Сопряженность полиморфизмов генов и содержания цитокинов в сыворотке крови у детей с аллергической бронхиальной астмой

Обложка


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Исследование генов, контролирующих активность цитокинов, одна из важных задач в выявлении предрасположенности и раскрытии патогенетических звеньев инициации, течения заболеваний. При аллергической бронхиальной астме у детей среди патогенетических механизмов определяющее значение имеют генетические предикторы, ассоциированные с дифференцировкой и функционированием Т-хелперов, аберрантной продукцией цитокинов и дисрегуляцией иммунного ответа. Цель – оценка сопряженности полиморфных генотипов и содержания в сыворотке крови цитокинов различных профилей Т-хелперов у детей с аллергической бронхиальной астмой.

Обследовано 175 детей в возрасте от 3 до 11 лет, из них 75 с верифицированным диагнозом аллергической бронхиальной астмы (АБА) и 100 сопоставимых по полу здоровых сверстников. Всем детям проведено общеклиническое и аллергологическое обследование. В сыворотке крови иммуноферментным методом определяли содержание цитокинов Тh1-, Th2- и Th17-профилей. Образцы ДНК, выделенные из периферической венозной крови, использовали материалом для молекулярно-генетического анализа. С помощью метода аллель-специфичной полимеразной цепной реакции исследовали следующие точки мутаций: IFNγ (T-874 A), IL-4 (С-589 Т), IL-6 (C-174 G), IL-17A (G-197 A), TNFα (G-308 A). Проводили анализ структуры и встречаемости полиморфизмов генов цитокинов и рассчитывали коэффициент отношения шансов риска болезни. Статистическая обработка данных осуществлялась с помощью программы Statistica 10 методами описательной, параметрической и непараметрической статистики, сравнения несвязанных групп по качественным признакам при равновесии Харди–Вайнберга с критерием Хи-квадрат (χ2).

Проведенные исследования выявили различия в структуре и встречаемости полиморфных генотипов, сопряженных с аберрантной продукцией, цитокинов различных Th-профилей среди детей с аллергической бронхиальной астмой. Сравнительный анализ частот мутантных аллелей и генотипов цитокинов различных Th-профилей с определением их содержания в сыворотке крови детей, с аллергической бронхиальной астмой, выявил преобладание гомозиготных генотипов IFNγ А874А, IL-4 Т589Т, IL-6 G174G, IL-17А A197A, TNFα A308A. Исследования полиморфизмов генов, особенностей продукции и содержания цитокинов Т-хелперов-1, Т-хелперов-2, Т-хелперов-17 профилей при бронхиальной астме у детей выявили различия в структуре и встречаемости мутантных аллелей, ассоциированных с аберрантной продукцией цитокина, вариативностью риска развития аллергопатологии и реализации определенного фенотипа болезни.

Полный текст

Введение

В мире наблюдается неуклонный рост распространенности и ранней реализации аллергических заболеваний, что определяет их в группу социально значимых заболеваний. По данным международных и национальных согласительных документов в настоящее время более 360 млн человек страдают аллергическими заболеваниями, из них 14% дети [3, 7, 9]. В патогенезе аллергических заболеваний определяющая роль принадлежит комплексу иммунопатологических механизмов, включающих избыточную продукцию антител и пролиферацию сенсибилизированных Т-лимфоцитов, сопровождающихся развитием воспаления с повреждением собственных тканей. На формирование типа иммунного ответа влияет большой спектр факторов, включая генетическую предрасположенность, нарушение регуляции и синтеза цитокинов [1, 2, 4, 5, 6, 7, 9, 10]. Бронхиальная астма относится к многофакторным воспалительным заболеваниям, имеет сложную этиологию, зависящую от множества генетических факторов, контроль которого требует понимания различных механизмов иммунопатогенеза [3, 8, 11, 12, 13, 14]. Мутации в генах цитокинов, определяющие дефекты продукции и рецепции отдельных цитокинов, составляют значительную часть иммуноопосредованных механизмов развития и прогрессирования патологических процессов при аллергических заболеваниях [1]. Индукция выработки цитокинов антигеном и локальная концентрация метаболитов в лимфоидной ткани определяет дифференцировку Т-хелперов по пути Тh1, Тh2, Тh17. Одним из механизмов, определяющих вариабельность продукции цитокинов, является наличие однонуклеотидных полиморфизмов, ассоциированных с изменением синтеза биохимических продуктов при различных аллергических заболеваниях [5, 7, 13, 14].

