Indices of the peripheral blood cellular immunity elderly in the patients with malnutrition

Full Text

Введение

Сложный динамический процесс иммуностарения (immunosenescence) характеризуется значительными изменениями компонентов и функций врожденной и приобретенной защиты организма, а также системы цитокинов при возрастном непрерывном истощении иммунных клеток на фоне хронической антигенной перегрузки и снижении числа наивных [7, 8]. При негативном воздействии этого процесса на организм возникает вялотекущее асептическое хроническое «возрастное воспаление» (инфламейджинг) с прогрессирующим снижением продукции эффективных антител против патогенов и при вакцинации [8]. На фоне снижения продукции половых стероидов, субклинических расстройств (атеросклероз) и бессимптомной бактериурии отмечается повышение количества циркулирующих в крови провоспалительных цитокинов (TNFα, IL-1 и IL-6), числа активированных цитотоксических Т-лимфоцитов и NK-клеток с последующим увеличением уровня маркеров воспаления С-реактивного белка и сывороточного амилоида [6, 12]. В частности, происходит инволюция тимуса со снижением количества Т-клеток и появляются дисфункциональные В- и Т-клетки, моноциты, NK-клетки и нейтрофилы [6, 12]. Кроме того, отмечается нарушение соотношения субпопуляций Т-хелперов 1-го и 2-го типа (Th1/Th2) при проявлении профиля иммунного риска, который характеризуется инвертированным соотношением CD4/CD8 и увеличением количества CD3⁺CD8⁺CD28⁺ клеток [4]. Также на фоне снижения уровня IFNγ и повышения содержания интерлейкинов-4 и 10 возрастает восприимчивость организма к инфекции [4].

Важная проблема общественного здравоохранения – это широко распространенные возрастные заболевания саркопения и дисфагия, которые чаще всего отмечаются в коморбидности у немощных пожилых людей, приводя к обезвоживанию и недоеданию. «Саркопеническая дисфагия» характеризуется нарушением глотания из-за потери массы и силы глотательных мышц и может быть связана с плохим состоянием здоровья полости рта по причине прямого нарушения функций иммунной системы и процессов репарации тканей [4, 10]. Причем несбалансированное состояние, возникающее в результате недостаточного потребления питательных веществ для удовлетворения нормальных физиологических потребностей, мальнутриция, усугубляет иммунную дисфункцию, вызывая различные неблагоприятные события [5]. Распространенность недоедания среди пожилых людей составляет 3,1% в обществе, тогда как среди госпитализированных пациентов – 22% [1]. Несмотря на сложную этиологию патогенеза мальнутриции, показано, что воспаление является ее ключевым фактором [9]. Инфламейджинг, вызванный длительными хроническими заболеваниями, оказывает влияние на нервные центры и аппетит, вызывая катаболизм белков поперечно-полосатых мышц, нарушая функции желудочно-кишечного тракта и контролируя гормоны, связанные с голодом [5]. Для скрининга мальнутриции у пожилых людей используется анкетирование с включением показателя индекса массы тела (ИМТ), который вычисляется на основании измерения роста и веса. Показана корреляция между результатами опроса по мини-оценке питания, ИМТ и показателем соотношения нейтрофилов к лимфоцитам [1, 2, 9]. Также в качестве независимого фактора риска недоедания или неполноценного питания у пожилых людей был предложен системный индекс иммунного воспаления (OR 3,984, 95% CI: 2,426-6,543, p < 0,001) [10]. Тем не менее остается под вопросом, сопровождает ли инфламейджинг вышеуказанную патологию, тогда как оценка состояния клеток может помочь понять иммуноопосредованные механизмы патогенеза мальнутриции, связанной с возрастными изменениями организма. Цель исследования: определение субпопуляций CD4⁺ и CD8⁺Т-лимфоцитов, В-клеток и числа наивных и клеток памяти при мальнутриции.

