Relationships between cytokines and the amounts of microsymbionts in microecological disorders of the human intestine

Taisiay A. Bondarenko; Бондаренко Таисия Александровна; Elena V. Ivanova; Иванова Елена Валерьевна; Anastasia V. Bekpergenova; Бекпергенова Анастасия Владимировна; Irina N. Chaynikova; Чайникова Ирина Николаевна; Olga E. Chelpachenko; Челпаченко Ольга Ефимовна; Igor A. Nikiforov; Никифоров Игорь Александрович; Irina A. Zdvizhkova; Здвижкова Ирина Александровна

doi:10.46235/1028-7221-1112-RBC

Relationships between cytokines and the amounts of microsymbionts in microecological disorders of the human intestine

Authors: Bondarenko T.A.¹, Ivanova E.V.¹, Bekpergenova A.V.¹, Chaynikova I.N.¹, Chelpachenko O.E.¹, Nikiforov I.A.¹, Zdvizhkova I.A.¹
Affiliations:
1. Orenburg Federal Research Center, Ural Branch, Russian Academy of Sciences
Issue: Vol 25, No 2 (2022)
Pages: 125-130
Section: SHORT COMMUNICATIONS
Submitted: 13.05.2022
Accepted: 28.05.2022
Published: 01.09.2022
URL: https://rusimmun.ru/jour/article/view/1112
DOI: https://doi.org/10.46235/1028-7221-1112-RBC
ID: 1112

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Cytokines and chemokines, as well as gut microsymbionts, are sufficient participants in the intercellular communications, thus supporting homeostasis of gut mucosa. However, these components may be of key significance for intestinal inflammation and damage to epithelial barrier. This work expands the understanding of the relationships between intestinal microbial communities and the local cytokine network of the host. The paper presents the results of the correlation analysis between total microbial number of intestinal microsymbionts and the level of pro- (TNFα, IFNγ, IL-8) and anti-inflammatory cytokines (IL-10, IL- 1ra) in coprofiltrates obtained from clinically healthy people examined for gut dysbiosis. Determination of cytokines in coprofiltrates was carried out by ELISA technique (JSC Vector-Best, Russia). The study of 65 microsymbiocenoses of the human gut was carried out by classical bacteriological methods. Identification of obligate-anaerobic, facultative-anaerobic bacteria and fungi was carried out by time-of-flight mass spectrometry using MALDI TOF-MS Microflex LT series (Bruker Daltonians, Germany). These studies have revealed the leading role of associations between enterobacteria, fungi and representatives of the Staphylococcus genus in gut dysbiosis. In general composition of the obligate-anaerobic association, we have observed a change of consortia from several types of Bifidobacteria and Lactobacilli in eubiotic state to a monoid variant in dysbiosis. At the same time, the number of associations that included Clostridia was increased. The analysis of correlations between cytokine indices and the number of gut microbiota showed persistance of significant associations established during eubiosis under dysbiosis conditions, with an increase in their correlation coefficient: Bifidobacterium spp., Enterobacteriaceae, Staphylococcus spp., Candida spp. and TNFα. At the same time, in dysbiosis, the direction of the connections changed, and new correlations were determined: for Staphylococcus spp. and IFNγ; Staphylococcus spp. and IL-8; Enterobacteriaceae and IL-1ra, IFNγ. The established features of correlations between indices of microsymbiocenosis and quantitative changes in cytokines allow us to consider the number, composition of microsymbiocenosis and cytokine profile as factors that may affect the state of gut homeostasis in eu- and dysbiosis.

