Effect of pregnancy-specific β₁-glycoprotein on the expression of arginase-1 and indolamine-2,3-dioxygenase by myeloid-derived suppressor cells

Full Text

Введение

Миелоидные супрессорные клетки (МСК, MDSC) представляют собой небольшую (в норме менее 1% от лейкоцитов крови) гетерогенную популяцию, состоящую из незрелых нейтрофилов и моноцитов, способных подавлять врожденный, адаптивный, а также противоопухолевый иммунный ответ. Количество MDSC возрастает при беременности и при различных патологических состояниях, таких как воспаление, заражение крови, травматический шок, аутоиммунные заболевания и рак [12].

MDSC ингибируют иммунный ответ через межклеточные взаимодействия с помощью молекул на поверхности клеток, а также короткоживущих медиаторов. Cупрессивное действие этих клеток затрагивает разные звенья клеточного иммунитета, однако в первую очередь они подавляют функции T-лимфоцитов. К поверхностным молекулам-посредникам угнетения клеточных функций относят CD73, ADAM17, PD-L1, Gal-9 и CD40. К растворимым факторам MDSC, угнетающим иммунный ответ, относят цитокины IL-10, TGF-β и активные формы кислорода [12].

Одним из самых главных механизмов иммуносупрессии для MDSC служит нарушение метаболизма аргинина и триптофана, а именно, их истощение. Фермент iNOS (индуцибельная NO-синтаза) конвертирует аргинин в NO и цитруллин, а аргиназа 1 (Arg1) – в орнитин и мочевину. Недостаток аргинина в месте иммунного ответа угнетает пролиферацию Т-клеток и подавляет экспрессию CD3-цепей TCR [15]. Аналогичным образом, STAT3 – зависимая активация индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO) приводит к дефициту L-триптофана и последующему апоптозу T-лимфоцитов [13]. Кроме того, образуются метаболиты триптофана (кинуренин, 3-гидроксикинуренин, 3-гидроксиантраниловая кислота), которые влияют на нормальное функционирование макрофагов и T-лимфоцитов, а также могут привести к образованию Treg за счет связывания с арильными углеводородными рецепторами [7].

Благодаря большому спектру механизмов супрессии MDSC в настоящее время считаются одними из важнейших регуляторов иммунного ответа. Поиск способов контроля над ними чрезвычайно актуален с точки зрения терапии всех заболеваний и состояний, в которые вовлечены эти клетки. Кроме того, MDSC могут стать удачной фармакологической мишенью для решения проблем, связанных с иммунным отторжением как полуаллогенных эмбрионов, так и пересаженных органов или тканей.

Трофобластический b1-гликопротеин (ТБГ, англ. PSG) является доминирующим фетоплацентарным белком, обладающим иммуномодулирующими свойствами. За последние 10 лет, благодаря разработке авторского метода получения нативного препарата ТБГ человека [1], мы продемонстрировали эффекты этого белка в отношении различных популяций иммунных клеток [10]. Было установлено, что ТБГ стимулирует экспрессию IDO моноцитами женщин, подавляет пролиферацию и дифференцировку Th17, подавляет продукцию провоспалительных цитокинов (IL-8, IL-17, IFNγ, MCP-1, TNFα) а также G-CSF и GM-CSF [10]. Помимо этого, было установлено, что ТБГ угнетал экспрессию маркеров активации CD28 и CD25 наивными Т-клетками, не влияя на продукцию ими IL-2, однако на уровне Т-клеток иммунной памяти ТБГ снижал поверхностную экспрессию CD25 одновременно со снижением продукции IL-2. Кроме того, было показано подавление экспрессии генов, регулирующих альтернативный сплайсинг CD45 (Gfi1, hnRNPLL) под действием ТБГ, что, по-видимому, в контексте нашей работы, может блокировать трансдифференцировку наивных Т-клеток в Т-клетки памяти [11]. Разнообразие иммунорегуляторных эффектов ТБГ натолкнуло нас на мысль о том, что этот уникальный гликопротеин может оказывать влияние и на популяцию MDSC.