Материалы и методы

Образцы крови (ЭДТА 4 мл) были получены от 20 здоровых доноров (возраст ≤ 60 лет), 22 (лица без признаков мальнутриции, сопоставимые по полу и возрасту основной группе, возраст > 60 лет) и 42 пациентов с патологией (возраст > 60 лет). Все участники, включенные в исследование, проведенном в соответствии с этическими принципами Хельсинкской декларации и одобренном Междисциплинарным комитетом по этике ФГБОУ ВО ТГМУ Минздрава (протокол № 2 от 12.11.2023), подписали форму информированного согласия. Образцы крови пациентов были собраны в поликлинике ГБУЗ ККБ № 2 и КГБУЗ «Госпиталь для ветеранов войн» (г. Владивосток). Для всех обследуемых лиц проведена комплексная гериатрической оценка, включая параметры антропометрических измерений (ИМТ, окружность плеча и голени, вес), потребления питательных веществ, общего состояния (биологический возраст, самооценка здоровья, субъективный анализ физического и психического здоровья, качество жизни, повседневная и инструментальная активность жизни по индексу Бартела и шкале Лоутона). Помимо этого, был проведен биоимпедансный анализ для оценки абсолютных и относительных базовых параметров тела (количество жировой и мышечной ткани, процент жировой массы, соотношение внутри- и внеклеточной жидкости).

Из периферической крови обследуемых выделяли суспензию ядросодержащих клеток, затем к 100 мкл суспензии, содержащей 1 × 10⁶ кл/ мл, вносили 5 мкл мышиных меченных моноклональных антител против антигенов человека CD3 Brilliant Violet 421™, CD4 FITC, CD8 APC, CD45RA PE/Cyanine5, CD45RO PE/Cyanine5, CD19 FITC, CD27 APC, CD14 FITC, CD16 Alexa Fluor^® 647, CD11a (LFA-1) FITC и коктейля антител CD3 FITC/CD16⁺CD56 PE (Elabscience, Китай). После инкубирования в течение 10 мин в темноте удаляли несвязанные антитела путем промывания и центрифугирования и проводили оценку количества флуоресцирующих клеток с помощью проточного цитофлуориметра MACSQuant TM 10 (Miltenyi Biotec GmbH, Германия). Настройки прибора и гейтирование клеток проводили согласно принятым протоколам, данные анализировали, набирая не менее 30 000 событий. Обработку результатов проводили с использованием программ MACSQuantify™ Software v. 2.5 (Miltenyi Biotec GmbH, Германия) и Kaluza™ v. 1.2 (Beckman Coulter, США). В качестве контроля использован фосфатно-солевой буфер (PBS).

Статистический анализ. Для определения различий частоты подмножеств между показателями и наличием мальнутриции использовали непараметрические критерии Уилкоксона, Манна–Уитни и коэффициент корреляция Спирмена. Данные представлены как медианы и квартили. Анализы проводились с привлечением программы Stata 13.1 (IBM, США).

Результаты и обсуждение

К недостаточности питания (мальнутриции) у пациентов пожилого и старческого возраста относится патологическое состояние, обусловленное несоответствием поступления и расхода питательных веществ, в результате которого снижается масса тела и функциональность. Согласно оценке состояния пациентов по показателям шкал с выявлением недостаточности питания и скрининга нутритивного риска, обследуемые лица были распределены на группы без мальнутриции, с умеренной и тяжелой степенью выраженности. Был проведен биоимпедансный анализ, где в качестве исходных данных использовались результаты оценки абсолютных и относительных базовых параметров тела. На основании антропометрических замеров (рост, вес, обхват талии, обхват бедер) рассчитывались нормативные параметры, а после измерения показателей электрической проводимости тканей получали истинные значения параметров. Результаты представлены в виде коэффициента соотношения нормативных и реальных показателей (табл. 1). Установлены положительные корреляции для пациентов с мальнутрицией между показателями стандартных шкал и биоимпедансного анализа, а именно, безжировой (r = 0,654, p < 0,001), активной клеточной (r = 0,875, p < 0,001) и мышечной массами (r = 0,679, p < 0,001). Несмотря на высокий ИМТ при умеренной степени мальнутриции, коэффициенты состояния мышечной ткани (табл. 1), достоверно были ниже значений для здоровых лиц (p < 0,01), как и пациентов с тяжелой степенью при значениях ИМТ приближенных к корме. Эти данные демонстрируют, что метод биоимпедансного анализа по сравнению со стандартными шкалами позволяет обнаружить большее количество лиц с риском недоедания.

