In vitro immunomodulatory effect of siRNA complexes in the influenza infection

Full Text

Введение

Грипп – высококонтагиозная вирусная инфекция, связанная с ежегодными вспышками и эпидемиями, протекающими, как правило в осенне-зимний период. Ежегодно регистрируется ~ 1,2 млрд случаев гриппозной инфекции, до 5 млн случаев тяжелого течения заболевания и до 650 000 смертей от гриппа и его осложнений [1]. Высокие показатели заболеваемости и смертности обусловлены тем, что вирусы гриппа обладают белками, обеспечивающими им наличие иммуномодулирующих свойств.

Среди подобных белков наиболее изученным является NS-1. Одной из его основных функций является нарушение функционирования интерферон-опосредованных механизмов защиты организма, из-за чего снижается выработка ряда компонентов гуморального иммунитета, что приводит к недостаточности иммунного ответа. При этом важнейшими участниками противогриппозного иммунитета являются цитокины IFNα, IFNγ, TNFα и IL-10, чья активность также может быть снижена под воздействием белка NS-1 [8].

IFNα и TNFα играют важную роль на ранних стадиях вирусной инфекции. Было показано, что TNFα обладает противовирусной активностью в эпителиальных клетках легких [4]. IFNα, в свою очередь, индуцирует продукцию IFNγ в NK- и Т-клетках и стимулирует их цитотоксическую способность [7, 9]. IL-10 является основным противовоспалительным цитокином, чьей функцией является регуляция и предотвращение избыточной воспалительной реакции, которая может [6].

В настоящее время существует широкий ряд препаратов, применяющихся для противогриппозной терапии, однако достижение полного терапевтического эффекта от применения этих лекарственных средств представляется затруднительным из-за появления новых резистентных форм вируса гриппа [6].

Одной из перспективных технологий для преодоления данной проблемы является создание специфических антивирусных препаратов основана на механизме РНК-интерференции [1].

РНК-интерференция – процесс нарушения экспресии целевого гена с помощью молекулы малой интерферирующей РНК (миРНК, siRNA).

Исходя из вышесказанного, целью настоящего исследования является оценка динамики количественная оценка концентрации цитокинов IFNα, IFNγ, TNFα и IL-10 в результате комплексного подавления активности клеточных генов FLT4, Nup98 и Nup205, чьи продукты экспрессии играют важную роль в репродукции вируса гриппа.

Материалы и методы

Подбор миРНК, олигонуклеотидов, комплексы миРНК, использованные в работе, методика трансфекции клеток миРНК с последующим заражением, использованные в работе, методика титрования вируса по конечной точке цитопатического действия представлены в нашем более раннем исследовании [1].

В работе использован вирус гриппа А/WSN/33 (H1N1) (St. Jude’s Children’s Research Hospital, США). Культивирование и определение титра вируса проводилось на культуре клеток MDCK. Для заражения использовали множественность инфицирования (мн.з., MOI), равную 0,1; 0,01 и 0,001 ед. В работе использовались клетки почек кокер-спаниеля MDCK (Institut Pasteur, Франция) и клетки аденокарциномы человеческого легкого A549 (ATCC, США). Клетки MDCK выращивали в среде MEM («ПанЭко», Россия), содержащей 5% эмбриональной сыворотки коров (ЭСК) Gibco (Fisher Scientific, Новая Зеландия), 40 мкг/мл гентамицина («ПанЭко», Россия), и 300 мкг/мл L-глутамина («ПанЭко», Россия) при 37 °С в CO₂-инкубаторе. Клетки А549 выращивали в среде DMEM («ПанЭко», Россия), содержащей 5% ЭСК, 40 мкг/мл гентамицина и 300 мкг/ мл L-глутамина при 37 °С в CO₂-инкубаторе.

Для оценки динамики концентрации IFNα, IFNγ, TNFα и IL-10 в течение трех суток с момента трансфекции и заражения проводился отбор надосадочной жидкости. Измерение уровня указанных цитокинов выполнялось посредством иммуноферментного анализа с использованием ИФА-набора ELISA (АО «Вектор-Бест», Россия) согласно инструкции производителя. После проведения процедуры протокола в течение 10 последующих минут планшет с образцами помещали в ИФА-ридер ELX800 (BIO-TEK INSTRUMENTS INC., США) для получения первичных данных – значений длин волн (в диапазоне 450-620 нм).

Статистическую значимость полученных результатов определяли с помощью критерия Манна–Уитни. Разница считалась достоверной при уровне статистической значимости 0,01 ≤ p ≤ 0,05. Показатели достоверности рассчитывались с использованием ПО Minitab.

