFα, маркеры ожирения (ИМТ, ОТ) при СПКЯ представлены в таблице 1. Была выявлена умеренной силы прямая связь между степенью ожирения (ИМТ), наличием висцерального жира (OТ) и содержанием IL-6 в крови (r_имт = 0,6; r_от = 0,5; p < 0,05) и зафиксирована положительная умеренной силы корреляция между ИМТ и содержанием TNFα в крови (r < 0,5; p < 0,05) при СПКЯ с ожирением. Наиболее значимым из провоспалительных цитокинов при СПКЯ в нашем исследовании получился IL-6 и TNFα (табл. 1, 2). Кроме того, зафиксирована прямая умеренной силы связь между показателем ЛГ и IL-6 (r = 0,5; p < 0,05) при СПКЯ с абдоминальным ожирением, что, на наш взгляд, связано с прогрессированием асептического воспаления яичников и во многом объясняет дисбаланс в синтезе эстрогенов и прогестинов [7]. Были выявлены и другие корреляции, подтверждающие связь СПКЯ и латентного воспаления, прогрессирующие на фоне ожирения [7, 10].

 

ТАБЛИЦА 1. ПОКАЗАТЕЛИ СЫВОРОТОЧНОГО УРОВНЯ ГОРМОНОВ, ЦИТОКИНОВ, МАРКЕРОВ ОЖИРЕНИЯ ПРИ СПКЯ И ГРУППЫ КОНТРОЛЯ

TABLE 1. INDICATORS OF SERUM LEVELS OF HORMONES, CYTOKINES, MARKERS OF OBESITY IN PCOS AND CONTROL GROUPS

Наименование показателя Name of the indicator	I группа Group I n = 60	II группа Group II n = 50	Контрольная группа Control group n = 50	Значение p Value p
ИМТ (кг/м2) BMI (kg/m2)	30,75±0,18	23,2±0,3	22,9±0,2	pI < 0,05; pII < 0,05
ОТ (см) WC (cm)	102,8±0,7	86,7±0,4	78,6±0,5	pI < 0,05; pII < 0,05
Прогестерон (нг/мл) Progesterone (ng/mL)	6,34±0,34	6,20±1,01	25,6±2,3	pI = 0,05; pII > 0,05
Андростендион (нг/мл) Androstenedione (ng/mL)	6,16±0,21	6,51±0,16	2,20±0,12	pI > 0,05; pII < 0,05
ЛГ (мМЕ/л) LH (mIU/L)	17,41±0,81	18,04±0,74	4,75±0,20	pI = 0,05; pII < 0,05
IL-6 (нг/мл) IL-6 (ng/mL)	11,10±0,29	8,65±0,31	0,93±0,13	pI < 0,05; pII < 0,05
IFNγ (нг/мл) IFNγ (ng/mL)	2,26±0,11	1,71±0,09	3,70±0,19	pI < 0,05; pII > 0,05
TNFα (нг/мл) TNFα (ng/mL)	6,00±0,29	3,22±0,21	2,55±0,13	pI < 0,05; pII < 0,05
IL-10 (нг/мл) IL-10 (ng/mL)	10,00±0,27	8,12±0,22	4,41±0,18	pI < 0,05; pII < 0,05

Примечание. p_{I, II} – статистическая значимость различий (ρ < 0,05 по t-критерию Стьюдента) между показателями у женщин при СПКЯ и у здоровых лиц.

Note. p_{I, II}, statistical significance of differences (p < 0.05 according to Student’s t-test) between indicators in women with PCOS and in healthy individuals.

 

ТАБЛИЦА 2. ПОКАЗАТЕЛИ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА IL-6 rs1800795 У ПАЦИЕНТОК С СПКЯ И ГРУППОЙ КОНТРОЛЯ

TABLE 2. INDICATORS OF IL-6 GENE POLYMORPHISM rs1800795 IN PATIENTS WITH PCOS AND THE CONTROL GROUP

IL-6 rs1800795	I группа Group I n = 60	II группа Group II n = 50	Контрольная группа Control group n = 50	Значение p Value p
G/G	15 (25%)	12 (24%)	11 (22%)	pI < 0,05; pII < 0,05
C/G	35 (58%)	24 (48%)	20 (40%)	pI < 0,05; pII < 0,05
C/C	10 (17%)	14 (28%)	19 (38%)	pI > 0,05; pII < 0,05

Примечание. См. примечание к таблице 1.

Note. As for Table 1.

