Влияние трофобластического β₁-гликопротеина на экспрессию аргиназы-1 и индоламин-2,3-диоксигеназы миелоидными супрессорными клетками

Полный текст

Введение

Миелоидные супрессорные клетки (МСК, MDSC) представляют собой небольшую (в норме менее 1% от лейкоцитов крови) гетерогенную популяцию, состоящую из незрелых нейтрофилов и моноцитов, способных подавлять врожденный, адаптивный, а также противоопухолевый иммунный ответ. Количество MDSC возрастает при беременности и при различных патологических состояниях, таких как воспаление, заражение крови, травматический шок, аутоиммунные заболевания и рак [12].

MDSC ингибируют иммунный ответ через межклеточные взаимодействия с помощью молекул на поверхности клеток, а также короткоживущих медиаторов. Cупрессивное действие этих клеток затрагивает разные звенья клеточного иммунитета, однако в первую очередь они подавляют функции T-лимфоцитов. К поверхностным молекулам-посредникам угнетения клеточных функций относят CD73, ADAM17, PD-L1, Gal-9 и CD40. К растворимым факторам MDSC, угнетающим иммунный ответ, относят цитокины IL-10, TGF-β и активные формы кислорода [12].

Одним из самых главных механизмов иммуносупрессии для MDSC служит нарушение метаболизма аргинина и триптофана, а именно, их истощение. Фермент iNOS (индуцибельная NO-синтаза) конвертирует аргинин в NO и цитруллин, а аргиназа 1 (Arg1) – в орнитин и мочевину. Недостаток аргинина в месте иммунного ответа угнетает пролиферацию Т-клеток и подавляет экспрессию CD3-цепей TCR [15]. Аналогичным образом, STAT3 – зависимая активация индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO) приводит к дефициту L-триптофана и последующему апоптозу T-лимфоцитов [13]. Кроме того, образуются метаболиты триптофана (кинуренин, 3-гидроксикинуренин, 3-гидроксиантраниловая кислота), которые влияют на нормальное функционирование макрофагов и T-лимфоцитов, а также могут привести к образованию Treg за счет связывания с арильными углеводородными рецепторами [7].

Благодаря большому спектру механизмов супрессии MDSC в настоящее время считаются одними из важнейших регуляторов иммунного ответа. Поиск способов контроля над ними чрезвычайно актуален с точки зрения терапии всех заболеваний и состояний, в которые вовлечены эти клетки. Кроме того, MDSC могут стать удачной фармакологической мишенью для решения проблем, связанных с иммунным отторжением как полуаллогенных эмбрионов, так и пересаженных органов или тканей.

Трофобластический b1-гликопротеин (ТБГ, англ. PSG) является доминирующим фетоплацентарным белком, обладающим иммуномодулирующими свойствами. За последние 10 лет, благодаря разработке авторского метода получения нативного препарата ТБГ человека [1], мы продемонстрировали эффекты этого белка в отношении различных популяций иммунных клеток [10]. Было установлено, что ТБГ стимулирует экспрессию IDO моноцитами женщин, подавляет пролиферацию и дифференцировку Th17, подавляет продукцию провоспалительных цитокинов (IL-8, IL-17, IFNγ, MCP-1, TNFα) а также G-CSF и GM-CSF [10]. Помимо этого, было установлено, что ТБГ угнетал экспрессию маркеров активации CD28 и CD25 наивными Т-клетками, не влияя на продукцию ими IL-2, однако на уровне Т-клеток иммунной памяти ТБГ снижал поверхностную экспрессию CD25 одновременно со снижением продукции IL-2. Кроме того, было показано подавление экспрессии генов, регулирующих альтернативный сплайсинг CD45 (Gfi1, hnRNPLL) под действием ТБГ, что, по-видимому, в контексте нашей работы, может блокировать трансдифференцировку наивных Т-клеток в Т-клетки памяти [11]. Разнообразие иммунорегуляторных эффектов ТБГ натолкнуло нас на мысль о том, что этот уникальный гликопротеин может оказывать влияние и на популяцию MDSC.