 

Таблица 1. Коэффициент соотношения нормативных и расчетных показателей биоимпедансного анализа

Table 1. The coefficient of the ratio normative and calculated indicators of bioimpedance analysis

Показатели, % Indicators, %	Без мальнутриции Without malnutrition (n = 22)	Умеренная степень мальнутриции Moderate malnutrition (n = 22)	Тяжелая степень мальнутриции Severe malnutrition (n = 20)
Индекс массы тела Body mass index	31,8 (23,3-37,1)	31,6 (26,0-43,8)	26,2 (19,1-31,1)*
Основной обмен веществ, ккал Basal metabolic rate, kcal	1,5 (0,06-3,40)	1,2 (1,06-1,40)*	1,1 (0,9-1,2)*
Жировая масса, кг Fat mass, kg	1,1 (1,01-1,20)	1,7 (1,06-3,50)*	1,3 (0,5-2,1)*
Безжировая масса, кг Lean mass, kg	1,1 (1,01-1,20)	0,9 (0,9-1,1)*	0,9 (0,9-1,0)*
Содержание жидкостей, л Liquid content, L	1,2 (0,9-1,3)	1,0 (0,9-1,0)	0,9 (0,8-0,9)*
Количество общей воды, л Total water volume, L	1,2 (1,0-1,4)	1,1 (1,0-1,4)	1,0 (0,9-1,2)*
Активная клеточная масса, кг Active cell mass, kg	1,2 (0,9-1,4)	1,0 (0,9-1,3)*	0,8 (0,6-0,9)*
Активная клеточная масса, % Active cell mass, %	49,5 (40-62)	42,6 (36-46)*	39,9 (37-44)*
Мышечная масса, кг Muscle mass, kg	1,2 (0,9-1,4)	0,9 (0,8-1,0)*	0,7 (0,6-0,8)*

Примечание. Коэффициент достоверности различий между показателями здоровых лиц и пациентов, * – р < 0,01.

Note. Coefficient of reliability of differences between indicators of healthy individuals and patients, *, р < 0.01.

 

У пожилых лиц установлено достоверное повышение процента нейтрофилов и цитотоксических Т-лимфоцитов от общего числа CD3⁺ клеток, и, напротив, снижение количества В-лимфоцитов и NK-клеток (p < 0,05) (табл. 2). Согласно экспрессии на клеточной поверхности различных изоформ молекулы CD45RA и CD45R0 возможно распределение лимфоцитов на наивные (CD45RA⁺CD45R0^-) и клетки памяти (CD45RA^-CD45R0⁺). Способностью активно отвечать на повторный контакт с антигеном обладают клетки, экспрессирующие CD45R0⁺, что является их функциональным отличием от наивных предшественников. Определено, что с возрастом отмечается снижение количества наивных клеток (CD45RA) и повышение числа клеток памяти (CD45R0) (табл. 2). Причем у пожилых лиц при умеренной и высокой степени мальнутриции, по сравнению с молодой (≤ 60 лет) когортой, в субпопуляции Т-хелперов (CD3⁺CD4⁺) обнаружено значимое снижение количества наивных клеток и, соответственно, повышение числа Т-лимфоцитов памяти. Выявлена отрицательная корреляция между наличием мальнутриции у пациентов и количеством CD45RA⁺ от CD3⁺ клеток и их CD4⁺ субпопуляции (rCD3⁺ = -0,692, rCD4⁺ = -0,595) и, напротив, положительная с показателями CD45R0⁺Т-лимфоцитов, (rCD3⁺ = 0,714, rCD4⁺ = 0,718 соответственно). В отношении цитотоксической популяции Т-лимфоцитов обнаружено, что у пациентов с мальнутрицией снижается количество как наивных, так и клеток памяти (rCD45RA⁺ = -0,634, rCD45RО⁺ = -0,709).