Исследование генов, контролирующих активность цитокинов, важная задача в выявлении предрасположенности и раскрытии патогенетических звеньев инициации, течения заболеваний. Поиск генетических предикторов аллергической бронхиальной астмы занимает важное место среди актуальных задач медицины и направлений научных исследований. Анализ генетических предикторов реализации аллергической бронхиальной астмы, предрасположенности к IgE-опосредованному ответу на антигены и дисрегуляции иммунного ответа позволит прогнозировать фенотипические особенности течения и терапии заболевания. Приведенные обстоятельства определили актуальность цели и задач настоящего исследования.

Цель – оценка сопряженности полиморфных генотипов и содержания в сыворотке крови цитокинов различных профилей Т-хелперов у детей с аллергической бронхиальной астмой.

Материалы и методы

Контингент исследования составили 175 детей в возрасте от трех до одиннадцати лет, в том числе 75 с верифицированным диагнозом аллергической бронхиальной астмы и 100 сопоставимых по полу здоровых сверстников. Верификация диагноза выполнена в соответствии с национальной программой «Бронхиальная астма у детей. Стратегия лечения и профилактика», международным согласительным документом «Global strategy for asthma management and prevention» [10]. При верификации диагноза учитывали наследственный анамнез и анамнез заболевания, проводили аллергологическое обследование (скарификационные пробы, определение общего и специфического IgE к бытовым, эпидермальным, пыльцевым аллергенам в сыворотке крови). Дети с аллергической бронхиальной астмой наблюдались в Городском аллерго-респираторном центре, здоровые сверстники обследованы в Центре Здоровья для детей и взрослых КГБУЗ «Владивостокский клинико-диагностический центр», главный врач А.А. Кабиева. Наличие АБА и письменного согласия родителей обосновывали включение ребенка в группу исследования. В работе соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинкской Декларацией Всемирной Медицинской Ассоциации и Правилами клинической практики в Российской Федерации и Приказ Минздрава РФ № 266 от 19.06.2003 г. Дизайн исследования одобрен Междисциплинарным комитетом по этике ФГБОУ ВО ТГМУ Минздрава России, информационные согласия подписаны.

При молекулярно-генетическом анализе материалом служили образцы ДНК, выделенные из лейкоцитов периферической венозной крови наборами Genomic DNA Purification Kit (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, США). Для исследования однонуклетидных полиморфизмов генов цитокинов применяли метод полимеразной цепной реакции с генотипированием полиморфизмов. Амплификацию проводили, используя стандартные наборы праймеров научно-производственной фирмы «Литех» – SNP (Москва). Визуализацию продуктов амплификации выполняли с помощью электрофореза в окрашенном бромистым этидием агарозном геле. Фотофиксацию проводили c помощью системы гель-документирования VersaDoc Model 4000 (Bio-Rad, США). В исследовании выбраны следующие точки мутаций: интерферона гамма (IFNγ) – T-874 А, интерлейкина-4 (IL- 4) – С-589 Т, интерлейкина-6 (IL-6) – C-174 G, интерлейкина-17А (IL-17A) – G-197 A, фактора некроза опухолей альфа (TNFα) – G-308A.

Содержание интерлейкинов (IL-4, IL-6, IL- 17А), цитокинов (TNFα, IFNγ) в сыворотке крови определяли иммуноферментным твердофазным методом с использованием реактивов ООО «Компания Алкор Био» (г. Санкт-Петербург), Bender Medsystems GmbH (Австрия) и АО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. Результаты представлены в пикограммах в миллилитре (пг/мл).

Анализировали полученные результаты, используя методы описательной статистики и программы Statistica 10, с подсчетом: коэффициента отношения шансов (OR), доверительного интервала (CI), коэффициента достоверности показателя и различий (р) с критическим уровнем значимости р < 0,05. Объем выполненных исследований позволил оценить результаты с достоверностью 95-99%. При обработке цифровых данных применяли методы сравнение несвязанных групп по качественным признакам, проводили оценку соответствия распределений генотипов ожидаемым значениям при равновесии Харди–Вайнберга и в сравнении распределений частот генотипов и аллелей в двух субпопуляциях использовали критерий Хи-квадрат (χ2).

Результаты и обсуждение

Проведенные исследования у детей с АБА в сравнении с данными здоровых сверстников выявили различия в структуре и встречаемости полиморфных генотипов цитокинов различных Th-профилей. Частоты генотипов по каждому исследованному гену были протестированы на отсутствие различий в генотипах у здоровых детей и детей с АБА с расчетом критерия χ2. Оценка встречаемости генетических полиморфизмов генов цитокинов у детей с аллергической бронхиальной астмой выявила высокую распространенность гомозиготных генотипов цитокинов профиля Th1 – IFNγ А874А, и гомозиготных генотипов цитокинов Th2 и Th17, IL-4 T589T, IL-6 С174G, IL-17А G197А, TNFα G308А (табл. 1).