Свойства нативного и рекомбинантного (негликозилированного) препаратов ТБГ могут отличаться. В то же время очевидно, что для практического применения препарата необходимо детальное изучение эффектов более доступных рекомбинантных форм ТБГ.

Ввиду гетерогенности MDSC и сложности получения их in vitro, наряду с поверхностными маркерами необходимо определять функциональное состояние этих клеток, в частности экспрессию ими ферментов деградации аминокислот, Arg1 и IDO.

Таким образом, целью настоящей работы является изучение влияния нативного и рекомбинантного ТБГ на экспрессию аргиназы-1 и индоламин-2,3-диоксигеназы миелоидными супрессорными клетками.

Материалы и методы

Периферическую кровь доноров-добровольцев забирали венепункцией (n = 4). Исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией ВМА 2000 г. и Протоколом к Конвенции Совета Европы о правах человека и биомедицине 1999 г. На используемую экспериментальную схему получено одобрение Комитета по этике ИЭГМ УрО РАН (IRB00010009) от 15 февраля 2022 г., протокол № 15. У всех пациентов было получено письменное информированное согласие.

Мононуклеарные клетки периферической крови (МПК) выделяли методом центрифугирования в градиенте плотности (ρ = 1,077 г/см³, «Диаколл», «Диаэм»). CD11b⁺ клетки выделяли из РВМС с помощью позитивной иммуномагнитной сепарации (MacsiBeads, колонки LS (Miltenyi Biotec, Германия)). Полученные клетки в концентрации 1 × 10⁶ высевали в 96-луночный планшет, содержащий полную питательную среду (RPMI-1640, 10% ЭТС, 10 мМ Hepes (ICN Ph., США), 2 мМ-глутамин (ICN Ph.) и 100 мкг/мл пенициллина-стрептомицина-амфотерицина (100 мкл на 10 мл среды, BI, Израиль)). К культурам добавляли GM-CSF (Miltenyi Biotec, Германия) в концентрации 20 нг/мл. Клетки инкубировали в течение трех дней во влажной атмосфере в СО₂-инкубаторе при 5% СО₂ и 37 °С. Затем культуральную среду заменяли, добавляли IL-1b (20 нг/мл, Miltenyi Biotec, Германия) и ЛПС (0,1 мкг/ мл, Sigma-Aldrich, США) для активации клеток. На следующий день добавляли исследуемые белки: нативный ТБГ (Патент РФ № 2367449, Раев М.Б.) в концентрациях 1, 10 и 100 мкг/мл и рекомбинантный ТБГ (PSG 1, Cusabio, Китай) в концентрациях 1 и 10 мкг/мл (выбор концентраций основывался на их соответствии разным триместрам беременности [6] и предварительным экспериментам по влиянию белков на жизнеспособность клеток. Затем клетки культивировали в течение дополнительных трех дней. Через 7 суток общей продолжительности инкубации клетки окрашивали на жизнеспособность красителем Zombie Aqua (BioLegend, США) и антителами, мечеными флуорохромами, для определения фенотипа MDSC на проточном цитометре. Панель антител для поверхностного окрашивания: анти-HLA-DR-Alexa Fluor 750, анти-CD33-APC, анти-CD11b-Alexa Fluor 405, анти-CD66b-PE, анти-CD14-PerCP (R&D Systems, США). Для исключения лимфоцитов и NK-клеток из целевого гейта использовали антитела: анти-CD19-AF700, анти-CD56-AF700, анти-CD3-AF700. Экспрессию Arg1 и IDO определяли при помощи внутриклеточного окрашивания антителами anti-h Arginase 1-AF488 и anti-h IDO-AF488 (R&D Systems, США). Пробы FMO (fluorescence minus one) и изотипические контроли использовали для разделения «негативных» и «позитивных» популяций. Образцы анализировали на проточном цитометре CytoFLEX S (Beckman Coulter, США). После гейтирования ZA^-Lin^-CD11b⁺CD33⁺ клеток, на отдельных гистограммах определяли процент Arg⁺ и IDO⁺ клеток. Данные проточной цитометрии обрабатывали с помощью программы CytExpert (Beckman Coulter, США).