 

Таблица 2. Показатели клеточного иммунитета

Table 2. Cellular immunity indicators

Показатели, % от целевой популяции клеток Indicators, % of target cell population	Здоровые лица (≤ 60 лет) Healthy participants (≤ 60 years, n = 20)	Здоровые лица Healthy participants (> 60, n = 22)	Пациенты с мальнутрицией Patients with malnutrition
			умеренная степень moderate degree (n = 22)	высокая степень high degree (n = 20)
CD3+Т клетки CD3+T cells	67,5 (55-80)	71,3 (63-74)	74,06 (70-77)	70,01 (67-72)
CD3+CD45RA+CD45RО-Т-клетки наивные CD3+CD45RA+CD45RО-T cells naive	49 (56-59)	36 (27,0-42,5)*	26,7 (23,0-30,7)*	25,1 (20-36)*
CD3+CD45RA-CD45RО+Т-клетки памяти CD3+CD45RA-CD45RО+T memory cells	28 (19-39)	38 (28-48)*	43 (32-56)*	45 (34-58)*
CD4+Т-хелперы (Тh) CD4+T helpers (Тh)	36 (34-38)	36,1 (29,0-42,7)	46,2 (38-48)*	36 (31,3-45,6)
CD4+CD45RA+CD45RО-Тh-наивные CD4+CD45RA+CD45RО-Тh naive	37,6 (26-50)	36,7 (15-30)*	15,7 (12,7-26,0)*	17,8 (14,4-29,0)*
CD4+CD45RA-CD45RО+Тh-памяти CD4+CD45RA-CD45RО+Тh memory	48 (49-73)	45 (51-74)*	72 (59-82)*	74 (56-84)*
CD4+CD45RA+CD45RО+Тh-активированные CD4+CD45RA+CD45RО+Тh activated	1,4 (0,7-2,1)	11,7 (7,2-17)*	10,6 (7,3-15)*	13,3 (6,1-19,1)*
CD3+,CD8+Т-цитотоксические CD3+,CD8+Т cytotoxic	26,5 (24-37)	45,5 (32-51)*	43,7 (35,5-47)*	37,1 (28,6-40)*
CD8+CD45RA+Т-цитотоксические наивные CD8+CD45RA+Т cytotoxic naive	54 (43-65)	38 (29-47)*	34 (26-42)*	36 (20-32)
CD8+ CD45RО+Т-цитотоксические памяти CD8+ CD45RО+Т cytotoxic memory	39,5 (22,0-56,6)	27 (22-32)	12,6 (12-15)	12 (10-14)
CD8+CD45RA+CD45RО+Т-цитотоксические активированные CD8+CD45RA+CD45RО+ activated T cytotoxic	2,6 (1,0-3,2)	18 (14-26)	46 (22-58)	42 (28-54)
CD19+В-лимфоциты CD19+B lymphocytes	13 (12-14)	9,12 (7,0-13,1)*	7,37 (5,0-12,9)*	10,25 (6-15)
СD19+CD27+ активированные В-лимфоциты СD19+CD27+ activated B lymphocytes	5,5 (1,8-44,4)	2,4 (1,8-3,7)*	1,8 (1,5-2,9)*	2,2 (2,1-5,5)
CD3-CD16+CD56+NK-клетки CD3-CD16+CD56+NK cells	12,5 (10-22)	5,8 (4,3-8,1)*	4,2 (2,7-5,7)*	4,6 (2,6-5,7)*
CD14++CD16- моноциты классические CD14++CD16- classical monocytes	85 (78-88)	93,8 (88,4-96,0)	95,8 (92-97)	96,2 (93-97)
CD14++CD16+ моноциты воспалительные CD14++CD16+ inflammatory monocytes	5 (2,0-6,6)	6,2 (4,3-11,6)	4,2 (2,9-7,6)	3,8 (3,3-6,1)
Нейтрофилы Neutrophils	60 (47-72)	76,9 (71-82)*	78 (72-84)*	82 (76-88)*
Нейтрофилы CD11а+CD16+ Neutrophils CD11а+CD16+	46 (34-52)	55,7 (45-68)*	44,9 (40,0-53,8)*	47 (44-56)
Соотношение нейтрофилов к лимфоцитам Neutrophil to lymphocyte ratio	1,5 (1,0-1,6)	1,8 (1,1-1,9)*	2,4 (1,8-2,6)*	2,2 (1,8-2,4)*