Результаты и обсуждение

Было установлено, что наиболее эффективное повышение концентрации IFNα наблюдалось при трансфекции комплексов А и Б при MOI 0,01. При трансфекции комплекса А, концентрация IFNα нарастала ко вторым суткам и составляла 6,5 пг/мл, а на третьи сутки увеличивалась до 7,1 пг/мл. При трансфекции комплекса Б рост концентрации IFNα наблюдался на третьи сутки и составлял 6,2 пг/мл. При использовании MOI 0,001 рост концентрации IFNα наблюдался на третьи сутки при использовании комплексов В и Г и составлял 7 пг/мл в обоих случаях. Наряду с этим, к третьим суткам также был отмечен рост концентрации IFNα при использовании комплекса А, который составил 5,8 пг/мл. При MOI 0,1 рост концентрации IFNα не наблюдался.

При оценке изменения концентрации IFNγ в течение трех суток с момента трансфекции были получены следующие результаты. При MOI 0,1 на вторые сутки наблюдался рост концентрации IFNγ во всех образцах, вне зависимости от их обработки комплексами миРНК. Концентрация IFNγ для вирусного и неспецифического контролей и комплекса Г в данном случае составила 3,5, 5,4 и 5,4 пг/мл соответственно. В случае применения комплексов А, Б и В, концентрация IFNγ ко вторым суткам составила 4, 4,7 и 4,7 пг/ мл соответственно. К третьим суткам отмечалось полное снижение концентрации IFNγ в образцах с комплексом Г, а также с вирусным и неспецифическим контролями. В свою очередь, концентрация IFNγ в клетках А549, обработанных комплексами А, Б и В снижалась незначительно и составляла 3,9, 2,8 и 3,2 (р ≤ 0,05).

На рисунке 1 (см. 2-ю стр. обложки) отображена динамика концентрации IFNγ при MOI 0,01 в течение трех суток с момента трансфекции. Было установлено, что достоверное повышение концентрации IFNγ по отношению к контрольным группам отмечалось на вторые и третьи сутки при использовании комплекса А и составляло 3,5 и 2,7 пг/мл соответственно.

 

Рисунок 1. Влияние комплексов миРНК, направленных к генам FLT4, Nup98 и Nup205, на изменение концентрации IL-10 при множественности заражения = 0,01 (* – р ≤ 0,05)

Figure 1. Effect of siRNA complexes directed to the FLT4, Nup98 and Nup205 genes on the change in IL-10 concentration with a multiplicity of infection = 0.01 (*, p ≤ 0.05)

 

При использовании MOI 0,001 рост концентрации IFNγ отмечался во всех образцах в течение трех суток с момента трансфекции. При этом не наблюдалось достоверной разницы между контрольными образцами и образцами, обработанными комплексами миРНК.

При оценке динамики уровня IL-10 в отобранных образцах, получены следующие результаты. При MOI 0,1 было установлено, что рост концентрации IL-10 к третьим суткам в тех группах образцов, которые были обработаны комплексами А и Б, составил 4,6 и 2,9 пг/мл соответственно (р ≤ 0,05). На рисунке 1 (см. 2-ю стр. обложки) показано, что при использовании MOI 0,01, начиная со вторых суток, наблюдался достоверный рост концентрации IL-10 для всех образцов, обработанных комплексами миРНК относительно контрольных групп. На третьи сутки концентрация IL-10 при использовании комплекса А составила 1,5 пг/мл, для комплекса Б – 2,6 пг/ мл, для комплексов В и Г – 3,2 и 3 пг/мл соответственно (р ≤ 0,05). Аналогичный результат отмечался и при MOI 0,001. Достоверный рост концентрации IL-10 по отношению к контрольным группам наблюдался при трансфекции всех комплексов миРНК, начиная со вторых суток с момента трансфекции. Концентрация IL-10 на третьи сутки в случае использования комплекса А составила 0,29 пг/мл, для комплекса Б – 1,7 пг/ мл, для комплекса В – 2,5 пг/мл, для комплекса Г – 1 пг/ мл (р ≤ 0,05). Полученные данные представлены на рисунке 2 (см. 2-ю стр. обложки).

 

Рисунок 2. Влияние комплексов миРНК, направленных к генам FLT4, Nup98 и Nup205, на изменение концентрации IL-10 при множественности заражения = 0,01 (* – р ≤ 0,05)

Figure 2. Effect of siRNA complexes directed to the FLT4, Nup98 and Nup205 genes on the change in IL-10 concentration with a multiplicity of infection = 0.01 (*, p ≤ 0.05)

 

При оценке изменения концентрации TNFα были получены следующие результаты. При MOI 0,1 было установлено, что достоверное повышение концентрации TNFα относительно контрольных групп наблюдалось на вторые сутки после трансфекции комплексов А и Г и составило 8 и 10 пг/мл. При MOI 0,01 достоверное повышение концентрации TNFα отмечалось на третьи сутки аналогично при использовании комплексов А и В и составило 19,6 и 20 пг/мл соответственно. При использовании MOI 0,001 достоверного изменения концентрации TNFα по отношению к контрольным группам не наблюдалось.