 

Проведение экспериментальной части исследования на культуре кумулюсных клеток (КК) яичника было необходимо для исключения воздействия коморбидности гинекологических заболеваний с СПКЯ. IL-6 в фолликулярной жидкости при СПКЯ значительно превышал (16,6±0,4 нг/мл, против 6,61±0,3 нг/мл; p < 0,05) показатель здоровых лиц, что также дополнительно свидетельствует об органном инфламационном его генезе. В культуральной среде КК больных СПКЯ исходно также зафиксирован значимо высокий уровень IL-6 (20,4±0,52 нг/ мл против 6,34±0,3 нг/мл в контроле; p < 0,05), который на 7-е сутки увеличился (до 45,6±0,423 нг/ мл), но становился достоверно ниже, чем в культуре здоровых КК (187,53±0,65 нг/мл; p < 0,05), в которой исходно было достоверно меньше цитокина, что говорит об активационном истощении клеток кумулюса яичников при СПКЯ.

При СПКЯ в крови выявлено резкое снижение баланса IFNγ/IL-10 до 0,226 против 1,2 у здоровых женщин. Такой же феномен выявлялся в культуре кумулюсных клеток пациенток с СПКЯ, там зафиксировано значимое снижение баланса IFNγ/IL-10 до 0,27 против 2,38 у здоровых клеток, что достоверно свидетельствует о дисфункции иммунной системы при СПКЯ и сниженном ее провоспалительном резерве.

У здоровых женщин в 100% случаев возникла беременность после ЭКО, а у пациенток с СПКЯ в 40% случаев при уровне IL-6 ≥ 15,0 нг/ мл в ФЖ – беременность не наступила, у 20% пациенток при IL-6 ≥ 12,0 нг/мл в ФЖ – беременность прервалась на малых сроках, при IL-6 менее 8,0 нг/мл беременность завершилась родами у всех женщин (40% пациенток с СПКЯ), что, конечно, характеризует цитокин как один из важнейших иммунологических маркеров фертильности при СПКЯ.

Выявлено, кроме того, превалирование гетерозиготного носительства C/G rs1800795 в обеих группах с СПКЯ (табл. 2); в сочетании с ожирением наличие гена ухудшает течение заболевания, способствуя гиперпродукции IL-6 [2, 3]. Гомозиготное патологическое носительство G/G rs1800795 встречается чаще у пациенток с СПКЯ, чем в контроле (p < 0,05). Гомозиготное носительство С/С rs1800795 является протективным [2, 3] и достаточно веско аргументирует за включение указанных генетических маркеров при подготовке пациенток с СПКЯ к проведению ЭКО, а при повторных и ранее неудачных попытках ЭКО рекомендуем исследовать их как важные прогностические предикторы фертильности и, в дальнейшем, для решения вопроса о применении таргетной иммунотерапии СПКЯ.

В нашем исследовании было также доказано, что значимые изменения в содержании тиреоидных гормонов при БГ и ТТГ при АИТ влияют на гиперпродукцию про- и противовоспалительных цитокинов (табл. 3). Прямые или обратные сильные и умеренные связи обнаружены между показателями цитокинов и гормонов в период активной гиперпродукции ТГ при болезни Грейвса (БГ) и ТТГ при аутоиммунном гипотиреозе (АИТ). В дальнейшем, по мере коррекции гормональных нарушений, данные связи ослабевали или вообще не фиксировались, что указывает с одной стороны на значимое участие избыточной активации иммунной системы при аутоиммунной патологии ЩЖ (рис. 1), но с другой стороны, на первичное приоритетное нарушение в синтезе ТГ или ТТГ. Динамическое развитие аутоиммунного заболевания во многом, как известно, зависит от генетически обусловленных механизмов иммунорегуляции активационных процессов [1, 9].

 

ТАБЛИЦА 3. КОНЦЕНТРАЦИЯ СЫВОРОТОЧНЫХ ЦИТОКИНОВ У ЗДОРОВЫХ ЛИЦ И ПРИ АУТОИММУННЫХ ТИРЕОПАТИЯХ ДО КОРРЕКЦИИ ТИРЕОИДНОЙ ДИСФУНКЦИИ, М±m

TABLE 3. CONCENTRATION OF SERUM CYTOKINES IN HEALTHY INDIVIDUALS AND IN AUTOIMMUNE THYROID DISORDERS BEFORE CORRECTION OF THYROID DYSFUNCTION, М±m

