Экспрессия регуляторов хемотаксиса в тканях экссудативных поражений пространства Рейнке

Полный текст

Введение

Экссудативные опухолеподобные новообразования голосовых складок достаточно широко распространены в популяции, чаще среди представителей голосо-речевых профессий: актеров, певцов, преподавателей, дикторов и представляют собой серьезную медико-социальную проблему. Согласно оценкам специалистов заболеваемость данной патологией составляет от 55 до 68% среди профессионалов голоса [1]. Основными клиническими формами патологии являются полипы голосовых складок, голосовые узелки, отек Рейнке. Ведущими причинами развития патологии принято считать интенсивное, длительное перенапряжение голосовых складок, связанное с форсированным голосообразованием, так называемой «твердой атакой», и воздействие агрессивного табачного дыма на голосовые складки [1]. Кроме механического компонента в качестве иных этиологических факторов рассматривают вдыхание токсичных аэрозолей (например газового аэрозоля при проведении сварочных работ, химических реагентов, дыма), фаринголарингеальный рефлюкс [1]. В основе патогенеза лежат микроциркуляторные расстройства, обусловленные недостаточностью лимфатического дренажа и сопровождающиеся скоплением отечной жидкости в пространстве Рейнке. Интенсивные голосовые нагрузки приводят к перенапряжению голосового аппарата, повреждению микрососудов, повышению проницаемости последних и выходу плазмы в интерстициальное пространство. Особенности дренажной системы голосовых складок препятствуют своевременному оттоку жидкости в региональные лимфоколлекторы. Формирование на этом фоне ишемически-гипоксических расстройств приводит к активации локальных факторов иммунной системы, входящих в состав гортань-ассоциированной лимфоидной ткани – LALT (Larynx-Associated Lymphoid Tissue) [6] Включение реакций иммунного реагирования сопровождается усилением продукции провоспалительных цитокинов, регуляторов хемотаксиса, факторов роста, что способствует прогрессированию патологии. Хемокины участвуют не только в координации движения лейкоцитов при воспалительных процессах, но также важны во многих физиологических и патологических процессах.

В связи с этим целью настоящего исследования явилось изучение уровня хемокинов MIP- 1α, MIP-1β, MIP-3α, фракталкина, IL-8, I-TAС в тканях экссудативных поражений пространства Рейнке.

Материалы и методы

Материалом для исследования послужили 40 образцов тканей новообразований голосовых складок отобранных интраоперационно у пациентов с диагнозом по МКБ-10 J38.1 Полип голосовой складки и гортани и поступивших на оперативное лечение. Удаление новообразований осуществлялось с помощью фибробронхоскопа Olympus TYPE150 (Германия) под эндотрахеальным наркозом под контролем операционного микроскопа Haag-Streit Surgical Möller Wedel МV-500 (Германия) с применением интегрированного СО₂-лазера Lumenis Acu Pulse (Израиль) по методу Hirano. Образцы тканей распределялись следующим образом: 1-я группа – 10 образцов тканей с ангиоматозным типом полипов, 2-я группа – 9 полипов миксоидного типа, 3-я группа – узелки голосовых складок (n = 7), 4-я группа – отек Рейнке (n = 14).

Определение хемокинов

Определение хемокинов проводили в супернатанте тканей ЭППР. Для получения супернатанта, гомогенаты тканей центрифугировали при 10000 g в течение 20 мин, полученный супернатант хранили до исследования при температуре -20 °C. Количественное содержание хемокинов в полученных супернатантах оценивали при помощи мультиплексного анализа на иммуноанализаторе MAGPIX-100 с использованием системы мультиплексного анализа Bio-Plex (Bio-Rad, США) для определения фракталкина, IL-8, I-TAC, MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α (реагенты Merk, Германия) в соответствии с инструкцией фирмы. C целью стандартизации в гомогенате определяли количество белка биуретовым методом с использованием набора реагентов «ОБЩИЙ БЕЛОК-ОЛЬВЕКС» (Санкт-Петербург, Россия). Расчетные показатели концентрации цитокинов представлены в пг/ мг белка.

Статистическая обработка

Обработка материала проводилась с помощью пакета программ Statistica 10.0 for Windows. Значения показателей представлены в виде Ме (Q_0,25-Q_0,75), где Ме – медиана, Q_0,25 и Q_0,75 – интерквартильный интервал. Сравнение групп производили, используя непараметрический критерий Манна–Уитни, с учетом поправки Бонферрони, значимыми считали различия при p ≤ 0,02.

Результаты и обсуждение

Представленные результаты свидетельствуют об изменении соотношения различных хемокинов в изучаемых образцах (табл. 1).

