Связь цитокинов и численности микросимбионтов при микроэкологических нарушениях кишечника человека

Полный текст

Введение

Кишечник является самым большим барьером для внешней среды и вместилищем значительного количества иммунных клеток и микробиоты по сравнению с любым другим биотопом в организме человека. Здоровый микробиом функционирует так же, как и любой другой орган человеческого организма, и представляет собой сложную экосистему, в которой сотни видов сосуществуют друг с другом и с клетками хозяина. Кишечный эпителий отвечает за широкий спектр важнейших функций, включая поддержание целостности барьера, предотвращение проникновения условно-патогенных микроорганизмов (УПМ) и патогенов, а также модулирование иммунной системы кишечника [5]. Связь между эпителиальными клетками, микробиотой и иммунными клетками кишечника имеет решающее значение для поддержания гомеостаза и координации соответствующих реакций в ответ на действие различных факторов и может происходить посредством межклеточного контакта или путем высвобождения регуляторных молекул [3]. Цитокины и хемокины, кишечные микросимбионты, являясь необходимыми участниками межклеточных коммуникаций, поддерживают гомеостаз слизистой оболочки кишечника, но вместе с тем могут быть ключевыми факторами воспаления кишечника и повреждения эпителиального барьера [7, 10]. Особенности взаимодействия кишечных микроорганизмов и цитокиновой сети человека наряду с другими механизмами могут влиять на регуляцию системы «микросимбиоценоз-хозяин», о чем свидетельствуют исследования об участии цитокинов в совокупности с микроэкологическими нарушениями (дисбиоз) в патологии различного генеза (воспалительные заболевания кишечника, метаболические нарушения, аутоиммунные заболевания, онкология и др.) [9]. В ранее проведенных нами исследованиях было показано, что при III степени дисбиоза толстого кишечника человека, сопровождающейся значительными качественно/количественными нарушениями в микросимбиоценозе, в копрофильтратах определялись такие цитокины, как TNFα, IFNγ и IL-10 наряду с многократным ростом антимикробных пептидов (лизоцим, лактоферрин) [1]. Вместе с тем представляет интерес определить насколько изменения в уровне про- и противовоспалительных цитокинов при выраженных нарушениях микросимбиоценоза кишечника связаны с формированием видовой структуры микросимбиоценозов.

Целью настоящей работы явилось исследование корреляционных связей локального уровня цитокинов в копрофильтратах и параметров микросимбиоценоза (видовой и количественный состав) при эубиозе и дисбиозе толстого кишечника человека.

Материалы и методы

Исследование 65 микросимбиоценозов кишечника человека от клинически здоровых людей осуществлялось классическим бактериологическим методом. Идентификацию облигатно-анаэробных (ОАБ) и факультативно-анаэробных бактерий и грибов проводили с помощью времяпролетной масс-спектрометрии MALDI TOF MS серии Microflex LT (Bruker Daltoniсs, Германия). Данное исследование проводилось на штаммах ОАБ (97 культур Bifidobacterium spp., 45 изолятов Bacteroides spp., 35 культур Cutibacterium acnes, 20 изолятов Clostridium spp.), факультативно-анаэробных бактерий (88 штаммов представителей семейства Enterobacteriaceae (Escherichia coli, Klebsiellae spp., Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter spp., Citrobacter freundii, Proteus mirabilis), 9 культур Streptococcus spp., 39 изолятов Staphylococcus spp., 15 штаммов Enterococcus faecium) и 42 культур Candida spp. Численность кишечных микросимбионтов выражали общим микробным числом (ОМЧ) и оценивали по количеству колоний на чашках, выражали в lg КОЕ/г. Копрофильтраты готовили с использованием ингибиторов протеаз: ингибитор соевых бобов, контрикал. Определение про- (TNFα, IFNγ, IL- 8) и противовоспалительных цитокинов (IL-10, IL- 1ra) в копрофильтратах проводилось методом ИФА с использованием реагентов «Вектор-Бест» (Россия). Результаты проведенных исследований обработаны методами вариационной статистики с использованием пакета прикладных программ Microsoft Excel и STATISTICA 10.0.