Наименование показателя, пг/мл Name of the indicator, pg/mL	Контингент Contingent
	Контрольная группа Control group n = 50	Пациенты с БГ Patients with GD n = 101	Пациенты с АИТ Patients with AITD n = 105
IL-1α	1,61±0,05	21,18±4,26**	27,58±6,99**
IL-1β	1,37±0,18	5,12±1,50**	3,21±0,29*
IL-6	0,93±0,13	8,59±2,70**	10,17±2,37**
IL-10	10,39±0,30	69,15±7,31*** #	39,14±9,72*
IFNγ	12,35±0,88	72,39±6,58**	74,74±23,20**
TNFα	5,30±1,29	23,79±4,71**	42,49±10,27** #
IL-17	10,13±2,19	35,73±5,17**	24,92±2,65**

Примечание. * – статистическая значимость различий (p < 0,05 по t-критерию Стьюдента) между показателями при АИЗЩЖ и у здоровых лиц; ** – p < 0,01; *** – p < 0,001 по t-критерию Стьюдента; ^# – (p < 0,05 по t-критерию Стьюдента) статистическая значимость различий в показателях цитокинов у пациентов с БГ и при АИТ.

Note. *, statistical significance of differences (p < 0.05 according to Student’s t-test) between indicators in AITD and in healthy individuals; **, p < 0.01; ***, p < 0.001 according to Student’s t-test; ^#, (p < 0.05 according to Student’s t-test) statistical significance of differences in cytokine levels in patients with GD and AITD.

 

Рисунок 1. Соотношение Th1/Th2-маркерных цитокинов в норме и при аутоиммунных заболеваниях ЩЖ (аутоиммунный тиреоидит, болезнь Грейвса)

Figure 1. Ratio of Th1/Th2 marker cytokines in normal conditions and in autoimmune diseases of the thyroid gland (autoimmune thyroiditis, Graves’ disease)

 

Как при БГ, так и при гипотиреозе на фоне АИТ были значимо повышены цитокины: IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-10, IL-17, IFNγ и TNFα (табл. 3). Кардинальные отличия между двумя аутоиммунными тиреопатиями, как известно, наблюдаются в уровне ТТГ и тиреоидных гормонов. Концентрации IL-6 и IL-17 в сыворотке крови прямо коррелировали (r = 0,75; p < 0,05) с клиническим исходом БГ. Кроме того, при БГ была обнаружена прямая умеренной силы связь между объемом ЩЖ по данным ультрасонографии и системным уровнем IFNγ (r = 0,56; р = 0,029) и IL-1α была также умеренная прямая связь (r = 0,61; p < 0,05), что может дополнительно указывать на гиперпродукцию цитокинов непосредственно активированными тиреоцитами (табл. 3) [15]. Такие данные существуют, но на сегодняшний день они не имеют четкой интерпретации и практического применения в плане патогенетической иммунотерапии тиреотоксикоза.

IL-1β совместно с IL-6 участвуют в дифференцировке Treg в Th17-клетки. При АИТ баланс Treg/Th17-маркерных цитокинов был достоверно нарушен, что позволяет рекомендовать исследовать IL-1β в комплексе с ТГ, цитокинами (TNFα, IL-6) и тиреоидными аутоантителами для идентификации популяции активированных иммуноцитов на каждой стадии аутоиммунного воспаления. Содержание IL-6 у пациентов с АИТ и БГ в 10-8 раз превышало значения контроля и коррелировало с тяжестью течения тиреопатий. При БГ и АИТ абсолютные показатели цитокина и его удельный вес практически не отличались, что делает цитокин универсальным маркером при эндокринопатиях, учитывая данные нашего исследования при СПКЯ.

Пациенты с узловым и многоузловым эутиреоидным зобом, верифицированные с помощью тонкоигольной аспирационной биопсии как доброкачественный процесс, согласно классификации Bethesda II категория являлись группой сравнения, они имели нормальные показатели ТТГ, ТГ, кальцитонина, не отличавшиеся от контроля (p > 0,05). Значимо высоким оказался у этой когорты эутиреоидных пациентов только уровень IFNγ, который двукратно превышал значения контрольной группы (27,25±2,86 против 12,35±0,88 пг/мл, p < 0,01), но был значимо ниже показателей в группах с аутоиммунным тиреотоксикозом и гипотиреозом (p < 0,01; табл. 3). Показатели IL-10, TNFα, IL-17 в сыворотке крови при эутиреоидной патологии ЩЖ были сравнимы с группой контроля, в отличие от содержания данных цитокинов при аутоиммунных тиреопатиях (табл. 3).

Доля TNFα при АИТ превышала контрольные значения в 2,7 раза.