 

ТАБЛИЦА 1. ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛИМОРФИЗМОВ ГЕНОВ ЦИТОКИНОВ У ДЕТЕЙ С АЛЛЕРГИЧЕСКОЙ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ И ЗДОРОВЫХ СВЕРСТНИКОВ

TABLE 1. CHARACTERIZATION OF CYTOKINE GENE POLYMORPHISMS IN CHILDREN WITH ALLERGIC BRONCHIAL ASTHMA AND HEALTHY PEERS

Цитокин / полиморфизм

Cytokine / polymorphism

Генотипы

Genotypes

Группы наблюдения

Observation groups

Здоровые дети

Healthy children

(n = 100)

Дети с АБА

Children with ABA

(n = 75)

IFNγ 874Т/А

ТТ

32 (32,00%)

8 (10,70%)

ТА

56 (56,00%)

39 (52,00%)

АА

12 (12,00%)

28 (37,33%)

Частота встречаемости аллеля

Allele frequency

Т

120 (60,00%)

55 (37,00%)

А

80 (40,00%)

95 (63,00%)

OR (CI 95%)

2,59 (1,67-4,00)

Критерий χ2

Criterion χ2

18,66; р < 0,01

IL-4 589C/T

СС

75 (75,00%)

12 (16,70%)

СТ

20 (20,00%)

40 (53,30%)

ТТ

5 (5,00%)

23 (30,00%)

Частота встречаемости аллеля

Allele frequency

С

170 (85,00%)

64 (42,70%)

Т

30 (15,00%)

86 (57,30%)

OR (CI 95%)

19,30 (11,23-33,31)

Критерий χ2

Criterion χ2

56,97; р < 0,001

IL-6 174 G/C

CC

33 (33,00%)

7 (9,33%)

CG

60 (60,00%)

44 (58,67%)

GG

7 (7,00%)

24 (32,00%)

Частота встречаемости аллеля

Allele frequency

C

126 (63,00%)

58 (54,00%)

G

74 (37,00%)

92 (46,00%)

OR (CI 95%)

2,71 (1,73-4,18)

Критерий χ2

Criterion χ2

20,34; р < 0,001

IL-17A 197 G/A

GG

34 (34,00%)

5 (6,70%)

GА

56 (56,00%)

40 (53,30%)

АА

10 (10,00%)

30 (40,00%)

Частота встречаемости аллеля

Allele frequency

G

124 (62,00%)

50 (33,00%)

А

76 (38,00%)

100 (67,00%)

OR (CI 95%)

0,51 (0,32-0,71)

Критерий χ2

Criterion χ2

28,22; р < 0,001

TNFα 308G/A

GG

40 (40,00%)

15 (20,00%)

GА

40 (40,00%)

35 (46,60%)

АА

20 (20,00%)

25 (33,40%)

Частота встречаемости аллеля

Allele frequency

G

120 (60,00%)

65 (43,30%)

А

80 (40,00%)

85 (56,70%)

OR (CI 95%)

1,96 (1,27-3,01)

Критерий χ2

Criterion χ2

9,55; р = 0,05

Примечание. OR – коэффициент отношения шансов, CI – доверительный интервал.

Note. OR, odds ratio; CI, confidence interval.

 

Анализ структуры и встречаемости полиморфизмов промоторной части генов IL-4, IL-6, IL- 17А, TNFα, IFNγ показал наличие и значимость корреляционной зависимости аллельных вариантов генов и продукции соответствующих цитокинов.

Рядом авторов предложен механизм, опосредующий реализацию факторов риска с развитием аллергического заболевания через аберрантную продукцию цитокинов различных Тh1/Тh2/Тh17 профилей и генетическое регулирование, связанное с выраженностью иммунного ответа на антигенное воздействие [1, 4, 5, 6, 7, 12, 13, 14].

Характеристики взаимосвязи генотипа и уровня в сыворотке крови цитокинов с высокой патогенетической значимостью при реализации аллергического воспаления в органах дыхания определили наиболее высокое содержание цитокина у детей со следующими гомозиготными генотипами: по IL-4 с ТТ, IL-6 с GG, TNFα с АА, IFNγ с ТТ, IL-17А с АА, как в группе наблюдения, так и в группе контроля. Наиболее низкие показатели соответствующего цитокина в сыворотке крови определены у детей с генотипами: по IL-4 с СС, по IL-6 с СС, по TNFα с GG, IFNγ с АА, IL- 17А с GG (рис. 1).