Keywords

gut microsymbionts, cytokines, coprofiltrates, correlation, dysbiosis

Full Text

Введение

Кишечник является самым большим барьером для внешней среды и вместилищем значительного количества иммунных клеток и микробиоты по сравнению с любым другим биотопом в организме человека. Здоровый микробиом функционирует так же, как и любой другой орган человеческого организма, и представляет собой сложную экосистему, в которой сотни видов сосуществуют друг с другом и с клетками хозяина. Кишечный эпителий отвечает за широкий спектр важнейших функций, включая поддержание целостности барьера, предотвращение проникновения условно-патогенных микроорганизмов (УПМ) и патогенов, а также модулирование иммунной системы кишечника [5]. Связь между эпителиальными клетками, микробиотой и иммунными клетками кишечника имеет решающее значение для поддержания гомеостаза и координации соответствующих реакций в ответ на действие различных факторов и может происходить посредством межклеточного контакта или путем высвобождения регуляторных молекул [3]. Цитокины и хемокины, кишечные микросимбионты, являясь необходимыми участниками межклеточных коммуникаций, поддерживают гомеостаз слизистой оболочки кишечника, но вместе с тем могут быть ключевыми факторами воспаления кишечника и повреждения эпителиального барьера [7, 10]. Особенности взаимодействия кишечных микроорганизмов и цитокиновой сети человека наряду с другими механизмами могут влиять на регуляцию системы «микросимбиоценоз-хозяин», о чем свидетельствуют исследования об участии цитокинов в совокупности с микроэкологическими нарушениями (дисбиоз) в патологии различного генеза (воспалительные заболевания кишечника, метаболические нарушения, аутоиммунные заболевания, онкология и др.) [9]. В ранее проведенных нами исследованиях было показано, что при III степени дисбиоза толстого кишечника человека, сопровождающейся значительными качественно/количественными нарушениями в микросимбиоценозе, в копрофильтратах определялись такие цитокины, как TNFα, IFNγ и IL-10 наряду с многократным ростом антимикробных пептидов (лизоцим, лактоферрин) [1]. Вместе с тем представляет интерес определить насколько изменения в уровне про- и противовоспалительных цитокинов при выраженных нарушениях микросимбиоценоза кишечника связаны с формированием видовой структуры микросимбиоценозов.

Целью настоящей работы явилось исследование корреляционных связей локального уровня цитокинов в копрофильтратах и параметров микросимбиоценоза (видовой и количественный состав) при эубиозе и дисбиозе толстого кишечника человека.

Материалы и методы

Исследование 65 микросимбиоценозов кишечника человека от клинически здоровых людей осуществлялось классическим бактериологическим методом. Идентификацию облигатно-анаэробных (ОАБ) и факультативно-анаэробных бактерий и грибов проводили с помощью времяпролетной масс-спектрометрии MALDI TOF MS серии Microflex LT (Bruker Daltoniсs, Германия). Данное исследование проводилось на штаммах ОАБ (97 культур Bifidobacterium spp., 45 изолятов Bacteroides spp., 35 культур Cutibacterium acnes, 20 изолятов Clostridium spp.), факультативно-анаэробных бактерий (88 штаммов представителей семейства Enterobacteriaceae (Escherichia coli, Klebsiellae spp., Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter spp., Citrobacter freundii, Proteus mirabilis), 9 культур Streptococcus spp., 39 изолятов Staphylococcus spp., 15 штаммов Enterococcus faecium) и 42 культур Candida spp. Численность кишечных микросимбионтов выражали общим микробным числом (ОМЧ) и оценивали по количеству колоний на чашках, выражали в lg КОЕ/г. Копрофильтраты готовили с использованием ингибиторов протеаз: ингибитор соевых бобов, контрикал. Определение про- (TNFα, IFNγ, IL- 8) и противовоспалительных цитокинов (IL-10, IL- 1ra) в копрофильтратах проводилось методом ИФА с использованием реагентов «Вектор-Бест» (Россия). Результаты проведенных исследований обработаны методами вариационной статистики с использованием пакета прикладных программ Microsoft Excel и STATISTICA 10.0.

Результаты и обсуждение

Изменение структуры микросимбиоценоза в условиях дисбиоза происходило за счет снижения доли бифидобактерий, лактобактерий и энтерококков (в 2 раза и более, р ≤ 0,05) и увеличения доли представителей семейства Enterobacteriaceae, Staphylococcus spp., Streptococcus spp. и дрожжевых грибов (р ≤ 0,05), которая составляла 51,9±1,6% среди общего количества изолированных штаммов. При эубиозе обнаружена тенденция к формированию консорциумов из 3-4 видов бифидобактерий (в 75,0±2,3% случаев) и, напротив, у лиц с дисбиозом кишечника чаще встречался моновидовой вариант (77,8±1,0% случаев), (р ≤ 0,05). Представители рода Lactobacillus встречались при эубиозе также в составе консорциумов из 2-3 видов (в 75,0±1,8% случаев), тогда как при дисбиозе – преимущественно в моновидовом варианте (в 64,0±2,4% случаев).