При АИТ зафиксирован значимый дисбаланс в соотношении IFNγ/IL-10 – индекс возрастал в полтора раза (1,9 против 1,2) по сравнению с группой контроля; и отличался от БГ, где показатель, наоборот, незначительно снижался до 1,04 (рис. 1). В группе сравнения (узловые тиреопатии) зафиксировано повышение соотношения IFNγ/IL-10 до 1,4; но не настолько значимое, как при АИТ. Учитывая, что IFNγ обладает противовирусными, иммунорегуляторными и противоопухолевыми свойствами, влияет на транскрипцию около 30 генов, вызывая различные клеточные реакции, его повышение в крови при узловых эутиреоидных тиреопатиях в абсолютных значениях и долевом соотношении цитокинов, сравнимом с аутоиммунными тиреопатиями, позволяет сделать предположение о ведущей роли IFNγ развитии и прогрессировании патологии щитовидной железы.

Кроме того, установленный дисбаланс в продукции ключевых иммунорегуляторных цитокинов может являться перспективной мишенью для лечения и рационального дизайна терапии в случаях осложненного тиреотоксикоза или гипотиреоза, когда необходимо применять большие дозы тиамазола, глюкокортикостероидных или тиреоидных гормональных препаратов.

Заключение

Выявленное нарушение баланса про- и противовоспалительных цитокинов при СПКЯ в сочетании с ожирением и наличием гена C/G rs1800795 резко ухудшает течение заболевания, способствуя гиперпродукции IL-6. Полиморфизм гена IL-6 C/G rs1800795 на фоне ожирения позволяет рекомендовать оба маркера для исследования у женщин с неудачными попытками ЭКО, как важный предиктор фертильности и возможная перспектива в применении таргетной иммунотерапии СПКЯ.

Значимое увеличение и существенный дисбаланс в соотношение Th1/Th2-маркерных цитокинов при аутоиммунных заболеваниях ЩЖ позволил охарактеризовать систему клеточного реагирования при аутоиммунных тиреопатиях как высоко активную и прямо сопряженную с тиреоидной дисфункцией, выполняющую свою эффекторную функцию на фоне нарушенных иммунорегуляторных механизмов. Учитывая, что в «цитокиновой сети» действует принцип избыточности, а взаимодействие и взаимосвязь цитокинов и гормонов проявляется как на уровне их синтеза, так и при реализации ими своих функций, можно утверждать об определяющем, многофакторном и разнонаправленном влиянии цитокинов на течение патологического процесса при аутоиммунных тиреопатиях и синдроме поликистозных яичников. Учитывая наши данные, цитокины и их рецепторы могут служить перспективной мишенью для таргетной иммунотерапии при изученных эндокринопатиях.

About the authors

Olga V. Valikova

Pacific State Medical University; Regional Clinical Hospital No. 2, Vladivostok; Cliniсs for Diabetes and Endocrine Diseases, Vladivostok

Email: renalex.99@mail.ru

Junior Research Associate, Pacific State Medical University; Clinical Endocrinologist, Regional Clinical Hospital No. 2; Clinical Endocrinologist, Cliniсs for Diabetes and Endocrine Diseases

Russian Federation, Vladivostok; Vladivostok; Vladivostok

V. V. Zdor

Pacific State Medical University; Cliniсs for Diabetes and Endocrine Diseases, Vladivostok

Email: renalex.99@mail.ru

PhD, MD (Medicine), Leading Research Associate, Central Research Laboratory, Pacific State Medical University; Clinical Endocrinologist, Cliniсs for Diabetes and Endocrine Diseases

Russian Federation, Vladivostok; Vladivostok

V. A. Sarychev

Pacific State Medical University; Clinical Hospital “RZhD-Medicine”

Author for correspondence.
Email: renalex.99@mail.ru

Postgraduate Student, Department of Normal and Pathological Physiology, Pacific State Medical University; Surgeon, Clinical Hospital “RZhD-Medicine”

Russian Federation, Vladivostok; Vladivostok

Ya. N. Tikhonov

Pacific State Medical University

Email: renalex.99@mail.ru

Senior Lecturer, Department of Pathological Anatomy, Pacific State Medical University

Russian Federation, Vladivostok

Andrey V. Boroda

A. Zhirmunsky National Scientific Center of Marine Biology, Far East Branch, Russian Academy of Sciences

Email: renalex.99@mail.ru

PhD (Biology), Senior Research Associate, Deputy Director for Research, A. Zhirmunsky National Scientific Center of Marine Biology, Far East Branch, Russian Academy of Sciences

Russian Federation, Vladivostok

References

Supplementary files