Примечание. * представляет статистическую разницу между показателями здоровых лиц и пациентов, оцененную с помощью апостериорного теста Краскела–Уоллиса при уровне значимости р < 0.05.

Note. * represents statistical difference between healthy participants and patients, assessed using Kruskal–Wallis a posteriori test at significance level р < 0.05.

 

После контакта трансмембранного лиганда с TNFα, CD27⁺В-клетки обладают способностью вырабатывать иммуноглобулин. Значительные различия в зависимости от возраста были обнаружены относительно субпопуляций В-клеток наивных (53,8±13,0 против 36,5±12,8; p < 0,05) и памяти (29,1±13,9 против 7,26±10,64; p < 0,05), а также активированных В-лимфоцитов, число которых у пожилых лиц снижалось (табл. 2). Согласно нашим данным, достоверно снижался гематологический параметр системного воспаления соотношение нейтрофилов к лимфоцитам у пациентов с нарастанием степени выраженности мальнутриции (табл. 2). Это состояние является результатом сложного взаимодействия между хроническим воспалением и физиологическими изменениями, связанными со старением [2, 6, 9].

Патогенез неполноценного питания у пожилых людей в настоящее время малоизвестен. Существует предположение, что сначала старение запускает хронический воспалительный процесс, затем инициация продукции провоспалительных цитокинов, которые оказывают воздействие на нервный центр и эндокринную систему, увеличивают риск недостаточного потребления питательных веществ [6, 7]. Иммунное старение является следствием возрастного снижения жизнеспособности и точности адаптивной иммунной системы, в основном по причине дегенерации тимуса, вследствие которого происходит изменение функций субпопуляций Т-лимфоцитов [13]. Системный пул этих клеток поддерживается путем формирования в тимусе наивных клеток, возникновением Т-клеток памяти при иммунном ответе и гомеостатической пролиферации как тех, так и других [11]. После выхода наивные Т-клетки проходят периферическую положительную селекцию под влиянием комплекса гистосовместимости периферических аутопептидов иммунных клеток, после чего пролиферируют и приобретают статус зрелых наивных Т-клеток с экспрессией маркеров, типичных для них, в том числе и CD45RA [8]. Нами определено, что с увеличением возраста обнаруживается снижение числа общих и наивных Т-клеток как в популяциях CD4⁺, так и в популяциях CD8⁺Т-клеток. Особенно очевидно показано для клеток с наивным фенотипом, поскольку CD4⁺ и CD8⁺Т-клетки в 2 и 1,5 раза соответственно снижались у пациентов с мальнутрицией по сравнению с молодыми людьми. Количество CD4⁺Т-клеток памяти значительно увеличивалось с возрастом, тогда как число Т-клеток памяти CD8⁺, напротив, снижалось. По мере старения организма вклад тимуса в поддержание пула Т-клеток становится все меньше и в результате гомеостатической пролиферации изрядную долю CD45R0-клеток составляют суррогатные клетки памяти. С одной стороны, они конкурируют за выживание с истинными клетками памяти, обеспечивающими иммунную защиту пожилым людям, а с другой – могут спровоцировать аутоиммунную патологию [4].