При дисбиозе в микросимбиоценозе толстого кишечника монокультуры УПМ встречались редко (4,0±0,1%), в основном были характерны ассоциации (96,0±2,3% случаев) их двух (23,0±1,5%), трех (40,0±2,1%) и четырех (23,0±1,1%) культур, а также установлены консорциумы из пяти представителей УПМ (в 14,0±0,5%). В бактериальных и бактериально-грибковых ассоциациях при дисбиозе преобладали культуры E. coli (в 97,0±3,0% случаев), C. albicans (в 70,0±1,8% случаев), коагулазо-отрицательных стафилококков (S. epidermalis, S. equorum, S. saprophyticus) (в 31,0±1,5% случаев) и K. pneumonia (в 31,0±1,5% случаев). Тем самым при дисбиозе в структуре микросимбиоценоза увеличивается количество 3- и 4-компонентных ассоциаций условно-патогенных микроорганизмов и появляются 5-компонентные бактериально-грибковые ассоциации, не характерные для эубиоза. Таким образом, проведенные исследования показали значимую роль ассоциаций энтеробактерий с дрожжевыми грибами и стафилококками в развитии микроэкологических нарушений толстого кишечника обследуемых лиц. При этом увеличивалось количество ассоциаций, в состав которых входили клостридии.

Исследование корреляционных связей содержания цитокинов в копрофильтратах и численности кишечных микросимбионтов у обследуемых лиц при эубиозе и дисбиозе показало наличие некоторых отличий в характере и силе взаимосвязей между данными показателями. В условиях эубиоза (рис. 1А) были установлены наиболее значимые положительные связи между количеством бифидобактерий, энтерококков, облигатно-анаэробных бактерий и уровнем IL-10, IL-1ra: Bifidobacterium spp. и IL-10 (r = 0,80, p < 0,001), Bifidobacterium spp. и IL-1ra (r = 0,71, p < 0,001), Enterococcus spp. и IL-10 (r = 0,61, p < 0,001), ОАБ и IL-10 (r = 0,60, p < 0,001), а также между уровнем бифидобактерий и IFNγ (r = 0,69, p < 0,001).

Рисунок 1. Коэффициент (r) корреляционных связей показателей локального уровня цитокинов в копрофильтратах и численности микросимбионтов при эубиозе (А) и дисбиозе (Б) толстого кишечника человека / Figure 1. Coefficient (r) of correlations between indicators of the local level of cytokines in coprofiltrates and the number of microsymbionts in eubiosis (A) and dysbiosis (B) of the human large gut

Выявлялись и отрицательные корреляционные связи между уровнем дрожжевых грибов и IL-10 (r = -0,68, p < 0,001) и IFNγ (r = -0,61, p < 0,001).

Между остальными показателями связи носили как положительный, так и отрицательный характер, но были менее значимы – Lactobacillus spp. и IL-1ra (r = 0,50, p < 0,001), Enterococcus spp. и IFNγ (r = 0,52, p < 0,001), Bifidobacterium spp. и IL-8 (r = 0,50, p < 0,001), Bifidobacterium spp, Lactobacillus spp. и TNFα (r = -0,54, p < 0,001; r = -0,52, p < 0,001, соответственно), Candida spp. и IL-1ra, TNFα (r = -0,53, p < 0,001; r = 0,35, p < 0,05), Enterobacteriaceae и IL-10 (r = -0,50, p < 0,001), TNFα (r = 0,35, p < 0,05).

В условиях дисбиоза толстого кишечника анализ корреляционных связей исследуемых показателей (рис. 1Б) показал сохранение установленных при эубиозе значимых связей с увеличением значений их коэффициента корреляции (Bifidobacterium spp. и TNFα (r = -0,87, p < 0,001), ОАБ и IFNγ (r = 0,51, p < 0,001 против r = 0,25, p < 0,1 при эубиозе), Enterobacteriaceae и TNFα (r = 0,78, p < 0,001), Staphylococcus и TNFα (r = 0,50, p < 0,001 против r = 0,14, p < 0,1 при эубиозе), Candida spp. и TNFα (r = 0,58, p < 0,001).