 

Таблица 1. Концентрация хемокинов в тканях экссудативных поражений пространства Рейнке, Mе (Q_0.25-Q_0.75) / Table 1. Concentration of chemokines in the tissues of exudative lesions of Reinke’s space, Mе (Q_0.25-Q_0.75)

Показатель, пг/мг белка Index, pg/mg protein	ЭППР Exudative lesions of Reinke’s space
	Полипы голосовых складок Vocal cord polyps		Группа 3 Узелки голосовых складок Group 3 Nodules of the vocal folds (n = 7)	Группа 4 Отек Рейнке Group 4 Reinke’s edema (n = 14)
	Группа 1 Ангиоматозный тип Group 1 Angiomatous type (n = 10)	Группа 2 Миксоидный тип Group 2 Mixoid type (n = 9)
Фракталкин Fractalkin	3,1 (2,2-3,8)*	8,3 (4,6-10,1)	4,7 (3,3-7,3)*	12,5 (8,4-14,4)
IL-8	13,6 (10,5-16,2)*	5,2 (3,8-7,2)	21,3 (12,5-23,2)*	7,2 (5,6-10,4)
I-TAC	15,6 (12,1-17,1)*	4,2 (2,1-6,5)	11,2 (10,5-13,6)*	3,7 (2,6-6,7)
MIP-1α	2,2 (1,8-6,4)*	12,6 (8,4-14,3)	6,0 (4,8-8,8)*	14,3 (12,8-18,6)
MIP-1β	6,5 (4,4-9,1)*	17,3 (15,1-20,4)	5,5 (4,3-10,9)*	14,1 (12,8-23,5)
MIP-3α	3,3 (1,8-3,2)*	10,2 (8,5-16,1)	6,9 (4,3-8,7)*	14,3 (9,8-18,2)

Примечание. * – значимые, согласно критерию Манна–Уитни (р ≤ 0,02), различия с группой 2 и 4.

Note. *, significant, according to the Mann–Whitney test (p ≤ 0.02) differences with group 2 and 4.

 

Ткани так называемых «плотных» полипов, к которым относятся ангиоматозный тип полипов и голосовые узелки, а в морфогенезе преобладают пролиферация фибробластов, дилятация капиллярного русла, гиалиноз стромы с выраженным утолщением суббазальной мембраны, диффузное отложение фибронектина, явления неоангиогенеза, содержат наибольшую концентрацию хемокинов, представителей α-хемокинов (СХС-семейство), в частности IL-8 и интерфероном-γ индуцируемый Т-клеточный альфа-хемоаттрактант (I-TAC; семейство CXCL11).

IL-8 и I-TAC, принадлежащие к семейству α-хемокинов (СХС-хемокинов) и вырабатываемые преимущественно фибробластами, моноцитами, клетками эндотелия, принимают активное участие в активации, миграции и хемотаксисе клеток, способны определять вид клеток, проникающих в ткань из кровотока через эндотелий, а также направление миграции [2, 3]. Наибольшая плотность рецепторов к IL-8 обнаружена на нейтрофилах, моноцитах/макрофагах и активированных Т-лимфоцитах, после взаимодействия с которыми происходит связывание CXCR1 с G-белком, приводящее к фосфоинозитидному гидролизу, внутриклеточной мобилизации Са²⁺ и хемотаксису клетки [3].

Рецепторы к I-TAC экспрессируются преимущественно на активированных Th1-лимфоцитах, эндотелиоцитах. Активатором и основным регулятором продукции I-TAC является IFNγ, отрицательный контроль осуществляется противовоспалительными цитокинами IL-4 и IL-10.

I-TAC способствует рекрутингу активированных Th1-лимфоцитов в зону формирования патологии. Имеются данные об ангиостатическом эффекте I-TAC, который проявляет ангиостатический эффект путем секреции CXCR3 на эндотелиальных клетках [3, 5].

В то же время в образцах тканей миксоидных полипов и при отеке Рейнке, характеризующихся наличием избыточного жидкостного компонента в интерстиции, утолщением и расширением стенок кровеносных сосудов, истончением и фенестрацией эндотелиальной выстилки, наблюдалось повышение уровня β-хемокинов (СС – хемокинов): MIP-1α (CCL3), MIP-1β (CCL4) и MIP-3α (CCL20) и δ-хемокинов (CX₃C-хемокинов) – фракталкина (CX3CL1) [7, 12].

Известно, что все представители β-ХК являются хемоаттрактантами и активаторами клеток как врожденного (моноцитов, дендритных клеток, NK-клеток), так и адаптивного (Т-лимфоцитов) иммунитета. При этом профиль рецепторов к СС-хемокинам на клетках может избирательно меняться, в зависимости от степени дифференцировки клетки. Так, все Т-лимфоциты экспрессируют CCR1, Th1-лимфоциты – CCR5 и CXCR3, Тh2-лимфоциты – преимущественно CCR3 [12].

Макрофагальные воспалительные белки – MIP (lα; 1β; Зα; Зβ), экспрессируясь в основном на активированных моноцитах/макрофагах, реже на фибробластах, клетках эпителия, гладкомышечных клетках сосудов, проявляют свой эффект путем связывания с внеклеточными протеогликанами и лигирования хемокиновых рецепторов CCR1 (лиганд CCL3) и CCR5 (лиганды CCL3 и CCL4). Рецепторы к белкам семейства MIP (lα; 1β; Зα; Зβ) имеются также на дендритных клетках и тромбоцитах [7, 11].

Фракталкин – единственный представитель семейства CX₃C-хемокинов представлен на моноцитах, эндотелиоцитах как в растворимой, так и в мембраносвязанной с муцинами форме и играет важную роль в хемотаксисе клеток врожденного (моноциты, NK-клетки) и адаптивного (Т-лимфоциты) иммунитета [4].

Хроническое перенапряжение голосовых складок либо воздействие токсических факторов, компонентов желчи и соляной кислоты при рефлюксе приводит не только к повышению проницаемости сосудистого эндотелия, накоплению жидкостного компонента в интерстиции и строме голосовых складок, но и активации клеток, участвующих в тканевом и иммунном гомеостазе, например фибробластов, моноцитов, эндотелиоцитов. В строме голосовых складок популяция фибробластов, относящихся к факторам врожденного иммунитета, достаточно многочисленна, способна при активации изменять свой фенотип на воспалительный и увеличивать секреторную активность [8]. Имеются данные о способности фибробластов модулировать паракринную сигнализацию макрофагов во время ранней экспрессии провоспалительных цитокинов (TNFα, IL-6, IL-12) и последующей экспрессии хемокинов и факторов роста (IL-8, I-TAC, MCP-1, TGF-β) [10]. Именно фибробласты могут детерминировать степень и продолжительность ответа макрофагов. Морфометрическими исследованиями, выполненными нами ранее, показано, что представительство фибробластов в тканях «плотных» новообразований, в частности в ангиоматозных типах полипов и голосовых узелках наибольшее среди всех форм экссудативных поражений пространства Рейнке, вероятно, именно поэтому в данных новообразованиях выявлена наибольшая концентрация указанных выше хемокинов. При этом нельзя исключать определенную роль в стимуляции фибробластов взаимодействия TLR последних с молекулярными паттернами бактериальной стенки, поскольку гортань расположена на пересечении дыхательной системы и желудочно-кишечного тракта и микрофлора на просветной поверхности голосовой складки может при повреждении (например фонотравме) проникать в эпителий и активировать врожденные механизмы защиты в собственной пластинке. Фибробласты одними из первых встречаются с инфекционными агентами, поскольку конститутивно экспрессируют TLR 1, TLR 2, TLR 3, TLR 4, TLR 5, TLR 6, TLR 9 [10]. В литературе описана гипотеза об изменении фенотипа фибробластов на воспалительный при повреждении микрососудов и воздействии первичных медиаторов воспаления, таких как циклооксигеназа-2, HIF-1α, протеазы (MMP-2, MMP- 9), белки (фибронектин, декорин), способных менять сигнализацию и активировать факторы врожденного иммунитета, например дендритные клетки, макрофаги, NK-клетки [8, 9]. Подобный механизм описан также и при «мягких» полипах (миксоидный) и отеке Рейнке, в супернатанте которых нами зафиксировано повышение концентрации СС-хемокинов (MIP lα; 1β; Зα; Зβ) и фракталкина, которые продуцируются преимущественно моноцитами, эндотелиоцитами, что отражает включение реакций иммунного реагирования при формировании данной патологии [5, 9].

Изучение секреторной активности основных представителей стромы голосовых складок, в частности представителей дифферона фибробластов, важно также с точки зрения участия последних в процессах регенерации и ремоделирования тканей, как при формировании самой патологии, так и после оперативного удаления новообразований, поскольку избыточное образование внеклеточного матрикса при повышенной стимуляции коллагенообразующей функции фибробластов, например, факторами роста TGF-α, TGF-β может привести к стойкому нарушению голосообразующей функции и впоследствии профессиональной непригодности.

Заключение

Таким образом, при изучении экспрессии хемокинов в тканях экссудативных поражений пространства Рейнке зафиксированы особенности, заключающиеся в преобладании содержания СХС-хемокинов в тканях «плотных» новообразований и повышение концентрации СС-хемокинов и CX₃C-хемокинов в тканях «мягких» новообразований, содержащих большую долю жидкостного компонента в строме. При этом следует учесть, что концентрация цитокинов стандартизирована и пересчитана на 1 мг белка. Подобное распределение содержания хемокинов может свидетельствовать о преобладающем значении клеток-продуцентов при формировании отдельных видов новообразований голосовых складок.

Об авторах

Михаил Александрович Ковалев

Филиал № 3 ФГБУ «3 Центральный военный клинический госпиталь имени А.А. Вишневского»

Email: lor.kovalev@mail.ru

заведующий отделением оториноларингологии

Россия, Московская обл., Одинцово

Евгения Валерьевна Давыдова

ГБУЗ «Челябинская областная клиническая больница»

Автор, ответственный за переписку.
Email: davidova-ev.med@yandex.ru

д.м.н., заведующий отделением реабилитации

Россия, Челябинск

Список литературы

Дополнительные файлы