Свойства нативного и рекомбинантного (негликозилированного) препаратов ТБГ могут отличаться. В то же время очевидно, что для практического применения препарата необходимо детальное изучение эффектов более доступных рекомбинантных форм ТБГ.

Ввиду гетерогенности MDSC и сложности получения их in vitro, наряду с поверхностными маркерами необходимо определять функциональное состояние этих клеток, в частности экспрессию ими ферментов деградации аминокислот, Arg1 и IDO.

Таким образом, целью настоящей работы является изучение влияния нативного и рекомбинантного ТБГ на экспрессию аргиназы-1 и индоламин-2,3-диоксигеназы миелоидными супрессорными клетками.

Материалы и методы

Периферическую кровь доноров-добровольцев забирали венепункцией (n = 4). Исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией ВМА 2000 г. и Протоколом к Конвенции Совета Европы о правах человека и биомедицине 1999 г. На используемую экспериментальную схему получено одобрение Комитета по этике ИЭГМ УрО РАН (IRB00010009) от 15 февраля 2022 г., протокол № 15. У всех пациентов было получено письменное информированное согласие.

Мононуклеарные клетки периферической крови (МПК) выделяли методом центрифугирования в градиенте плотности (ρ = 1,077 г/см³, «Диаколл», «Диаэм»). CD11b⁺ клетки выделяли из РВМС с помощью позитивной иммуномагнитной сепарации (MacsiBeads, колонки LS (Miltenyi Biotec, Германия)). Полученные клетки в концентрации 1 × 10⁶ высевали в 96-луночный планшет, содержащий полную питательную среду (RPMI-1640, 10% ЭТС, 10 мМ Hepes (ICN Ph., США), 2 мМ-глутамин (ICN Ph.) и 100 мкг/мл пенициллина-стрептомицина-амфотерицина (100 мкл на 10 мл среды, BI, Израиль)). К культурам добавляли GM-CSF (Miltenyi Biotec, Германия) в концентрации 20 нг/мл. Клетки инкубировали в течение трех дней во влажной атмосфере в СО₂-инкубаторе при 5% СО₂ и 37 °С. Затем культуральную среду заменяли, добавляли IL-1b (20 нг/мл, Miltenyi Biotec, Германия) и ЛПС (0,1 мкг/ мл, Sigma-Aldrich, США) для активации клеток. На следующий день добавляли исследуемые белки: нативный ТБГ (Патент РФ № 2367449, Раев М.Б.) в концентрациях 1, 10 и 100 мкг/мл и рекомбинантный ТБГ (PSG 1, Cusabio, Китай) в концентрациях 1 и 10 мкг/мл (выбор концентраций основывался на их соответствии разным триместрам беременности [6] и предварительным экспериментам по влиянию белков на жизнеспособность клеток. Затем клетки культивировали в течение дополнительных трех дней. Через 7 суток общей продолжительности инкубации клетки окрашивали на жизнеспособность красителем Zombie Aqua (BioLegend, США) и антителами, мечеными флуорохромами, для определения фенотипа MDSC на проточном цитометре. Панель антител для поверхностного окрашивания: анти-HLA-DR-Alexa Fluor 750, анти-CD33-APC, анти-CD11b-Alexa Fluor 405, анти-CD66b-PE, анти-CD14-PerCP (R&D Systems, США). Для исключения лимфоцитов и NK-клеток из целевого гейта использовали антитела: анти-CD19-AF700, анти-CD56-AF700, анти-CD3-AF700. Экспрессию Arg1 и IDO определяли при помощи внутриклеточного окрашивания антителами anti-h Arginase 1-AF488 и anti-h IDO-AF488 (R&D Systems, США). Пробы FMO (fluorescence minus one) и изотипические контроли использовали для разделения «негативных» и «позитивных» популяций. Образцы анализировали на проточном цитометре CytoFLEX S (Beckman Coulter, США). После гейтирования ZA^-Lin^-CD11b⁺CD33⁺ клеток, на отдельных гистограммах определяли процент Arg⁺ и IDO⁺ клеток. Данные проточной цитометрии обрабатывали с помощью программы CytExpert (Beckman Coulter, США).