Статистическую обработку данных проводили в программе GraphPad Prizm 8.0.1 с использованием критерия Фридмана и апостериорного критерия Данна для множественных сравнений. Результаты представлены в виде медианы, нижнего квартиля и верхнего квартиля – Me (Q_0,25-Q_0,75). Уровень значимости был принят за 0,05.

Результаты и обсуждение

Обнаружено, что ТБГ обоих типов во всех исследованных концентрациях не влиял на процент MDSC, содержащих аргиназу-1 (рис. 1).

 

Рис. 1. Процент MDSC, содержащих Arg1 в культурах с добавлением нативного и рекомбинантного ТБГ.

Примечание. n = 4; контроль – культуры без ТБГ; по оси абсцисс тип и концентрация ТБГ; ось ординат – процент клеток, содержащих Arg1 в гейте MDSC. Показаны медианы (горизонтальные линии), межквартильные размахи (прямоугольники), максимальные и минимальные значения («усы»).

Figure 1. Percentage of MDSC containing Arg1 in cultures supplemented with native and recombinant PSG

Note. n = 4; control, cultures without PSG; x-axis, type and concentration of PSG; y-axis, percentage of cells containing Arg1 in the MDSC gate. Medians (horizontal lines), interquartile ranges (rectangles), maximum and minimum values (“whiskers”) are shown.

 

Показано, что как рекомбинантный, так и нативный вариант ТБГ вызывали статистически значимое по отношению к контролю повышение процента клеток, экспрессирующих IDO (рис. 2). Хотя в среднем процент IDO⁺ клеток был больше в культурах с 10 мкг/мл рТБГ, чем в культурах с такой же дозой нТБГ, статистически значимых отличий между ними не было.

 

Рис. 2. Процент MDSC, содержащих IDO, в культурах с добавлением нативного и рекомбинантного ТБГ.

Примечание. n = 4; контроль – культуры без ТБГ; по оси абсцисс тип и концентрация ТБГ; ось ординат – процент клеток в гейте MDSC, содержащих IDO. Показаны медианы (горизонтальные линии), межквартильные размахи (прямоугольники), максимальные и минимальные значения («усы»). Указаны значения p < 0,05 по отношению к контролю.

Figure 2. Percentage of MDSC containing IDO in cultures supplemented with native and recombinant PSG

Note. n = 4; control, cultures without PSG; x-axis, type and concentration of PSG; y-axis, percentage of cells in MDSC gate containing IDO. Medians (horizontal lines), interquartile ranges (rectangles), maximum and minimum values (“whiskers”) are shown. p < 0.05 values are given relative to control.

 

Таким образом, установлено, что ТБГ в нашей экспериментальной системе не модулировали экспрессию Arg1, однако стимулировал экспрессию IDO в концентрации 10 мкг/мл, соответствующей II триместру беременности.

Истощение запасов аргинина за счет активации аргиназы-1 было одним из первых механизмов супрессии Т-клеток, описанных для MDSC. Переносчик катионных аминокислот CAT-2B быстро переносит внеклеточный L-аргинин в MDSC, который впоследствии расщепляется на мочевину и L-орнитин под действием Arg1 [4]. Дефицит аргинина во внеклеточном пространстве может привести к потере цепи CD3ζ и очевидному ингибированию пролиферации Т-клеток [15].