 

Рисунок 1. Сопряженность полиморфных генотипов и содержание цитокинов в сыворотке крови

Примечание. c – здоровые дети, d – дети с аллергической бронхиальной астмой.

Figure 1. Association of polymorphic genotypes and the content of cytokines in blood serum

Note. c, healthy children; d, children with allergic bronchial asthma.

 

Проведенные исследования выявили ассоциации аберрантной продукции IL-4, IL-6, IL-17А, TNFα, IFNγ с полиморфными вариантами промоторных регионов генов, что свидетельствует о генетической детерминированности уровня синтеза данных цитокинов. Определена взаимосвязь заболевания и генотипа (p < 0,001) с эффектом парного взаимодействия с высокой статистической значимостью.

Заключение

Таким образом, в проведенном нами анализе генетической вариации генов цитокинов выявил ассоциативные связи между полиморфными вариантами генотипов и измененным синтезом цитокинов, проиллюстрировал информативность определения однонуклеотидных полиморфизмов генов цитокинов как дополнительных диагностических предикторов риска развития и реализации аллергической бронхиальной астмы у детей.

Исследования полиморфизмов генов, особенностей продукции и содержания цитокинов Th1/Th2/Th17 профилей при бронхиальной астме у детей выявили различия в структуре и встречаемости мутантных аллелей, ассоциированных с измененной продукцией цитокина, вариативностью риска развития и реализации аллергического фенотипа болезни.

Проведенное исследование предоставляет информацию о значимости функциональных полиморфизмов генов цитокинов как предикторов, ассоциированных с риском развития и распространенности аллергического воспаления дыхательных путей и фенотипическими особенностями болезни.

×

Об авторах

Е. В. Просекова

ФГБОУ ВО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ

Автор, ответственный за переписку.
Email: gades.med@mail.ru

д.м.н., профессор, заведующая кафедрой клинической лабораторной диагностики, общей и клинической иммунологии

Россия, Владивосток

М. С. Долгополов

ФГБОУ ВО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ

Email: gades.med@mail.ru

ассистент кафедры клинической лабораторной диагностики, общей и клинической иммунологии, аспирант

Россия, Владивосток

А. И. Турянская

ФГБОУ ВО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ

Email: gades.med@mail.ru

ассистент кафедры клинической лабораторной диагностики, общей и клинической иммунологии, аспирант

Россия, Владивосток

В. А. Сабыныч

ФГБОУ ВО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ

Email: gades.med@mail.ru

к.м.н., доцент кафедры клинической лабораторной диагностики, общей и клинической иммунологии