Результаты и обсуждение

Изменение структуры микросимбиоценоза в условиях дисбиоза происходило за счет снижения доли бифидобактерий, лактобактерий и энтерококков (в 2 раза и более, р ≤ 0,05) и увеличения доли представителей семейства Enterobacteriaceae, Staphylococcus spp., Streptococcus spp. и дрожжевых грибов (р ≤ 0,05), которая составляла 51,9±1,6% среди общего количества изолированных штаммов. При эубиозе обнаружена тенденция к формированию консорциумов из 3-4 видов бифидобактерий (в 75,0±2,3% случаев) и, напротив, у лиц с дисбиозом кишечника чаще встречался моновидовой вариант (77,8±1,0% случаев), (р ≤ 0,05). Представители рода Lactobacillus встречались при эубиозе также в составе консорциумов из 2-3 видов (в 75,0±1,8% случаев), тогда как при дисбиозе – преимущественно в моновидовом варианте (в 64,0±2,4% случаев).

При дисбиозе в микросимбиоценозе толстого кишечника монокультуры УПМ встречались редко (4,0±0,1%), в основном были характерны ассоциации (96,0±2,3% случаев) их двух (23,0±1,5%), трех (40,0±2,1%) и четырех (23,0±1,1%) культур, а также установлены консорциумы из пяти представителей УПМ (в 14,0±0,5%). В бактериальных и бактериально-грибковых ассоциациях при дисбиозе преобладали культуры E. coli (в 97,0±3,0% случаев), C. albicans (в 70,0±1,8% случаев), коагулазо-отрицательных стафилококков (S. epidermalis, S. equorum, S. saprophyticus) (в 31,0±1,5% случаев) и K. pneumonia (в 31,0±1,5% случаев). Тем самым при дисбиозе в структуре микросимбиоценоза увеличивается количество 3- и 4-компонентных ассоциаций условно-патогенных микроорганизмов и появляются 5-компонентные бактериально-грибковые ассоциации, не характерные для эубиоза. Таким образом, проведенные исследования показали значимую роль ассоциаций энтеробактерий с дрожжевыми грибами и стафилококками в развитии микроэкологических нарушений толстого кишечника обследуемых лиц. При этом увеличивалось количество ассоциаций, в состав которых входили клостридии.

Исследование корреляционных связей содержания цитокинов в копрофильтратах и численности кишечных микросимбионтов у обследуемых лиц при эубиозе и дисбиозе показало наличие некоторых отличий в характере и силе взаимосвязей между данными показателями. В условиях эубиоза (рис. 1А) были установлены наиболее значимые положительные связи между количеством бифидобактерий, энтерококков, облигатно-анаэробных бактерий и уровнем IL-10, IL-1ra: Bifidobacterium spp. и IL-10 (r = 0,80, p < 0,001), Bifidobacterium spp. и IL-1ra (r = 0,71, p < 0,001), Enterococcus spp. и IL-10 (r = 0,61, p < 0,001), ОАБ и IL-10 (r = 0,60, p < 0,001), а также между уровнем бифидобактерий и IFNγ (r = 0,69, p < 0,001).

 

Рисунок 1. Коэффициент (r) корреляционных связей показателей локального уровня цитокинов в копрофильтратах и численности микросимбионтов при эубиозе (А) и дисбиозе (Б) толстого кишечника человека / Figure 1. Coefficient (r) of correlations between indicators of the local level of cytokines in coprofiltrates and the number of microsymbionts in eubiosis (A) and dysbiosis (B) of the human large gut

 

Выявлялись и отрицательные корреляционные связи между уровнем дрожжевых грибов и IL-10 (r = -0,68, p < 0,001) и IFNγ (r = -0,61, p < 0,001).