Вместе с тем при дисбиозе изменялась направленность связей и определялись новые взаимосвязи. Например, изменялся характер связи у Bifidobacterium spp. и IFNγ (r = -0,72 при дисбиозе и r = 0,69 при эубиозе, p < 0,001), IL-10 (r = -0,58 при дисбиозе и r = 0,80 при эубиозе, p < 0,001), IL-1ra (r = -0,70 при дисбиозе и r = 0,71 при эубиозе, p < 0,001), а также у Lactobacillus spp. и IFNγ (r = -0,53 при дисбиозе и r = 0,47 при эубиозе, p < 0,001), IL-10 (r = -0,49 при дисбиозе и r = 0,48 при эубиозе, p < 0,001), IL-1ra (r = -0,57 при дисбиозе и r = 0,50 при эубиозе, p < 0,001), у Candida spp. и IFNγ (r = 0,69 при дисбиозе и r = -0,61 при эубиозе, p < 0,001), IL-1ra (r = 0,67 при дисбиозе и r = -0,53 при эубиозе, p < 0,001), у ОАБ и TNFα (r = 0,40 при дисбиозе и r = -0,45 при эубиозе, p < 0,001). Новые корреляционные связи отмечались для Staphylococcus и IFNγ (r = 0,50, p < 0,001), IL-8 (r = 0,50, p < 0,001), Enterobacteriaceae и IFNγ (r = 0,82, p < 0,001), IL-1ra (r = 0,52, p < 0,001).

Полученные в настоящем исследовании результаты свидетельствуют о тесном взаимодействии между кишечной микробиотой и цитокинами, что является одним из определяющих факторов формирования кишечного гомеостаза при эубиозе и нарушении его при дисбиозе с развитием иммунологических сдвигов на слизистых. Источниками происхождения цитокинов, в том числе определяющихся и в копрофильтратах, могут быть резидентные врожденные или адаптивные иммунные клетки, воспалительные клетки, инфильтрирующие ткани кишечника, а также сами эпителиальные клетки кишечника [6, 7, 8, 10]. Способность цитокинов непосредственно стимулировать или ограничивать пролиферацию кишечного эпителия, апоптоз и проницаемость делает их ключевыми игроками в поддержании, а иногда и в нарушении кишечного эпителиального барьера [2]. Кроме того, высвобождение цитокинов и хемокинов кишечным эпителием в ответ на микробиоту, взаимодействие с другими типами клеток и пищевыми соединениями позволяет цитокинам регулировать микроокружение клеток в кишечнике. Например, генетическая делеция IL-10 вызывала спонтанный колит у мышей, что указывало на участие этого цитокина в регуляции гомеостаза толстого кишечника. Однако ряд других цитокинов, включая IL-6, TNF, IL-18, IL-1β и IL-17, экспрессируясь при воспалении кишечника, способствуют повреждению слизистой кишечника [8]. Выявленные в настоящей работе значимые связи количества и вида микросимбионтов с уровнем IFNγ подтверждают роль данного цитокина в регуляции проницаемости кишечного эпителия, как при эубиозе, так и дисбиозе. Считается, что увеличение проницаемости кишечного эпителия, индуцированное IFNγ, представляет собой наглядный пример сложных взаимосвязей между цитокинами, эпителием и иммунными клетками [11]. Установленные связи параметров микробиоты с уровнем IL- 10 подтверждают роль данных взаимодействий в кишечном гомеостазе, поскольку основными продуцентами IL-10 в кишечнике являются макрофаги и регуляторные Т-клетки, которые при участии антигенов кишечных микросимбионтов формируют цитокиновые сети, обеспечивающие локальную иммуносупрессию и иммунную толерантность к нормобиоте [4].

Заключение

Результаты сравнительного исследования корреляционных связей между показателями микросимбиоценоза при эу-/дисбиозе толстого кишечника человека и количественными изменениями про-/противовоспалительных цитокинов в копрофильтратах позволили сделать следующие выводы:

При дисбиозе толстого кишечника изменялась направленность взаимосвязей и определялись новые значимые корреляционные связи между параметрами микросимбиоценоза кишечника человека (увеличение количества и ассоциаций УПМ) и уровнем про-/противовоспалительных цитокинов в копрофильтратах.
Численность, состав микросимбиоценоза и локальный профиль цитокинов можно рассматривать как фактор, определяющий состояние гомеостаза кишечника человека при эу- и дисбиозе.