Статистическую обработку данных проводили в программе GraphPad Prizm 8.0.1 с использованием критерия Фридмана и апостериорного критерия Данна для множественных сравнений. Результаты представлены в виде медианы, нижнего квартиля и верхнего квартиля – Me (Q_0,25-Q_0,75). Уровень значимости был принят за 0,05.

Результаты и обсуждение

Обнаружено, что ТБГ обоих типов во всех исследованных концентрациях не влиял на процент MDSC, содержащих аргиназу-1 (рис. 1).

 

Рис. 1. Процент MDSC, содержащих Arg1 в культурах с добавлением нативного и рекомбинантного ТБГ.

Примечание. n = 4; контроль – культуры без ТБГ; по оси абсцисс тип и концентрация ТБГ; ось ординат – процент клеток, содержащих Arg1 в гейте MDSC. Показаны медианы (горизонтальные линии), межквартильные размахи (прямоугольники), максимальные и минимальные значения («усы»).

Figure 1. Percentage of MDSC containing Arg1 in cultures supplemented with native and recombinant PSG

Note. n = 4; control, cultures without PSG; x-axis, type and concentration of PSG; y-axis, percentage of cells containing Arg1 in the MDSC gate. Medians (horizontal lines), interquartile ranges (rectangles), maximum and minimum values (“whiskers”) are shown.

 

Показано, что как рекомбинантный, так и нативный вариант ТБГ вызывали статистически значимое по отношению к контролю повышение процента клеток, экспрессирующих IDO (рис. 2). Хотя в среднем процент IDO⁺ клеток был больше в культурах с 10 мкг/мл рТБГ, чем в культурах с такой же дозой нТБГ, статистически значимых отличий между ними не было.

 

Рис. 2. Процент MDSC, содержащих IDO, в культурах с добавлением нативного и рекомбинантного ТБГ.

Примечание. n = 4; контроль – культуры без ТБГ; по оси абсцисс тип и концентрация ТБГ; ось ординат – процент клеток в гейте MDSC, содержащих IDO. Показаны медианы (горизонтальные линии), межквартильные размахи (прямоугольники), максимальные и минимальные значения («усы»). Указаны значения p < 0,05 по отношению к контролю.

Figure 2. Percentage of MDSC containing IDO in cultures supplemented with native and recombinant PSG

Note. n = 4; control, cultures without PSG; x-axis, type and concentration of PSG; y-axis, percentage of cells in MDSC gate containing IDO. Medians (horizontal lines), interquartile ranges (rectangles), maximum and minimum values (“whiskers”) are shown. p < 0.05 values are given relative to control.

 

Таким образом, установлено, что ТБГ в нашей экспериментальной системе не модулировали экспрессию Arg1, однако стимулировал экспрессию IDO в концентрации 10 мкг/мл, соответствующей II триместру беременности.

Истощение запасов аргинина за счет активации аргиназы-1 было одним из первых механизмов супрессии Т-клеток, описанных для MDSC. Переносчик катионных аминокислот CAT-2B быстро переносит внеклеточный L-аргинин в MDSC, который впоследствии расщепляется на мочевину и L-орнитин под действием Arg1 [4]. Дефицит аргинина во внеклеточном пространстве может привести к потере цепи CD3ζ и очевидному ингибированию пролиферации Т-клеток [15].

В целом содержание Arg1 в культурах клеток MDSC, полученных in vitro из клеток, выделенных из периферической крови здоровых доноров, является подтверждением наличия у них супрессивной активности, что является определенным методическим успехом. Однако как мы видим, внесение ТБГ в культуры не приводило к статистически значимым изменениям числа содержащих этот фермент клеток в культурах. Данный феномен может быть связан с тем, что Arg1 человека может продуцироваться в среду, следовательно, детектироваться только в части клеток [8]. Здесь мы представляем данные только по внутриклеточному содержанию Arg1 в MDSC, однако дальнейший анализ супернатантов может помочь прояснить ситуацию. Интересно, что наряду с информацией об экспрессируемой MDSC аргиназе-1 как об одном из основных механизмов супрессии, получены данные, что MDSC из костного мозга мышей с прогрессирующей опухолью могут не экспрессировать Arg1, и авторы сделали вывод, что Arg1 не является конститутивным ферментом, а индуцируется присутствием активирующих Т-клеток [2].

Что касается второго исследуемого фермента, нами показано, что процент клеток MDSC, экспрессирующих IDO, возрастал под действием обоих видов ТБГ в концентрации 10 мкг/мл.

Существуют разные варианты регуляции экспрессии IDO. Активировать сигнальные механизмы, которые либо индуцируют, либо поддерживают экспрессию IDO способны толл-подобные рецепторы (TLR), члены суперсемейства фактора некроза опухоли (TNFR), рецептор интерферона бета (IFNBR), рецептор интерферона гамма (IFNGR), рецепторы трансформирующего фактора роста бета (TGFBR) и арилуглеводородный рецептор (AhR) [7]. В нашем случае в культуральной среде присутствовал ЛПС, участвующий в индукции IDO, таким образом, именно на фоне активации молекул TLR ТБГ оказывал свои стимулирующие эффекты.

Ранее нами была показана способность нативного ТБГ в тех же физиологических концентрациях стимулировать экспрессию IDO моноцитами периферической крови. Было установлено, что нативный ТБГ в концентрации 10 мкг/мл стимулировал экспрессию IDO в моноцитах в присутствии ЛПС, что согласуется с текущими результатами [14].

В контексте беременности, способность ТБГ модулировать активность IDO может вносить свой вклад в формировании иммунной толерантности матери к полуаллогенному плоду. К настоящему времени не обнаружены рецепторы к PSG человека на поверхности клеток, однако обнаружен механизм, при помощи которого этот белок может активировать TGF-β, связываясь с его латентной формой [3].

Вероятно, именно посредством TGF-β происходит активация синтеза IDO. Известно, что в дендритных клетках в усиление биосинтеза IDO вовлечена индукция неканонического пути NF-κB, создающая петлю положительной обратной связи для устойчивой продукции TGF-β и IDO1 через фосфатидилинозитол-3-киназа – зависимый механизм [9]. Можно предположить, что MDSC также могут использовать данный механизм для индукции экспрессии IDO и реализации супрессорной активности.

Заключение

Таким образом, нами получены новые данные, касающиеся стимуляции нативным и рекомбинантным ТБГ супрессивной функции MDSC. Эти результаты открывают возможности прицельного действия на функции миелоидных супрессоров с целью разработки и усовершенствования клеточных технологий в биомедицине.

About the authors

Valeria P. Timganova

Institute of Ecology and Genetic of Microorganisms, Perm Federal Research Center, Ural Branch, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: timganovavp@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-4581-1969

PhD (Biology), Research Associate, Laboratory of Cellular Immunology and Nanobiotechnology

Russian Federation, 13 Golev St., Perm 614081, Пермь

Kseniya Y. Shardina

Institute of Ecology and Genetic of Microorganisms, Perm Federal Research Center, Ural Branch, Russian Academy of Sciences

Email: shardinak@gmail.com

Research Engineer, Laboratory of Cellular Immunology and Nanobiotechnology

Russian Federation, 13 Golev St., Perm 614081, Пермь

Evgenia V. Gutina

Institute of Ecology and Genetic of Microorganisms, Perm Federal Research Center, Ural Branch, Russian Academy of Sciences

Email: gutinai05@gmail.com

Research Engineer, Laboratory of Cellular Immunology and Nanobiotechnology

Russian Federation, 13 Golev St., Perm 614081, Пермь

References

Supplementary files