В целом содержание Arg1 в культурах клеток MDSC, полученных in vitro из клеток, выделенных из периферической крови здоровых доноров, является подтверждением наличия у них супрессивной активности, что является определенным методическим успехом. Однако как мы видим, внесение ТБГ в культуры не приводило к статистически значимым изменениям числа содержащих этот фермент клеток в культурах. Данный феномен может быть связан с тем, что Arg1 человека может продуцироваться в среду, следовательно, детектироваться только в части клеток [8]. Здесь мы представляем данные только по внутриклеточному содержанию Arg1 в MDSC, однако дальнейший анализ супернатантов может помочь прояснить ситуацию. Интересно, что наряду с информацией об экспрессируемой MDSC аргиназе-1 как об одном из основных механизмов супрессии, получены данные, что MDSC из костного мозга мышей с прогрессирующей опухолью могут не экспрессировать Arg1, и авторы сделали вывод, что Arg1 не является конститутивным ферментом, а индуцируется присутствием активирующих Т-клеток [2].

Что касается второго исследуемого фермента, нами показано, что процент клеток MDSC, экспрессирующих IDO, возрастал под действием обоих видов ТБГ в концентрации 10 мкг/мл.

Существуют разные варианты регуляции экспрессии IDO. Активировать сигнальные механизмы, которые либо индуцируют, либо поддерживают экспрессию IDO способны толл-подобные рецепторы (TLR), члены суперсемейства фактора некроза опухоли (TNFR), рецептор интерферона бета (IFNBR), рецептор интерферона гамма (IFNGR), рецепторы трансформирующего фактора роста бета (TGFBR) и арилуглеводородный рецептор (AhR) [7]. В нашем случае в культуральной среде присутствовал ЛПС, участвующий в индукции IDO, таким образом, именно на фоне активации молекул TLR ТБГ оказывал свои стимулирующие эффекты.

Ранее нами была показана способность нативного ТБГ в тех же физиологических концентрациях стимулировать экспрессию IDO моноцитами периферической крови. Было установлено, что нативный ТБГ в концентрации 10 мкг/мл стимулировал экспрессию IDO в моноцитах в присутствии ЛПС, что согласуется с текущими результатами [14].

В контексте беременности, способность ТБГ модулировать активность IDO может вносить свой вклад в формировании иммунной толерантности матери к полуаллогенному плоду. К настоящему времени не обнаружены рецепторы к PSG человека на поверхности клеток, однако обнаружен механизм, при помощи которого этот белок может активировать TGF-β, связываясь с его латентной формой [3].

Вероятно, именно посредством TGF-β происходит активация синтеза IDO. Известно, что в дендритных клетках в усиление биосинтеза IDO вовлечена индукция неканонического пути NF-κB, создающая петлю положительной обратной связи для устойчивой продукции TGF-β и IDO1 через фосфатидилинозитол-3-киназа – зависимый механизм [9]. Можно предположить, что MDSC также могут использовать данный механизм для индукции экспрессии IDO и реализации супрессорной активности.

Заключение

Таким образом, нами получены новые данные, касающиеся стимуляции нативным и рекомбинантным ТБГ супрессивной функции MDSC. Эти результаты открывают возможности прицельного действия на функции миелоидных супрессоров с целью разработки и усовершенствования клеточных технологий в биомедицине.

Об авторах

Валерия Павловна Тимганова

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН – филиал ФГБУН «Пермский федеральный исследовательский центр» УрО РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: timganovavp@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-4581-1969

кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории клеточной иммунологии и нанобиотехнологии

Россия, 614081, Пермь, ул. Голева, 13

Ксения Юрьевна Шардина

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН – филиал ФГБУН «Пермский федеральный исследовательский центр» УрО РАН

Email: shardinak@gmail.com

инженер-исследователь лаборатории клеточной иммунологии и нанобиотехнологии

Россия, 614081, Пермь, ул. Голева, 13

Евгения Вячеславовна Гутина

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН – филиал ФГБУН «Пермский федеральный исследовательский центр» УрО РАН

Email: gutinai05@gmail.com

инженер лаборатории клеточной иммунологии и нанобиотехнологии

Россия, 614081, Пермь, ул. Голева, 13

Список литературы

Дополнительные файлы