Отправить статью по E-mail Клеточный иммунный ответ на ДНК-вакцину, кодирующую рецептор-связывающий домен белка S вируса SARS-CoV-2, в зависимости от способа упаковки
- Авторы: Боргоякова М.Б.1, Карпенко Л.И.1, Старостина Е.В.1, Волосникова Е.А.1, Задорожный А.М.1, Орлова Л.А.1, Ильичев А.А.1
-
Учреждения:
- ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора
- Выпуск: Том 25, № 2 (2022)
- Страницы: 131-138
- Раздел: КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
- Дата подачи: 13.05.2022
- Дата принятия к публикации: 03.06.2022
- Дата публикации: 01.09.2022
- URL: https://rusimmun.ru/jour/article/view/1114
- DOI: https://doi.org/10.46235/1028-7221-1114-CIR
- ID: 1114
Цитировать
Полный текст
Аннотация
Массовая вакцинация против SARS-CoV-2 представляется одним из наиболее важных этапов на пути разрешения проблемы пандемии COVID-19, которая за два с половиной года унесла жизни миллионов человек. Для создания анти-COVID-19 вакцин были задействованы как традиционные подходы (инактивированные вакцины), так и инновационные, благодаря чему на рынке появились вакцины на основе нуклеиновых кислот (мРНК-, ДНК-вакцины). Мы сконструировали плазмиду (ДНК-вакцину), кодирующую ген рецептор-связывающего домена (RBD) белка шипа (S) вируса SARS-CoV-2. Данная ДНК-вакцина была названа pVAXrbd. Для упаковки pVAXrbd был использован поликатионный носитель полиглюкин-спермидин (PGS), а также его конъюгат с рекомбинантным белком RBD (PGS-RBD). При добавлении отрицательно заряженной плазмидой ДНК pVAXrbd к поликатионным молекулам PGS или PGS-RBD, происходило формирование комплексов полимеров с плазмидной ДНК путем самосборки за счет нековалентного взаимодействия. Целью данной работы было исследование клеточного ответа, индуцированного ДНК-вакциной в различных вариантах упаковки, а также анализ вклада упаковки в развитие иммунного ответа. Мышам линии BALB/c вводили ДНК-вакцину в трех вариантах: «голую» рVAXrbd; плазмиду pVAXrbd в оболочке PGS; pVAXrbd в оболочке PGS-RBD. В качестве контроля животным вводили рекомбинантный белок RBD. Клеточный ответ оценивали по продукции IFNγ с помощью двух методов – ELISpot и ICS с использованием проточной цитометрией. Было показано, что ДНК-вакцина pVAXrbd как сама по себе, так и в составе комплексов, обладает способностью индуцировать клеточный иммунный ответ. Наиболее эффективный клеточный ответ был обнаружен в группе животных, иммунизированных комплексом pVAXrbd-PGS. С помощью метода ELISpot для этой группы было зарегистрировано наибольшее количество клеток, ответивших выбросом IFNγ на стимуляцию специфическими пептидами; с помощью ICS и проточной цитометрии для этой группы был показан больший процент IFNγ-продуцирующих CD4+ и CD8+Т-клеток. Этот эффект, по-видимому, связан с тем, что оболочка из полиглюкин-спермидина защищает ДНК от действия нуклеаз, а комплексы pVAXrbd-PGS более эффективно узнаются антигенпрезентирующими клетками, чем голая плазмидная ДНК. Представленные результаты показывают, что оболочка из полиглюкин-спермидина обеспечивает повышение иммуногенности ДНК-вакцины pVAXrbd в отношении вирус-специфического Т-клеточного ответа.
Ключевые слова
Полный текст
Исследование было выполнено при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (соглашение № 075-15-2019-1665).