Россия, Владивосток

Список литературы

  1. Брагина Е.Ю., Фрейдин М.Б., Бабушкина Н.П., Гараева А.Ф., Колоколова О.В., Жалсанова И.Ж., Пузырев В.П. Анализ генов цитокиновой сети в развитии «обратной» коморбидности для бронхиальной астмы и туберкулеза // Медицинская генетика, 2017. Т. 16, № 1. С. 20-24. [Bragina E.Yu., Freidin M.B., Babushkina N.P., Garaeva A.F., Kolokolova O.V., Zhalsanova I.Z., Puzyrev V.P. Analysis of cytokine network genes in the development of “reverse” comorbidity for bronchial asthma and tuberculosis. Meditsinskaya genetika = Medical Genetics, 2017, Vol. 16, no. 1, pp. 20-24. (In Russ.)]
  2. Касохов Т.Б., Цораева З.А., Мерденова З.С., Касохова В.В., Мазур А.И. Роль иммунной системы в развитии бронхиальной астмы у детей, проживающих в зоне экологического неблагополучия, и методы лечения [Электронный ресурс] // Современные проблемы науки и образования, 2016. № 3. Режим доступа: https://science-education.ru/ru/article/view?id=24412 [Kasokhov T.B., Tsoraeva Z.A., Merdenova Z.S., Kasokhova V.V., Mazur A.I. The role of the immune system in the development of bronchial asthma in children living in the zone of ecological trouble, and methods of treatment [Electronic resource]. Sovremennyye problemy nauki i obrazovaniya = Modern Problems of Science and Education, 2016, no. 3. (In Russ.)] Access mode: https://science-education.ru/ru/article/view?id=24412
  3. Курбачева О.М., Жестков А.В., Нагаткин Д.А., Кулагина В.В., Нагаткина О.В. Современный взгляд на иммунопатогенез бронхиальной астмы // Российский аллергологический журнал, 2016. № 2. С. 10-14. [Kurbacheva O.M., Zhestkov A.V., Nagatkin D.A., Kulagina V.V., Nagatkina O.V. Modern view on the immunopathogenesis of bronchial asthma. Rossiyskiy allergologicheskiy zhurnal = Russian Allergology Journal, 2016, no. 2, pp. 10-14. (In Russ.)]
  4. Симбирцев А.С. Иммунофармакологические аспекты системы цитокинов // Бюллетень сибирской медицины, 2019. Т. 18, № 1. С. 84-95. [Simbirtsev A.S. Immunopharmacological aspects of the cytokine system. Byulleten sibirskoy meditsiny = Bulletin of Siberian Medicine, 2019, Vol. 18, no. 1, pp. 84-95. (In Russ.)
  5. Симбирцев А.С. Цитокины в патогенезе и лечении заболеваний человека. СПб.: Фолиант, 2018. 512 с. [Simbirtsev A.S. Cytokines in the pathogenesis and treatment of human diseases. St. Petersburg: Foliant, 2018. 512 p.
  6. Смольникова М.В., Фрейдин М.Б., Смирнова С.В. Гены цитокинов как генетические маркеры атопической бронхиальной астмы с контролируемым и неконтролируемым течением // Медицинская иммунология, 2017. Т. 19, № 5. С. 605-614. [Smolnikova M.V., Freidin M.B., Smirnova S.V. Cytokine genes as genetic markers of controlled and uncontrolled atopic bronchial asthma. Meditsinskaya immunologiya = Medical Immunology (Russia), 2017, Vol. 19, no. 5, pp. 605-614. (In Russ.)] doi: 10.15789/1563-0625-2017-5-605-614.
  7. Фрейдин М.Б., Огородова Л.М., Пузырев В.П. Патогенетика аллергических болезней: монография. Новосибирск: изд-во Сиб. отд. РАН, 2015. 149 с. [Freidin M.B., Ogorodova L.M., Puzyrev V.P. Pathogenetics of allergic diseases: monograph. Novosibirsk: Publishing House of Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, 2015. 149 p.
  8. de Silva M.J., de Santana M.B.R., Tosta B.R., Espinheira R.P., Alcantara-Neves N.M., Barreto M.L., Figueiredo C.A., Costa R.D.S. Variants in the IL17 pathway genes are associated with atopic asthma and atopy makers in a South American population. Allergy Asthma Clin. Immunol., 2019, Vol. 15, 28. doi: 10.1186/s13223-019-0340-7.
  9. Global strategy for asthma management and prevention: Global Initiative for Asthma (GINA): report 2019. 201 p. Available at: www.ginasthma.org (Date of application: 12.05.2022).
  10. Hirose K., Iwata A., Tamachi T., Nakajima H. Allergic airway inflammation: key players beyond the Th2 cell pathway. Immunol. Rev., 2017, Vol. 278, no. 1, pp. 145-161.
  11. Shumna Т.Y., Fedosieieva O.S., Zinchenko T.P., Nedelska S.M., Voznyi О.V., Kamyshnyi O.M. Characteristics of interleukin-4 gene (C-589T, rs2243250) polymorphism in children with bronchial asthma and allergic rhinitis with isolated or allergic rhinitis-induced comorbid malocclusion. Zaporozhye Medical Journal, 2019, Vol. 21, no. 6, pp. 723-732.
  12. Zhai C., Li S., Feng W., Wang J., Wang Q., Chai L., Zhang Q., Yan X., Li M. Association of interleukin-17a rs2275913 gene polymorphism and asthma risk: a meta-analysis. Arch. Med. Sci., 2018, Vol. 14, no. 6, pp. 1204-1211.
  13. Zhang Y., Hua L., Liu Q. H., Gan Y., Wu M., Bao Y., Chen Q., Zhang J. Household mold exposure interacts with inflammation-related genetic variants on childhood asthma: a case-control study. BMC Pulm. Med., 2021, Vol. 21, no. 1, 114. doi: 10.1186/s12890-021-01484-9.
  14. Zhao W. Neutralization of interleukin-17 suppresses allergic rhinitis symptoms by downregulating Th2 and Th17 responses and upregulating the Treg response. Oncotarget, 2017, Vol. 8, no. 14, pp. 22361-22369.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рисунок 1. Сопряженность полиморфных генотипов и содержание цитокинов в сыворотке крови

Скачать (295KB)
Метаданные

© Просекова Е.В., Долгополов М.С., Турянская А.И., Сабыныч В.А., 2022

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № 77 - 11525 от 04.01.2002.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах