Relationship between serum uric acid levels and complement functional activity

Full Text

Введение

К настоящему времени сложилось представление о том, что мочевая кислота (МК) является одним из молекулярных паттернов, связанных с повреждением (DAMP). Доказано, что кристаллы МК способны прямо активировать инфламмасомы NLRP3 [1]. Известно, что кристаллы солей МК способны активировать комплемент и способствуют увеличению уровней C4a, C3a и C5a [5]. Активация комплемента уратами in vitro может приводить к снижению содержания белков системы комплемента в крови [4]. Интерес к оценке роли МК в развитии воспаления устойчиво растет в последние десятилетия. Показано наличие связи между содержанием МК в сыворотке крови и уровнями ряда маркеров воспаления (CRP, TNFα, IL-6, MCP-1, VCAM-1, ICAM-1) [3].

Вместе с тем до сих пор нет ясного представления о концентрационно-функциональных связях между МК, ключевыми белками комплемента и функциональными параметрами комплемент-опосредованного гемолиза. Считаем, что выявление и описание таких связей дает возможность обосновать концентрации МК, которые не стимулируют спонтанную активацию комплемента. Для установления взаимосвязей между концентрацией МК в крови и ее возможным влиянием на систему комплемента определены отдельные биохимические показатели крови и функциональные параметры комплемент-опосредованного гемолиза эритроцитов кролика при активации альтернативного пути (АПК) и при одновременной активации классического пути и АПК.

Материалы и методы

Исследованы 62 сыворотки крови пациентов терапевтического профиля от 32 мужчин и 30 женщин в возрасте от 21 до 87 лет. Биохимические показатели сыворотки крови определены на анализаторе Sapphire 400 (Япония) с использованием наборов реактивов Randox (Великобритания). Во всех образцах определены: концентрации общего белка, альбумина, мочевой кислоты, С-реактивного белка (СRP), IgM и концентрации факторов С3 и С4.

Параметры функциональной активности комплемента исследовали при кинетической регистрации в планшетах для иммунологических реакций на фотометре Multiscan FC (Thermo Scientific, США) при 37 °C в режиме периодического встряхивания (5 Гц). Измерения экстинкции выполняли при λ = 620 нм каждые 20 с.

При оценке АПК в составе смеси объемом 200 мкл присутствовали: 20 мкл сыворотки, буферный раствор (50 мкл, pH 7,3) с хелатирующим агентом ЭГТА и MgCl₂ (в концентрациях 2 мМ и 4,25 мМ соответственно), 80 мкл физиологического раствора (NaCl, 0,9%) и 50 мкл стандартной суспензии эритроцитов кролика в физиологическом растворе, которая обеспечивала начальное значение экстинкции в диапазоне от 0,85 до 0,95. Суспензию готовили из эритроцитов, стабилизированных в реактиве Олсвера в течение двух месяцев и троекратно отмытых физиологическим раствором непосредственно перед получением рабочей смеси. Эритроциты в планшет вносили последними, после смешивания всех остальных компонентов.

Регистрацию гемолиза в условиях одновременной активации классического и альтернативного путей комплемента проводили в таких же условиях, но без ЭГТА, в присутствии CaCl₂ и MgCl₂ в конечных концентрациях 1,275 мМ и 4,25 мМ соответственно. Образцом для анализа служила сыворотка, разбавленная физиологическим раствором в 2 раза. Остальные компоненты смеси были такими же, как и при регистрации активации АПК.

В ходе регистрации кинетики гемолиза измерены и использованы для анализа два параметра: максимальное значение скорости гемолиза (V_lys), равное наибольшему изменению экстинкции (dE₆₂₀) в интервале между двумя измерениями и время 50%-ного лизиса (T₅₀) равное интервалу от стартового измерения до достижения экстинкции равной 50% от начального значения экстинкции. Анализировали различия в параметрах активации комплемента и их связи с концентрациями МК, CRP, IgM, C3 и C4. Оценены корреляционные связи между показателями и частота встречаемости образцов с различными уровнями V_lys и T₅₀ в пределах групп, ранжированных по концентрациям МК.

В качестве граничных значений при разделении образцов по группам на основе измеренных концентраций МК выбраны значения 370 мкМ (6,22 мг/дл) и 270 мкМ (4,54 мг/дл). Основанием для такого выбора служат данные о растворимости МК при изотонических концентрациях NaCl (0,15 М), которые близки выбранному значению 370 мкМ [2]. Концентрации белка в смесях соответствовали 10% от общего белка в сыворотке (M±SD = 6,01±0,60 г/л). Такая концентрация белка не может оказывать существенного влияния на растворимость МК. Кроме того, при 10-кратном разбавлении сыворотки крови конечная концентрация МК в смеси не могла способствовать образованию кристаллов уратов in situ. Таким образом, различия V_lys или T₅₀, связываемые с [МК], должны отражать влияние на систему комплемента кристаллов, или суммы кристаллов и растворенной МК в исследуемых образцах сыворотки крови.

Результаты и обсуждение

Анализ показателей активности комплемента и биохимических параметров сывороток показал, что среди всех образцов с высокой активностью АПК (T₅₀ < 600 с) около 45% содержали мочевую кислоту в концентрациях > 370 мкМ и лишь 12,5% образцов с такой же концентрацией мочевой кислоты продемонстрировали пониженную функциональную активность АПК (T₅₀ > 600 с). При оценке связи между V_lys и [МК] в рамках эксперимента в группе с высоким значением V_lys (dE₆₂₀ > 0,042) доля образцов с [МК] > 370 мкМ составила 31% (14 из 45), а в образцах с низким значением V_lys (dE₆₂₀ < 0,042) доля таких же образцов равна 17,6% (3 из 17). Таким образом, можно говорить о наличии связи между частотой встречаемости образцов с высокими концентрациями МК и высокой функциональной активностью АПК.

В общей совокупности исследованных образцов не выявлено статистически значимой связи между [CRP] и функциональной активностью комплемента и не показано взаимного влияния МК и CRP на параметры активации комплемента. Однако при оценке влияния «фоновых» концентраций IgM на эффекты МК и CRP в отношении АПК оказалось, что при «низких» уровнях IgM (< 1 г/л, n = 35) наблюдается умеренная обратная корреляция между T₅₀ и [CRP] (r = -0,5329; p < 0,0005).

При анализе полной выборки (n = 62) не было выявлено статистически значимой корреляции между уровнями [МК], V_lys и T₅₀ как для АПК, так и для суммарной активации комплемента. Анализ связей между [С3], [С4] и параметрами активации комплемента в образцах с уровнями [МК] = 100370 мкМ (I) и [МК] > 370 мкМ (II) показал, что они значительно отличаются. В группе I отсутствует корреляция между [C3] или [C4] в отношении V_lys для АПК, но есть негативная корреляция между [С3] и [С4] в отношении T₅₀, (r = -0,4361, p = 0,0025; и r = -0,4409, p = 0,0022 соответственно). Для группы II (n = 17) показано, что как для [С3], так и [С4] отсутствует корреляция с T₅₀, но есть ожидаемая позитивная корреляция с V_lys. Для [С3] коэффициент r = 0,4638, p = 0,0304, а для C4 r = 0,5718, p = 0,0082. Для этих показателей ожидание высоких уровней значимости и тесности связей маловероятно, поскольку между конечным результатом анализа гемолитической активности комплемента и абсолютными значениями концентраций С3 и С4 линейная зависимость возможна только при крайнем дефиците этих белков в анализируемых образцах. Кроме того, надо понимать, что корреляция между C4 и T₅₀ для АПК отражает в большей степени не вклад C4 в активацию АПК, а наличие связи между [C3] и [С4]. Корреляция между [С3] и [С4] в нашей выборке сывороток была значительной (r = 0,8009; p < 0,0001). Кроме того, уровни альбумина в образцах также в значительной степени связаны, как с [C3] (r = 0,4174; p = 0,0007), так и с [С4] (r = 0,4586; p < 0,0002). Эти связи между С3, С4 и альбумином ожидаемы и обусловлены тем, что синтез этих белков протекает в клетках одного типа, в основном, в гепатоцитах.

В связи с необходимостью учета нелинейного характера связи между концентрацией C3 и показателями гемолиза (T₅₀ или V_lys) для оценки вклада МК в активацию комплемента выполнили корреляционный анализ с использованием значений двух функций, как характеристик С3 и МК: линейной функции y = [МК]*[C3], и показательной функции y = [МК]*e^[C3].

Из расчета исключили все образцы c [МК] < 100 мкМ – такие уровни свидетельствуют о возможном разбавлении крови, например, при инфузионной терапии. При [МК] = 100-600 мкМ выявлена умеренная обратная корреляция между T₅₀ vs [C3], [МК]*[C3] и [МК]*e^[C3] (r = -0,439, -0,4299 и -0,5146 соответственно). Для величины [МК]*e^[C3] уровень значимости составил p = 0,0002. Любопытно, что корреляция между V_lys и [МК]*[C3] тоже оказалась существенной (r = 0,4510, p = 0,0007). Эти факты сами по себе не являются убедительным доказательством вклада МК в процессы активации АПК, поскольку коэффициенты корреляции невелики.

При оценке связи T₅₀ vs [МК]*e^[C3] в образцах с [МК] > 270 мкМ (n = 34) получены значения r = -0,5453 и p < 0,0004. В выборке для [МК] > 370 мкМ (n = 16), связь между T₅₀ и [МК]*e^[C3] оказалась более существенной (r = -0,8262 при p < 0,0001). Несмотря на то, что ведущей переменной, влияющей на V_lys и T₅₀, является величина e^[C3], включение в формулу расчета значения [МК] в качестве сомножителя существенно повышает как коэффициент корреляции, так и уровень значимости анализируемой связи. Зависимость между Т₅₀ и величиной [МК]*e^[C3] при активации АПК представлена на рисунке 1.

 

Рисунок 1. Зависимость Т₅₀ при активации АПК от величины [UA]*e^[C3]

Figure 1. Dependence of Т₅₀ on the value of [UA]* e^[C3] upon alternative pathway of complement activation

 

На основании выявленных закономерностей, можно утверждать, что при [МК] > 370-400 мкМ, конечный метаболит пуринового обмена может вносить значительный вклад в спонтанную активацию системы комплемента. Следует отметить, что в исследованных нами образцах сывороток крови с признаками гиперурикемии при оценке концентраций C3 и C4 турбидиметрическим методом не было выявлено признаков снижения концентрации этих белков.

Заключение

Таким образом, наряду со способностью мочевой кислоты активировать инфламмасомы, ее влияние на процессы активации комплемента является самостоятельным фактором, способствующим поддержанию хронического воспалительного процесса.

About the authors

P. P. Beltyukov

Research Institute of Hygiene, Occupational Pathology and Human Ecology of the Federal Medical-Biological Agency

Author for correspondence.
Email: biochem2005@rambler.ru

PhD (Medicine), Associate Professor, Leading Research Associate, Laboratory of Molecular Toxicology and Experimental Therapy

Russian Federation, Leningrad Region

A. Yu. Tokarev

Research Institute of Hygiene, Occupational Pathology and Human Ecology of the Federal Medical-Biological Agency

Email: biochem2005@rambler.ru

Research Associate, Laboratory of Molecular Toxicology and Experimental Therapy

Russian Federation, Leningrad Region

A. S. Smirnova

Research Institute of Hygiene, Occupational Pathology and Human Ecology of the Federal Medical-Biological Agency

Email: biochem2005@rambler.ru

Junior Research Associate, Laboratory of Molecular Toxicology and Experimental Therapy

Russian Federation, Leningrad Region

M. E. Beltyukova

Almazov National Medical Research Centre

Email: biochem2005@rambler.ru

Clinical Laboratory Diagnostics Specialist

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files