Введение
Вирус SARS-CoV-2, вызывающий острый респираторный синдром COVID-19, впервые был обнаружен в г. Ухань, в Китае, в декабре 2019 года. С самого начала многие страны предприняли беспрецедентные меры по ограничению распространения заболевания. Вакцинация – одна из таких мер, призванная не только ограничить распространение инфекции в популяции, но и облегчить течение болезни при заражении. Для создания анти-COVID-19 вакцин были задействованы как традиционные подходы (инактивированные вакцины), так и инновационные, благодаря чему на рынке появились вакцины на основе нуклеиновых кислот (мРНК, ДНК) [11]. Одной из отличительных особенностей вакцин, основанных на нуклеиновых кислотах, является их способность индуцировать кроме гуморального эффективный клеточный иммунитет, в том числе цитотоксический. Как показывают различные исследования, для защиты от инфекции, вызываемой SARS-CoV-2, необходима стимуляция обоих звеньев иммунитета [5]. У пациентов с бессимптомной и легкой формой заболевания COVID-19 в отсутствие антител были выявлены высокие уровни специфических цитотоксических Т-лимфоцитов [7, 10], что подтверждает важность Т-клеточного ответа в блокировании инфекции.
В настоящее время несколько ДНК-вакцин против SARS-CoV-2 проходят клинические испытания, одна из них зарегистрирована и используется для вакцинации населения в Индии [1, 4, 6, 9]. Недостатком ДНК-вакцин является их низкая иммуногенность при введении в виде голой плазмидной ДНК, поэтому многие исследовали работают над разработкой эффективных и безопасных средств доставки.
Мы сконструировали плазмиду pVAXrbd (ДНК-вакцину), кодирующую ген рецепторсвязывающего домена (RBD) белка шипа (S) вируса SARS-CoV-2. В качестве упаковки был использован поликатионный носитель полиглюкин-спермидин, а также его конъюгат с рекомбинантным белком RBD, наработанным в клетках CHO-K1.
Целью данной работы было исследование клеточного ответа, индуцированного ДНК-вакциной pVAXrbd, а также анализ вклада ее упаковки в развитие иммунного ответа.
Материалы и методы
Конструирование плазмиды pVAXrbd было описано ранее [2]. Последовательность гена, кодирующего белок RBD, была клонирована в составе эукариотического плазмидного вектора pVAX. Полученную плазмиду (ДНК-вакцину) обозначили pVAXrbd. Для оценки способности pVAXrbd обеспечивать синтез целевого белка в эукариотических клетках проводили трансфекцию клеток HEK-293T. Трансфицированные клетки были исследованы на наличие белка RBD с помощью иммуноблотинга с высокотитражной сывороткой к RBD, а также на наличие специфической мРНК путем ОТ-ПЦР с использованием специфических праймеров. Оба метода показали, что экспрессия гена, кодирующего RBD, эффективно проходит как на уровне РНК, так и на уровне белка в эукариотических клетках.
Наработка белка RBD в клетках CHO-K1 и его иммуногенные свойства, а также получение конъюгатов данного белка с поликатионным носителем полиглюкин-спермидином были описаны нами ранее [8]. При добавлении отрицательно заряженной плазмидой ДНК pVAXrbd к положительно заряженным полимерам – полиглюкин-спермидин (PGS) или его конъюгат с белком RBD (PGS-RBD) происходило формирование комплексов поликатионов с плазмидной ДНК путем самосборки за счет нековалентного взаимодействия. Таким образом, мы получили два типа частиц: pVAXrbd-PGS и CCV-RBD (CCV – combined coronavirus vaccine), в центре каждой из которых находилась ДНК-вакцина pVAXrbd. Образованные частицы были проанализированы с помощью электронной микроскопии, электрофореза в агарозном геле и гель-фильтрации [3].
Для оценки иммуногенности созданных конструкций использовали самок мышей BALB/c массой 16-18 г. Все эксперименты с животными проводили с соблюдением принципов гуманности в соответствии с протоколами, утвержденными Биоэтическим комитетом ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (номер разрешения: НИЦ ВБ «Вектор» / 10.09.2020). Мышей разделили на группы по 8 животных в каждой и иммунизировали следующим образом: группа CCV-RBD – комбинированной вакциной, содержащей 100 мкг ДНК и 100 мкг белка; группа pVAXrbd-PGS – 100 мкг плазмиды pVAXrbd, инкапсулированной в оболочку из PGS; группа pVAXrbd – 100 мкг «голая» ДНК-вакцина; группа RBD – 100 мкг белка RBD. В группе intact были неиммунизированные животные. Мышей иммунизировали внутримышечно дважды с интервалом три недели в бедро задней конечности. Спустя 10 дней после второй иммунизации у животных были взяты селезенки для исследования Т-клеточного иммунного ответа.
Селезенки последовательно измельчали на нейлоновых фильтрах для клеток с диаметром пор 70 и 40 мкм (BD FalconTM, США). После лизиса эритроцитов лизирующим буфером (Sigma, США) спленоциты дважды отмывали в среде RPMI и помещали в 1 мл RPMI с 2 мМ L-глутамина, гентамицина (50 мкг/мл) и 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) (ThermoFisherScientific, США). Клетки подсчитывали с помощью автоматического счетчика клеток TC20™ (Bio-Rad, США).
ELISpot анализ проводили с использованием набора Mouse IFN-gamma ELISpot kit (BD, США), согласно инструкции производителя. Спленоциты вносили в лунки в количестве 5 × 105 клеток/лунка. Для стимуляции использовали пул пептидов, рестриктируемых MHC класса I (H-2-Dd, H-2-Kd, H-2-Ld) и II (H2-IAd, H2-IEd) мышей BALB/c из последовательности рецепторсвязывающего домена S-белка SARS-CoV-2, в концентрации 20 мкг/мл для каждого пептида. Пептиды были рассчитаны с помощью инструментов IEDB Analysis Resourse и синтезированы компанией AtaGenix Laboratories (Китай), чистота пептидов составляла более 80%. В качестве отрицательного контроля использовали нестимулированные клетки, а в качестве положительного – клетки, к которым добавляли конканавалин А. Число IFNγ-продуцирующих клеток подсчитывали с помощью ELISpot-ридера (Carl Zeiss, Германия).
Окрашивание внутриклеточных цитокинов проводили следующим образом: спленоцины вносили в лунки 24-луночных культуральных планшетов (TPP, Швейцария) в количестве 2 × 106 клеток/лунку и стимулировали смесью вирус-специфических пептидов, указанной выше, в концентрации 20 мкг/мл для каждого пептида. Клетки инкубировали в течение 4 часов при 37 °C в 5% CO2, после чего вносили брефельдин A (5 мкг/мл, GolgiPlug BD Biosciences) и продолжали инкубацию еще в течение 16 часов. На следующий день клетки окрашивали анти-CD3 Alexa Fluor 700 (BD, США), анти-CD4 BV786 (BD, США) и анти-CD8 FITC (BD, США) антителами и фиксировали с использованием 1%-ного раствора параформальдегида. Для обнаружения внутриклеточных цитокинов к клеткам добавляли анти-IFNγ APC антитела (BD, США). Образцы анализировали на проточном цитофлуориметре ZE5 (Bio-Rad, США), результаты обрабатывали с помощью программы Everest.
Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием непараметрического анализа Манна–Уитни в программе GraphPadPrism 6.0, при p <0,05 различия считали статистически значимыми.
Результаты и обсуждение
Целью данной работы было исследование клеточного ответа, индуцированного ДНК-вакциной в различных вариантах упаковки, а также анализ вклада упаковки в развитие иммунного ответа. Мышам линии BALB/c вводили ДНК-вакцину в трех вариантах: «голую» рVAXrbd; плазмиду pVAXrbd в оболочке PGS; pVAXrbd в оболочке PGS-RBD. В качестве контроля животным вводили рекомбинантный белок RBD. Клеточный ответ оценивали по продукции IFNγ с помощью двух методов – ELISpot и ICS с использованием проточной цитометрии.
С помощью метода ELISpot оценивали количество спленоцитов, продуцирующих IFNγ в ответ на специфическую стимуляцию пулом пептидов из белка RBD. Было показано, что наиболее высокий показатель клеточного иммунитета был зарегистрирован в группе животных, иммунизированных ДНК-вакциной в оболочке из PGS (рис. 1).
Рисунок 1. Число спленоцитов, продуцирующих IFNγ в ответ на специфическую стимуляцию, на 106 клеток, определенное с помощью ELISpot. Примечание. Слева – данные представлены как средние ± стандартное отклонение. Справа – типичный вид спотов для каждой группы иммунизированных животных. / Figure 1. Number of splenocytes producing IFNγ in response to specific stimulation, per 106 cells, determined using ELISpot. Note. On the left, data are presented as means ± standard deviation. On the right is a typical spot view for each group of the immunized animals.
Средний уровень SFU на 106 спленоцитов составил 172 для группы pVAXrbd-PGS и 125 для группы pVAXrbd, тогда как для группы CCV-RBD он составил 41, а показатели группы, иммунизированной белком, сравнимы с показателями группы интактных мышей. Более высокий уровень IFNγ-продуцирующих клеток в группе, иммунизированной плазмидой в оболочке из PGS, возможно, связан с тем, что полиглюкин-спермидин защищает ДНК от действия нуклеаз и повышает эффективность трансфекции за счет нейтрализации отрицательного заряда нуклеиновой кислоты. Наиболее низкий ответ по данным ELISPot был зафиксирован в группе мышей, иммунизированных комплексом pVAXrbd в оболочке PGS-RBD (CCV-RBD). Однако он достоверно не отличался от клеточного ответа, обнаруженного у группы животных, иммунизированных голой pVAXrbd.
Чтобы получить более полное представление об активации разных субпопуляций Т-клеток, мы оценили процент IFNγ-продуцирующих CD4+ и CD8+Т-лимфоцитов с помощью метода внутриклеточного окрашивания цитокинов (ICS) и проточной цитометрии (рис. 2).
Рисунок 2. Процент SARS-CoV-2-специфических IFNγ-продуцирующих CD4+ и CD8+Т-клеток, определенный с помощью ICS с использованием проточной цитометрии. Примечание. Графики выполнены в программе GraphPad Prism 8.0, данные представлены как разброс значений от минимальных к максимальным с обозначением средних. / Figure 2. Percentage of SARS-CoV-2-specific IFNγ-producing CD4+ and CD8+T cells determined by ICS using flow cytometry. Note. The graphs were created with GraphPad Prism 8.0 software, the data are presented as a spread of values from minimum to maximum with the designation of the average values.
Как видно из рисунка 2, наибольшее количество CD4+ и CD8+ лимфоцитов, способных синтезировать IFNγ в ответ на стимуляцию вирус-специфическими пептидами, выявлено в группе мышей, иммунизированных pVAXrbd в оболочке с PGS или PGS-RBD. По-видимому, оболочка из поликатионных конъюгатов способна обеспечить более эффективную доставку ДНК-вакцины в антигенпрезентирующие клетки. Количество IFNγ-продуцирующих CD4+ и CD8+ ответ у животных, иммунизированных только белком RBD, было на уровне, выявленном у контрольной группы интактных животных. Введение животным только белка RBD не привело к значимому формированию специфического Т-клеточного иммунитета.
Заключение
Таким образом, ДНК-вакцина pVAXrbd, кодирующая рецептор-связывающий домен белка S вируса SARS-CoV-2, обладает способностью индуцировать клеточный иммунный ответ. Композиция данной плазмиды с поликатионным носителем полиглюкин-спермидин приводит к усилению клеточного ответа, что было показано с помощью ELISpot и ICS. Добавление белка на поверхности композиции также приводит к формированию специфического CD4+ и CD8+ ответа. pVAXrbd можно рассматривать как основу для создания различных комбинированных вакцин против COVID-19.
Об авторах
Мария Борисовна Боргоякова
ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора
Автор, ответственный за переписку.
Email: borgoyakova_mb@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0002-0768-1561
SPIN-код: 8588-7391
Scopus Author ID: 57221732585
младший научный сотрудник Центра геномных исследований мирового уровня по обеспечению биологической безопасности и технологической независимости в рамках Федеральной научно-технической программы развития генетических технологий
Россия, 630559, Новосибирская обл., р. п. КольцовоЛариса Ивановна Карпенко
ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора
Email: karpenko@vector.nsc.ru
д.б.н., доцент, ведущий научный сотрудник Центра геномных исследований мирового уровня по обеспечению биологической безопасности и технологической независимости в рамках Федеральной научно-технической программы развития генетических технологий
Россия, 630559, Новосибирская обл., р. п. КольцовоЕкатерина Владимировна Старостина
ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора
Email: starostina_ev@vector.nsc.ru
к.б.н., научный сотрудник Центра геномных исследований мирового уровня по обеспечению биологической безопасности и технологической независимости в рамках Федеральной научно-технической программы развития генетических технологий
Россия, 630559, Новосибирская обл., р. п. КольцовоЕкатерина Александровна Волосникова
ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора
Email: volosnikova_ea@vector.nsc.ru
к.б.н., ведущий научный сотрудник Центра геномных исследований мирового уровня по обеспечению биологической безопасности и технологической независимости в рамках Федеральной научно-технической программы развития генетических технологий
Россия, 630559, Новосибирская обл., р. п. КольцовоАлексей Михайлович Задорожный
ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора
Email: zadorozhnyy_am@vector.nsc.ru
стажер-исследователь, Центр геномных исследований мирового уровня по обеспечению биологической безопасности и технологической независимости в рамках Федеральной научно-технической программы развития генетических технологий
Россия, 630559, Новосибирская обл., р. п. КольцовоЛюбовь Александровна Орлова
ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора
Email: orlova_la@vector.nsc.ru
аспирант, стажер-исследователь, Центр геномных исследований мирового уровня по обеспечению биологической безопасности и технологической независимости в рамках Федеральной научно-технической программы развития генетических технологий
Россия, 630559, Новосибирская обл., р. п. КольцовоАлександр Алексеевич Ильичев
ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора
Email: ilyichev@vector.nsc.ru
д.б.н., профессор, заведующий отделом биоинженерии, Центр геномных исследований мирового уровня по обеспечению биологической безопасности и технологической независимости в рамках Федеральной научно-технической программы развития генетических технологий
Россия, 630559, Новосибирская обл., р. п. КольцовоСписок литературы
- Ahn J.Y., Lee J., Suh Y.S., Song Y.G., Choi Y.J., Lee K.H., Seo S.H., Song M., Oh J.W., Kim M., Seo H.Y., Kwak J.E., Youn J.W., Woo J.W., Shin E.C., Sung Y.C., Park S.H., Choi J.Y. Safety and immunogenicity of two recombinant DNA COVID-19 vaccines containing the coding regions of the spike or spike and nucleocapsid proteins: an interim analysis of two open-label, non-randomised, phase 1 trials in healthy adults. Lancet Microbe, 2022, Vol. 3, no. 3, pp. e173-e183.
- Borgoyakova M.B., Karpenko L.I., Rudometov A.P., Shanshin D.V., Isaeva A.A., Nesmeyanova V.S., Volkova N.V., Belenkaya S.V., Murashkin D.E., Shcherbakov D.N., Volosnikova E.A., Starostina E.V., Orlova L.A., Danilchenko N.V., Zaikovskaya A.V., Pyankov O.V., Ilyichev A.A. Immunogenic properties of the DNA construct encoding the receptor-binding domain of the SARS-CoV-2 spike protein. Mol. Biol. (Mosk.), 2021, Vol. 55, no. 6, pp. 987-998.
- Borgoyakova M.B., Karpenko L.I., Rudometov A.P., Volosnikova E.A., Merkuleva I.A., Starostina E.V., Zadorozhny A.M., Isaeva A.A., Nesmeyanova V.S., Shanshin D.V., Baranov K.O., Volkova N.V., Zaitsev B.N., Orlova L.A., Zaykovskaya A.V., Pyankov O.V., Danilenko E.D., Bazhan S.I., Shcherbakov D.N., Taranin A.V., Ilyichev A.A. Self-assembled particles combining SARS-CoV-2 RBD protein and RBD DNA vaccine induce synergistic enhancement of the humoral response in mice. Int. J. Mol. Sci., 2022, Vol. 23, no. 4, 2188. doi: 10.3390/ijms23042188.
- Kraynyak K.A., Blackwood E., Agnes J., Tebas P., Giffear M., Amante D., Reuschel E.L., Purwar M., Christensen-Quick A., Liu N., Andrade V.M., Diehl M.C., Wani S., Lupicka M., Sylvester A., Morrow M.P., Pezzoli P., McMullan T., Kulkarni A.J., Zaidi F.I., Frase D., Liaw K., Smith T.R.F., Ramos S.J., Ervin J., Adams M., Lee J., Dallas M., Shah Brown A., Shea J.E., Kim J.J., Weiner D.B., Broderick K.E., Humeau L.M., Boyer J.D., Mammen M.P. SARS-CoV-2 DNA vaccine INO-4800 induces durable immune responses capable of being boosted in a phase 1 open-label trial. J. Infect. Dis., 2022, jiac016. doi: 10.1093/infdis/jiac016.