Настоящая работа является исследованием, посвященным оценке влияния комплексного снижения экспрессии генов FLT4, Nup98 и Nup205 на изменение концентрации IFNα, IFNγ, TNFα и IL-10. Для оценки эффективности динамики уровня концентрации указанных цитокинов применялся метод иммуноферментного анализа. Было показано, что применение комплексов миРНК приводит к повышению концентрации IFNα, IFNγ, TNFα и IL-10. Важно отметить, что продукция IL-10 отсутствует в первые сутки после заражения, однако начинает увеличиваться на вторые и третьи сутки. Параллельно с этим, в некоторых случаях наблюдается повышение концентрации IFNα и IFNγ на первые сутки после заражения, однако к третьим суткам наблюдается снижение их концентрации. Это свидетельствует о том, что на фоне применения комплексов миРНК под воздействием IL-10 происходит нормализация цитокинового профиля.

Полученные результаты также свидетельствуют о том, что указанные комплексы миРНК являются лигандами для Toll-подобных рецепторов 3-го типа (TLR). Распознавание молекулярных паттернов вируса гриппа А посредством TLR стимулирует активацию фактора регуляции интерферона 3-го и 7-го типа (IRF3/7) посредством фосфорилирования С-конца IRF3/7 и его димеризации [3]. Активация IRF3 и IRF7 индуцирует выработку TNFα, который во время инфекции запускает каскад реакций, направленных на стимуляцию высвобождения IL-1 и IL-6, а также координирует свои действия с другими иммунными регуляторами, такими как IL-2, IL-8 и, в особенности, IFNα [2, 4]. IFNγ может активировать образование IFN-индуцированного трансмембранного белка 3 (IFITM3), ингибирующего проникновение вирусного рибонуклеопротеина в клетку из эндосомы, путем блокировки слияния вирусной оболочки с эндосомальной мембраной [2]. На более поздних стадиях инфекции, вызванной вирусом гриппа А, обнаруживается IL-10, который обеспечивает защиту от цитокинового шторма, блокируя продукцию цитокинов и снижая активность МНС класса II [5, 10]. Исходя из этого, функция выбранных нами цитокинов является предельно важной для иммунного ответа организма на инфекцию вируса гриппа А. Важно учитывать, что наличие белка NS-1 у вируса гриппа обуславливает нарушение активности механизмов врожденного иммунитета, включающих и те, которые рассматриваются в настоящем исследовании [6]. Применение миРНК, направленных на клеточные гены FLT4, Nup98 и Nup205, нарушает цикл вирусной репродукции и, как следствие, вызывает дисфункцию белка NS- 1. На фоне этого наблюдается активация и последующая выработка IFNα, IFNγ, TNFα и IL-10.

Заключение

Здесь мы показываем, что при использовании миРНК наблюдается увеличение концентрации исследуемых цитокинов. Это свидетельствует о том, что препараты миРНК способны обладать не только противовирусным эффектом, но также и иммуностимулирующим, посредством их взаимодействия с TLR.

Благодарности

Авторы выражают благодарность центру коллективного пользования НИИВС им. И.И. Мечникова. Исследование выполнено с использованием научного оборудования центра коллективного пользования «НИИВС им. И.И. Мечникова» – при финансовой поддержке проекта Российской Федерацией в лице Министерства образования и науки России, Соглашение № 075-15-2021-676 от 28.07.2021.

About the authors

Evgeny A. Pashkov

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera; I. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Author for correspondence.
Email: pashckov.j@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5682-4581

Junior Research Associate, Laboratory of Molecular Immunology, I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera; Assistant Professor, Department of Microbiology, Virology and Immunology, I. Sechenov First Moscow State Medical University

Russian Federation, Moscow; Moscow

R. V. Samoilikov

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: roma_sam78@mail.ru

Research Associate, Laboratory of Molecular Immunology, I. Sechenov First Moscow State Medical University

Russian Federation, Moscow

G. A. Pryanikov

I. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: 8230712@mail.ru

Postgraduate Student, Department of Epidemiology and Evidence-based Medicine, I. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Russian Federation, Moscow

A. S. Bykov

I. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: bykov_a_s@staff.sechenov.ru

PhD, MD (Medicine), Professor, Department of Microbiology, Virology and Immunology, I. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Russian Federation, Moscow

E. P. Pashkov

I. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: 8230712@mail.ru

PhD, MD (Medicine), Professor, Department of Microbiology, Virology and Immunology, I. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Russian Federation, Moscow

A. V. Poddubikov

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: poddubikov@yandex.ru

PhD (Biology), Head, Laboratory of Microbiology of Opportunistic Bacteria, I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Russian Federation, Moscow

O. A. Svitich

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera; I. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: svitichoa@yandex.ru

PhD, MD (Medicine), Corresponding Member, Russian Academy of Sciences, Director, I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera; Professor, Department of Microbiology, Virology and Immunology, I. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Russian Federation, Moscow; Moscow

V. V. Zverev

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera; I. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: vitalyzverev@outlook.com

PhD, MD (Biology), Full Member, Russian Academy of Sciences, Scientific Advisor, I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera; Professor, Department of Microbiology, Virology and Immunology, I. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Russian Federation, Moscow; Moscow

References

Supplementary files