Между остальными показателями связи носили как положительный, так и отрицательный характер, но были менее значимы – Lactobacillus spp. и IL-1ra (r = 0,50, p < 0,001), Enterococcus spp. и IFNγ (r = 0,52, p < 0,001), Bifidobacterium spp. и IL-8 (r = 0,50, p < 0,001), Bifidobacterium spp, Lactobacillus spp. и TNFα (r = -0,54, p < 0,001; r = -0,52, p < 0,001, соответственно), Candida spp. и IL-1ra, TNFα (r = -0,53, p < 0,001; r = 0,35, p < 0,05), Enterobacteriaceae и IL-10 (r = -0,50, p < 0,001), TNFα (r = 0,35, p < 0,05).

В условиях дисбиоза толстого кишечника анализ корреляционных связей исследуемых показателей (рис. 1Б) показал сохранение установленных при эубиозе значимых связей с увеличением значений их коэффициента корреляции (Bifidobacterium spp. и TNFα (r = -0,87, p < 0,001), ОАБ и IFNγ (r = 0,51, p < 0,001 против r = 0,25, p < 0,1 при эубиозе), Enterobacteriaceae и TNFα (r = 0,78, p < 0,001), Staphylococcus и TNFα (r = 0,50, p < 0,001 против r = 0,14, p < 0,1 при эубиозе), Candida spp. и TNFα (r = 0,58, p < 0,001).

Вместе с тем при дисбиозе изменялась направленность связей и определялись новые взаимосвязи. Например, изменялся характер связи у Bifidobacterium spp. и IFNγ (r = -0,72 при дисбиозе и r = 0,69 при эубиозе, p < 0,001), IL-10 (r = -0,58 при дисбиозе и r = 0,80 при эубиозе, p < 0,001), IL-1ra (r = -0,70 при дисбиозе и r = 0,71 при эубиозе, p < 0,001), а также у Lactobacillus spp. и IFNγ (r = -0,53 при дисбиозе и r = 0,47 при эубиозе, p < 0,001), IL-10 (r = -0,49 при дисбиозе и r = 0,48 при эубиозе, p < 0,001), IL-1ra (r = -0,57 при дисбиозе и r = 0,50 при эубиозе, p < 0,001), у Candida spp. и IFNγ (r = 0,69 при дисбиозе и r = -0,61 при эубиозе, p < 0,001), IL-1ra (r = 0,67 при дисбиозе и r = -0,53 при эубиозе, p < 0,001), у ОАБ и TNFα (r = 0,40 при дисбиозе и r = -0,45 при эубиозе, p < 0,001). Новые корреляционные связи отмечались для Staphylococcus и IFNγ (r = 0,50, p < 0,001), IL-8 (r = 0,50, p < 0,001), Enterobacteriaceae и IFNγ (r = 0,82, p < 0,001), IL-1ra (r = 0,52, p < 0,001).

Полученные в настоящем исследовании результаты свидетельствуют о тесном взаимодействии между кишечной микробиотой и цитокинами, что является одним из определяющих факторов формирования кишечного гомеостаза при эубиозе и нарушении его при дисбиозе с развитием иммунологических сдвигов на слизистых. Источниками происхождения цитокинов, в том числе определяющихся и в копрофильтратах, могут быть резидентные врожденные или адаптивные иммунные клетки, воспалительные клетки, инфильтрирующие ткани кишечника, а также сами эпителиальные клетки кишечника [6, 7, 8, 10]. Способность цитокинов непосредственно стимулировать или ограничивать пролиферацию кишечного эпителия, апоптоз и проницаемость делает их ключевыми игроками в поддержании, а иногда и в нарушении кишечного эпителиального барьера [2]. Кроме того, высвобождение цитокинов и хемокинов кишечным эпителием в ответ на микробиоту, взаимодействие с другими типами клеток и пищевыми соединениями позволяет цитокинам регулировать микроокружение клеток в кишечнике. Например, генетическая делеция IL-10 вызывала спонтанный колит у мышей, что указывало на участие этого цитокина в регуляции гомеостаза толстого кишечника. Однако ряд других цитокинов, включая IL-6, TNF, IL-18, IL-1β и IL-17, экспрессируясь при воспалении кишечника, способствуют повреждению слизистой кишечника [8]. Выявленные в настоящей работе значимые связи количества и вида микросимбионтов с уровнем IFNγ подтверждают роль данного цитокина в регуляции проницаемости кишечного эпителия, как при эубиозе, так и дисбиозе. Считается, что увеличение проницаемости кишечного эпителия, индуцированное IFNγ, представляет собой наглядный пример сложных взаимосвязей между цитокинами, эпителием и иммунными клетками [11]. Установленные связи параметров микробиоты с уровнем IL- 10 подтверждают роль данных взаимодействий в кишечном гомеостазе, поскольку основными продуцентами IL-10 в кишечнике являются макрофаги и регуляторные Т-клетки, которые при участии антигенов кишечных микросимбионтов формируют цитокиновые сети, обеспечивающие локальную иммуносупрессию и иммунную толерантность к нормобиоте [4].