- Lagunas-Rangel F.A., Chávez-Valencia V. What do we know about the antibody responses to SARSCoV-2? Immunobiology, 2021, Vol. 226, no. 2, 152054. doi: 10.1016/j.imbio.2021.152054.
- Mallapaty S. India’s DNA COVID vaccine is a world first – more are coming. Nature, 2021, Vol. 597, pp. 161-162.
- Mathew D., Giles J.R., Baxter A.E., Oldridge D.A., Greenplate A.R., Wu J.E., Alanio C., Kuri-Cervantes L., Pampena M.B., D’Andrea K., Manne S., Chen Z., Huang Y.J., Reilly J.P., Weisman A.R., Ittner C.A.G., Kuthuru O., Dougherty J., Nzingha K., Han N., Kim J., Pattekar A., Goodwin E.C., Anderson E.M., Weirick M.E., Gouma S., Arevalo C.P., Bolton M.J., Chen F., Lacey S.F., Ramage H., Cherry S., Hensley S.E., Apostolidis S.A., Huang A.C., Vella L.A.; UPenn COVID Processing Unit, Betts M.R., Meyer N.J., Wherry E.J. Deep immune profiling of COVID-19 patients reveals distinct immunotypes with therapeutic implications. Science, 2020, Vol. 369, no. 6508, eabc8511. doi: 10.1126/science.abc8511
- Merkuleva I.A., Shcherbakov D.N., Borgoyakova M.B., Shanshin D.V., Rudometov A.P., Karpenko L.I., Belenkaya S.V., Isaeva A.A., Nesmeyanova V.S., Kazachinskaia E.I., Volosnikova E.A., Esina T.I., Zaykovskaya A.V., Pyankov O.V., Borisevich S.S., Shelemba A.A., Chikaev A.N., Ilyichev A.A. Comparative immunogenicity of the recombinant receptor-binding domain of protein S SARS-CoV-2 obtained in prokaryotic and mammalian expression systems. Vaccines (Basel), 2022. Vol. 10, no. 1, 96. doi: 10.3390/vaccines10010096.
- Momin T., Kansagra K., Patel H., Sharma S., Sharma B., Patel J., Mittal R., Sanmukhani J., Maithal K., Dey A., Chandra H., Rajanathan C.T., Pericherla H.P., Kumar P., Narkhede A., Parmar D. Safety and immunogenicity of a DNA SARS-CoV-2 vaccine (ZyCoV-D): Results of an open-label, non-randomized phase I part of phase I/II clinical study by intradermal route in healthy subjects in India. EClinicalMedicine, 2021, Vol. 38, 101020. doi: 10.1016/j.eclinm.2021.101020.
- Sekine T., Perez-Potti A., Rivera-Ballesteros O., Strålin K., Gorin J.B., Olsson A., Llewellyn-Lacey S., Kamal H., Bogdanovic G., Muschiol S., Wullimann D.J., Kammann T., Emgård J., Parrot T., Folkesson E., Karolinska COVID-19 Study Group, Rooyackers O., Eriksson L.I., Henter J.I., Sönnerborg A., Allander T., Albert J., Nielsen M., Klingström J., Gredmark-Russ S., Björkström N.K., Sandberg J.K., Price D.A., Ljunggren H.G., Aleman S., Buggert M. Robust T cell immunity in convalescent individuals with asymptomatic or mild COVID-19. Cell, 2020, Vol. 183, no. 1, pp. 158-168.e14.
- Simões R.S.Q., Rodríguez-Lázaro D. Classical and next-generation vaccine platforms to SARS-CoV-2: biotechnological strategies and genomic variants. Int. J. Environ. Res. Public Health, 2022, Vol. 19, no. 4. 2392. doi: 10.3390/ijerph19042392.
Дополнительные файлы
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).