Высокий уровень недоедания, наблюдаемый у лиц с повышенными показателями соотношения нейтрофилов к лимфоцитам и мальнутрицией, может быть результатом возрастного инфламейджинга, связанного с наличием сопутствующих заболеваний [3, 12]. С возрастом иммуновоспаление нарастает в корреляции с хроническими заболеваниями и может привести к физиологическим изменениям, которые влияют на статус питания [6]. При этом обнаруживается высокая продукция цитокинов, которые регулируют количество и функцию воспалительных клеток, таких как нейтрофилы и лимфоциты. По сравнению с менее надежными показателями веса и роста этот параметр – более объективный маркер оценки катаболического статуса у пожилых людей [1, 9, 10]. Тем не менее для того, чтобы подтвердить обоснованность этого предложения, необходимы дальнейшие исследования, включающие комплексные оценки питания, биоимпеданстный анализ и когортный метод. Подводя итог, можно сказать, что иммунологическая функция, воспаление и недоедание взаимосвязаны и представляют собой порочный круг. На основании данных различных анкет, вполне рационально думать, что люди с ожирением могут недоедать, но при этом иметь хорошие показатели ИМТ. В этой связи становится разумным оценивать недоедание у пожилых людей с использованием системных воспалительных биомаркеров. Таким образом, мальнутриция у пожилых людей характеризуется снижением числа наивных Т-клеток, повышением CD4⁺Т-клеток памяти и показателя соотношения нейтрофилов к лимфоцитам, что указывает на высокую выраженность у таких пациентов возрастного инфламейджинга.

Выводы

У пожилых людей по сравнению с молодыми установлено повышение числа нейтрофилов, цитотоксических Т-лимфоцитов и, напротив, снижение количества В-лимфоцитов и NK-клеток (p < 0,05).

У пожилых пациентов с мальнутрицией по сравнению с молодыми людьми снижаются показатели числа наивных лимфоцитов и CD8⁺Т-клеток памяти, а количество CD4⁺Т-клеток памяти значительно повышается.

Показатель системного воспаления у пожилых пациентов коррелирует со степенью выраженности мальнутриции.

About the authors

N. G. Plekhova

Pacific State Medical University

Author for correspondence.
Email: pl_nat@hotmail.com

PhD, MD (Biology), Associate Professor, Head, Interdisciplinary Research Center

Russian Federation, Vladivostok

M. A. Kabalyk

Hospital for War Veterans

Email: pl_nat@hotmail.com

PhD (Medicine), Head, Geriatric Center, Geriatrician

Russian Federation, Vladivostok

N. V. Tsvetov

Pacific State Medical University

Email: pl_nat@hotmail.com

Assistant, Institute of Clinical Neurology and Rehabilitation Medicine

Russian Federation, Vladivostok

P. V. Gorokhovskaya

Hospital for War Veterans

Email: pl_nat@hotmail.com

Therapist, Therapeutic Department No. 2

Russian Federation, Vladivostok

M. М. Ivanyuk

Hospital for War Veterans

Email: pl_nat@hotmail.com

Therapist, Admission Department

Russian Federation, Vladivostok

E. V. Prosekova

Pacific State Medical University

Email: pl_nat@hotmail.com

PhD, MD (Medicine), Professor, Head, Department of Clinical Laboratory Diagnostics, General and Clinical Immunology

Russian Federation, Vladivostok

E. S. Beldy

Pacific State Medical University

Email: pl_nat@hotmail.com

Laboratory Assistant, Interdisciplinary Research Center

Russian Federation, Vladivostok

O. E. Dondokova

Pacific State Medical University

Email: pl_nat@hotmail.com

Laboratory Assistant, Interdisciplinary Research Center

Russian Federation, Vladivostok

V. А. Sabynych

Pacific State Medical University

Email: pl_nat@hotmail.com

PhD (Medicine), Associate Professor, Department of Clinical Laboratory Diagnostics, General and Clinical Immunology

Russian Federation, Vladivostok

References

Supplementary files