Заключение

Результаты сравнительного исследования корреляционных связей между показателями микросимбиоценоза при эу-/дисбиозе толстого кишечника человека и количественными изменениями про-/противовоспалительных цитокинов в копрофильтратах позволили сделать следующие выводы:

1. При дисбиозе толстого кишечника изменялась направленность взаимосвязей и определялись новые значимые корреляционные связи между параметрами микросимбиоценоза кишечника человека (увеличение количества и ассоциаций УПМ) и уровнем про-/противовоспалительных цитокинов в копрофильтратах.
2. Численность, состав микросимбиоценоза и локальный профиль цитокинов можно рассматривать как фактор, определяющий состояние гомеостаза кишечника человека при эу- и дисбиозе.

Об авторах

Таисия Александровна Бондаренко

ФГБУН «Оренбургский федеральный исследовательский центр» УрО РАН

Email: semenovih88@mail.ru

научный сотрудник лаборатории инфекционной симбиологии, Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук

Россия, 460000, Оренбург, ул. Пионерская, 11

Елена Валерьевна Иванова

ФГБУН «Оренбургский федеральный исследовательский центр» УрО РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: walerewna13@gmail.com

д.м.н., доцент, ведущий научный сотрудник лаборатории инфекционной симбиологии, Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук

Россия, 460000, Оренбург, ул. Пионерская, 11

Анастасия Владимировна Бекпергенова

ФГБУН «Оренбургский федеральный исследовательский центр» УрО РАН

Email: nsavasteeva@gmail.com

к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории инфекционной симбиологии, Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук

Россия, 460000, Оренбург, ул. Пионерская, 11

Ирина Николаевна Чайникова

ФГБУН «Оренбургский федеральный исследовательский центр» УрО РАН

Email: inchainicova@yandex.ru

д.м.н., профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории инфекционной симбиологии, Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук

Россия, 460000, Оренбург, ул. Пионерская, 11

Ольга Ефимовна Челпаченко

ФГБУН «Оренбургский федеральный исследовательский центр» УрО РАН

Email: oech57@gmail.com

д.м.н., профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории инфекционной симбиологии, Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук

Россия, 460000, Оренбург, ул. Пионерская, 11

Игорь Александрович Никифоров

ФГБУН «Оренбургский федеральный исследовательский центр» УрО РАН

Email: ianikiforov@rambler.ru

к.г.-м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории инфекционной симбиологии, Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук

Россия, 460000, Оренбург, ул. Пионерская, 11

Ирина Александровна Здвижкова

ФГБУН «Оренбургский федеральный исследовательский центр» УрО РАН

Email: zdvizhkova.irina@gmail.com

научный сотрудник лаборатории инфекционной симбиологии, Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук

Россия, 460000, Оренбург, ул. Пионерская, 11

Список литературы

Дополнительные файлы