Исследование экспрессии CD45+ и CD46+ на субпопуляциях лимфоцитов периферической крови постковидных пациентов

Обложка


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Вирус SARS-CoV-2 может проникать в клетки с помощью S1 вирусного шипового (S) белка не только через связывание с ACE2, но и через другие рецепторы клеток. К таким кандидатным рецепторам относится CD46, который также, как и CD45, относится к панлейкоцитарным рецепторам и экспрессируется на всех видах лимфоцитов. В свою очередь SARS-CoV-2-инфекция сопровождается повреждением практически всех компартментов иммунной системы и в первую очередь Т-лимфоцитов.

Целью исследования явилось изучение уровней экспрессии CD45+ и CD46+ на различных субпопуляциях лимфоцитов у пациентов, перенесших SARS-CoV-2-инфекцию.

Было обследовано 72 пациента, перенесших SARS-CoV-2-инфекцию. Методом проточной цитометрии определены CD45+ и CD46+ (панлейкоцитарный маркер для гейтирования лимфоцитов), CD45+ и CD46+, CD3+ (Т-лимфоциты), CD45+ и CD46+, CD3+, CD4+ (хелперы индукторы), CD45+ и CD46+, CD3+, CD8+ (цитотоксические Т-лимфоциты,), CD45+ и CD46+, CD3+, CD56+ (TNK-клетки), CD45+ и CD46+, CD3-, CD56+ (натуральные киллеры), CD45+ и CD46+, CD3-, CD19+ (В-лимфоциты), CD45+ и CD46+, CD3+, CD4+, CD25+ (активированные хелперы, ранняя активация лимфоцитов), CD45+ и CD46+, CD3+, HLA-DR (активированные Т-лимфоциты – поздняя активация лимфоцитов).

Исследования показали, что снижение экспрессии CD46+ на Т-лимфоцитах (CD3+) сопровождается таким же снижением его экспрессии на цитотоксических Т-лимфоцитах (CD3+, CD8+), TNK (CD3+, CD56+), а также Т-хелперах, несущих маркеры ранней активации (CD3+, CD4+, CD25+). При этом наиболее выраженное снижение отмечалось как среди общих Т-лимфоцитов, так и цитотоксических. У этих больных несколько повышался уровень экспрессии CD46+ на В-лимфоцитах. Последние данные говорят об отсутствии вовлечения в нарушении рецептора CD46 на В-лимфоцитах. Полученные нами данные говорят о том, что вирус SARS-CoV-2 может воздействовать на рецептор CD46. Такое воздействие может приводить к усилению симптомов лонг-ковида (постковидного синдрома) у таких пациентов и требует формированию новых подходов к коррекции этих нарушений.

Полный текст

Введение

Известно, что развитие SARS-CoV-2-инфекции обусловлено связыванием SARS-CoV-2 с ангиотензинпревращающим ферментом 2 (ACE2) и является критическим шагом в патофизиологии клинических проявлений у пациентов с COVID-19 [13]. Согласно литературе, вирус SARS-Cov-2 может проникать в клетки не только с помощью S1 вирусного шипового (S) белка через связывание с ACE2, но и через другие рецепторы клеток. К таким кандидатным рецепторам относится CD46, который, так же как и CD45, относится к панлейкоцитарным рецепторам и экспрессируется на всех видах лимфоцитов [8, 11]. CD46 представляет собой мембранный гликопротеин I типа, экспрессируемый на всех ядерных клетках, характеризующийся как регуляторный белок комплемента и как рецептор для ряда патогенов человека, включая вакцинный штамм вируса кори, аденовирусов (группы B и D) и вирусов герпеса 6 типа [12].

В то же время SARS-CoV-2-инфекция сопровождается повреждением практически всех компартментов иммунной системы и в первую очередь Т-лимфоцитов [3, 4]. При этом именно нарушение лимфоцитарного звена иммунной системы оказывается критичным в случае SARS-CoV-2, поскольку сверх активный цитокиновый ответ, типичный для тяжелых случаев заболевания, приводит к развитию системных осложнений, полиорганной недостаточности и, в конечном итоге, к смерти [9]. У больных COVID-19 отмечается уменьшение количества CD3+CD4+T-лимфоцитов, CD3+CD8+T-лимфоцитов, CD19+B- лимфоцитов и CD16+CD56+NK-клеток в периферической крови [7, 14].

В свою очередь, известно, что при дефиците CD46 или его лиганда (C3/C3b) отмечается нарушение Th1-ответа и увеличивается риск рецидивирующих инфекций [6], в то время как нарушения со стороны Т-клеточного ответа отмечаются как входе самого заболевания [7], так и спустя длительные промежутки времени после клинического выздоровления [10].

Работ, определявших экспрессию СD46+ на лимфоцитах у пациентов с постковидным синдромом, в доступной литературе обнаружено не было.

Однако полученные фундаментальные знания о панлейкоцитарных маркерах лимфоцитов и их субпопуляций у постковидных пациентов являются крайне востребованными, так как могут позволить разработать новые подходы к лечению и реабилитации больных, в том числе и при иных вирусных (в том числе и сезонных) заболеваниях.

Таким образом, учитывая роль активации системы комплемента при COVID-19, регуляторные свойства CD46 и его потенциальную вовлеченность в процессы проникновения вируса в клетку, мы сочли необходимым изучить параметры иммунной системы, связанные с нарушением уровней CD45+ и CD46+ на различных субпопуляциях лейкоцитов у постковидных пациентов.

Цель исследования – изучить уровень экспрессии CD45+ и CD46+ на различных субпопуляциях лимфоцитов у пациентов, перенесших SARS-CoV-2-инфекцию.

Материалы и методы

Было обследовано 72 пациента, перенесших SARS-CoV-2-инфекцию. Критерием включения в группы исследований были: подтвержденный диагноз SARS-CoV-2-инфекции методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), наличие IgA, IgM, IgG к вирусу SARS-CoV-2-инфекции, данные компьютерной томографии о перенесенной пневмонии (варианты: КТ1 – поражение до 25% легких, КТ2 – поражение до 50% легких, КТ3 – поражением до 75% легких, КТ4 – поражение свыше 75% легких). Исследование проводилось не менее чем через 6 месяцев после перенесенной пневмонии вызванной SARS-CoV-2-инфекцией.

Все пациенты были предварительно обследованы врачом терапевтом и иммунологом-аллергологом, для выявления сопутствующих заболеваний. Группы были рандомизированы по полу, возрасту, сопутствующим заболеваниям по критерию χ2. Пациенты были разделены на 2 группы сравнения по гейтированию панлейкоцитарными маркерами: 1. Пациенты с уровнем CD45+ больше уровня CD46+ на Т-лимфоцитах (n = 52). 2. Пациенты с CD45+, равным или меньшим уровня CD46+ на Т-лимфоцитах (n = 20). Критерием общие Т-лимфоциты были выбраны в связи с тем, что их повреждение наиболее часто встречается при обследовании как ковидных, так и постковидных пациентов [7, 10]. Все исследования были одобрены Независимым локальным этическим комитетом при ГАУЗ ОТКЗ «Городская клиническая больница № 1» г. Челябинска, протокол № 8 от 11.04.2022, на базе которой проводились данные исследования.

Иммунологические исследования

Общий анализ крови (исследовано 25 параметров: лейкоцитарный, эритроцитарный и тромбоцитарный ростки кроветворения), количественный и качественный состав ростков кроветворения проведен стандартизованным методом на гематологическом анализаторе Medonic M20 (Швеция).

Методом проточной цитометрии CD45+и CD46+ (панлейкоцитарный маркер для гейтирования лимфоцитов), CD45+ и CD46+, CD3+ (Т-лимфоциты), CD45+ и CD46+, CD3+,CD4+ (хелперы индукторы), CD45+ и CD46+, CD3+, CD8+ (цитотоксические Т-лимфоциты,), CD45+ и CD46+, CD3+, CD56+ (TNK-клетки) CD45+ и CD46+, CD3-, CD56+ (натуральные киллеры), CD45+ и CD46+, CD3-, CD19+, CD5+ (В-лимфоциты), CD45+ и CD46+, CD3+, CD4+, CD25+ (активированные хелперы, ранняя активация лимфоцитов), CD45+ и CD46+, CD3+, HLA- DR (активированные Т-лимфоциты – поздняя активация лимфоцитов), Beckman Coulter, BioLegend (США). Оценку иммунного статуса осуществляют методом проточной цитометрии на цитофлюориметре Navios (Beckman Coulter, США) по стандартизованной технологии оценки лимфоцитарного звена иммунитета [1, 2].

Обработка и анализ данных осуществлялись с помощью R 3.1.1 12 (R Foundation for Statistical Computing, Вена, Австрия) и Microsoft Excel версии 14.0. Так как распределение в количественных данных было не нормальным (p-value теста Шапиро–Уилка < 0,05), то использованные статистические критерии были непараметрическими.

Результаты и обсуждение

На первом этапе исследования было выявлено, что при гейтировании лимфоцитов по CD45+ по сравнению с CD46+ у части пациентов процент Т-лимфоцитов несущих рецептор CD45+ был достоверно выше, чем при гейтировании CD46+, из 72 пациентов таких было 52 человека (72,2%), у остальных 20 человек процент Т-лимфоцитов несущих рецептор CD45+ был равен или несколько ниже, чем при гейтировании CD46+ (см. табл. 1). По этому критерию пациенты были разбиты на 2 группы, как это было написано выше.

Как показали наши исследования, снижение экспрессии CD46+ на Т-лимфоцитах (CD3+) сопровождается, таким же уменьшением его экспрессии на цитотоксических Т-лимфоцитах (CD3+, CD8+), TNK (CD3+, CD56+), а также Т-хелперах, несущих маркеры ранней активации (CD3+, CD4+, CD25+). При этом наиболее выраженное снижение отмечалось как среди общих Т-лимфоцитов, так и цитотоксических. У этих больных несколько повышался уровень экспрессии CD46+ на В-лимфоцитах. Последние данные говорят об отсутствии вовлечения в нарушении рецептора CD46 на В-лимфоцитах (см. табл. 1).

 

ТАБЛИЦА 1. СРАВНЕНИЕ ПОКАЗАТЕЛЕЙ СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ ПОСТКОВИДНЫХ ПАЦИЕНТОВ ПРИ ГЕЙТИРОВАНИИ ПАНЛЕЙКОЦИТАРНЫМИ МАРКЕРАМИ CD45+ И CD46+, M±m

TABLE 1. COMPARISON OF INDICES OF LYMPHOCYTE SUBPOPULATIONS IN POST-COVID PATIENTS WHEN GATED WITH CD45+ AND CD46+ PANLEUKOCYTE MARKERS, M±m

Показатели субпопуляций лимфоцитов

Indicators of subpopulations of lymphocytes

Группа 1. Постковидные пациенты с уровнем CD45+ больше уровня CD46+

Group 1. Post-COVID patients with CD45+ level greater than CD46+ level, n = 52

Группа 2. Постковидные пациенты с CD45+, равным или меньшим, чем уровень CD46+

Group 2. Post-COVID patients with CD45+ equal to or less than CD46+, n = 20

T-лимфоциты (CD3+CD19-) отн. (%)

T lymphocytes (CD3+CD19-) rel. (%)

68,35±0,69*

74,40±1,01

T-лимфоциты (CD3+CD19-) абс. (109 кл/л)

T lymphocytes (CD3+CD19-) abs. (109 cell/L)

1427,46±57,93*

1753,30±112,49

T-цитотоксические

(CD3+CD8+) отн. (%)

T cytotoxic

(CD3+CD8+) rel. (%)

23,32±0,95*

26,31±1,06

T-цитотоксические (CD3+CD8+) абс. (109 кл/л)

T cytotoxic (CD3+CD8+) abs. (109 cell/L)

465,96±21,16*

611,90±45,91

ТNK-клетки (CD3+CD16+CD56+) отн. (%)

TNK cells (CD3+CD16+CD56+) rel. (%)

6,080±0,385

7,28±0,88

TNK-клетки (CD3+CD16+CD56+) абс. (109 кл/л)

TNK cells (CD3+CD16+CD56+) abs. (109 cell/L)

114,62±6,55*

185,30±32,06

B-лимфоциты (CD3-CD19+) отн. (%)

B lymphocytes (CD3-CD19+) rel. (%)

10,50±0,36*

9,04±0,68

B-лимфоциты (CD3-CD19+) абс. (109 кл/л)

B-lymphocytes (CD3-CD19+) abs. (109 cell/L)

218,00±11,55

194,40±8,76

T-лимфоциты (CD3+CD4+CD25+) (ранняя активация) отн. (%)

T lymphocytes (CD3+CD4+CD25+) (early activation) rel. (%)

6,58±0,38

6,700±0,448

T-лимфоциты (CD3+CD4+CD25+) (ранняя активация) абс. (109 кл/л)

T lymphocytes (CD3+CD4+CD25+) (early activation) abs. (109 cell/L)

56,27±4,04*

72,10±5,91

Примечание. * – достоверность различий между группами р < 0,05.

Note. *, significance of differences between groups p < 0.05.

 

Как показали наши исследования, более чем у 70% обследованных пациентов с постковидным синдромом выявляется значительное снижение экспрессии CD46+ на Т-лимфоцитах. При этом наиболее страдают как общее количество этих клеток, так и клетки, отвечающие за противовирусный иммунитет (Т-цитотоксические и TNK-клетки) и раннюю активацию Т-хелперов. Выявлено, что В-лимфоциты в этой ситуации не страдают, а даже несколько усиливают экспрессию CD46+ на мембране клеток. Полученные нами данные говорят о том, что вирус SARS-CoV-2 может воздействовать на рецептор CD46.

Более того, наблюдаемые изменения вполне могут быть вызваны взаимодействием вируса и CD46. Так, согласно литературным данным, CD46 вовлечен в контроль по меньшей мере трех ключевых метаболических событий: обработанный λ-секретазой внутриклеточный домен CYT- 1 CD46 перемещается в ядро, где он индуцирует экспрессию белков-переносчиков (GLUT1, LAT1 и CAT1) и сборку mTORC1. Активация CD46 индуцирует повышенную экспрессию метаболических ферментов, включая синтазы жирных кислот, GAPD; также CD46 увеличивает активацию внутриклеточных пулов C5 с внутриклеточно генерируемым C5a, стимулирующим митохондриальный C5aR1, который управляет продукцией ROS и активацией NLRP3 инфламмасом в CD4+T-клетках. Все это лежит в основе повышения гликолиза и увеличения продукции OXPHOS и ROS, необходимых для индукции продукции IFNã и экспрессии гранзима B, и, как следствие, реализации защитных эффекторных ответов Th1 Т-киллеров [5].

Особо стоит отметить, что выявленный комплекс изменений сохраняется у значительного числа переболевших пациентов на протяжении длительного времени, что подчеркивается нарушениями экспрессии этого маркера на различных субпопуляциях Т-лимфоцитов. В целом же, полученные данные подтверждают гипотезу участия рецептора CD46 в патогенезе COVID-19. Более того, такое воздействие приводит к усилению симптомов лонг-ковида (постковидного синдрома) у таких пациентов и требует формирования новых подходов к коррекции этих нарушений.

Выводы

  1. У 72,2% постковидных пациентов выявляется значительное снижением экспрессии CD46+ на Т-лимфоцитах.
  2. Снижение уровня CD46+ у постковидных пациентов наблюдается также на Т-цитотоксических и TNK-клетках и Т-хелперах, несущих маркеры «Ранней активации».
  3. Снижение экспрессии CD46+ на Т-лимфоцитах не сопровождается падением уровня этого маркера на В-лимфоцитах.

Работа выполнена по теме гос. задания «Иммунофизиологические и патофизиологические механизмы регуляции и коррекции функций организма» № гос. регистрации 122020900136-4 и поддержана грантом РФФИ и NSFC, 20-515-55003.

×

Об авторах

М. А. Добрынина

ФГБУН «Институт иммунологии и физиологии» Уральского отделения Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: mzurochka@mail.ru

к.м.н., младший научный сотрудник лаборатории иммунологии воспаления

Россия, Екатеринбург

А. В. Зурочка

ФГБУН «Институт иммунологии и физиологии» Уральского отделения Российской академии наук; ФГАОУ ВО «Южно-Уральский государственный университет» (национальный исследовательский университет)

Email: mzurochka@mail.ru

д.м.н., профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории иммунологии воспаления; заведующий лабораторией иммунобиотехнологии научно-образовательного Российско-китайского центра системной патологии 

Россия, Екатеринбург; Челябинск

М. В. Комелькова

ФГБУН «Институт иммунологии и физиологии» Уральского отделения Российской академии наук; ФГАОУ ВО «Южно-Уральский государственный университет» (национальный исследовательский университет)

Email: mzurochka@mail.ru

к.б.н., заведующий лабораторией системной патологии и перспективных лекарственных средств научно-образовательного Российско-китайского центра системной патологии; старший научный сотрудник лаборатории иммунофизиологии и иммунофармакологии 

Россия, Екатеринбург; Челябинск

Ш. Ло

Хуачжунский университет науки и технологий

Email: mzurochka@mail.ru

профессор, Институт гематологии, Госпиталь Юнион, Медицинский колледж Тунцзи

Китай, Ухань

В. А. Зурочка

ФГБУН «Институт иммунологии и физиологии» Уральского отделения Российской академии наук; ФГАОУ ВО «Южно-Уральский государственный университет» (национальный исследовательский университет)

Email: mzurochka@mail.ru

д.м.н., старший научный сотрудник лаборатории иммунологии воспаления; старший научный сотрудник НИЛ иммунобиотехнологии 

Россия, Екатеринбург; Челябинск

Ху Дэшэн

Хуачжунский университет науки и технологий

Email: mzurochka@mail.ru

профессор кафедры интегрированной традиционной китайской и западной медицины, госпиталь Юнион, медицинский колледж Тунцзи

Китай, Ухань

Л. В. Рябова

ФГБОУ ВО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ

Email: mzurochka@mail.ru

д.м.н., профессор кафедры безопасности жизнедеятельности, медицины катастроф, скорой и неотложной медицинской помощи

Россия, Челябинск

А. П. Сарапульцев

ФГБУН «Институт иммунологии и физиологии» Уральского отделения Российской академии наук; ФГАОУ ВО «Южно-Уральский государственный университет» (национальный исследовательский университет)

Email: mzurochka@mail.ru

д.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории иммунопатофизиологии; директор научно-образовательного Российско-китайского центра системной патологии 

Россия, Екатеринбург; Челябинск

Список литературы

  1. Зурочка А.В., Хайдуков С.В., Кудрявцев И.В., Черешнев В.А. Проточная цитометрия в биомедицинских исследованиях. Екатеринбург: РИО УрО РАН, 2018. 720 с. [Zurochka A.V., Khaidukov S.V., Kudryavtsev I.V., Chereshnev V.A. Flow cytometry in biomedical research]. Ekaterinburg: RIO Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, 2018. 720 p.
  2. Хайдуков С.В., Байдун Л.А., Зурочка А.В., Тотолян А.А. Стандартизованная технология «Исследование субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови с применением проточных цитофлюориметров-анализаторов» // Российский иммунологический журнал, 2014, Т. 8 (17), № 4. С. 974-992. [Khaydukov S.V., Baidun L.A., Zurochka A.V., Totolyan A.A. Standardized technology “Study of the subpopulation composition of peripheral blood lymphocytes using flow cytofluorometer-analyzers”. Rossiyskiy immunologicheskiy zhurnal = Russian Journal of Immunology, 2014, Vol. 8 (17), no. 4, pp. 974-992. (In Russ.)]
  3. Gusev E., Sarapultsev A., Solomatina L., Chereshnev V. SARS-CoV-2-Specific immune response and the pathogenesis of COVID-19. Int. J. Mol. Sci., 2022, Vol. 23, no. 3, 1716. doi: 10.3390/ijms23031716.
  4. Jouan Y., Guillon A., Gonzalez L., Perez Y., Boisseau C., Ehrmann S., Ferreira M., Daix T., Jeannet R., François B., Dequin P.F., Si-Tahar M., Baranek T., Paget C. Phenotypical and functional alteration of unconventional T cells in severe COVID-19 patients. J. Exp. Med., 2020, Vol. 217, no. 12, e20200872. doi: 10.1084/jem.20200872.
  5. Kunz N., Kemper C. Complement has brains-do intracellular complement and immunometabolism cooperate in tissue homeostasis and behavior. Front. Immunol., 2021, Vol. 12, 629986. doi: 10.3389/fimmu.2021.629986.
  6. Le Friec G., Sheppard D., Whiteman P., Karsten C.M., Shamoun S.A., Laing A. The CD46-Jagged1 interaction is critical for human TH1 immunity. Nat. Immunol., 2012, Vol. 13, no. 12, pp. 1213-1221.
  7. Li M., Guo W., Dong Y., Wang X., Dai D., Liu X., Wu Y., Li M., Zhang W., Zhou H., Zhang Z., Lin L., Kang Z., Yu T., Tian C., Qin R., Gui Y., Jiang F., Fan H., Heissmeyer V., Sarapultsev A., Wang L., Luo S., Hu D. Elevated exhaustion levels of NK and CD8+ T cells as indicators for progression and prognosis of COVID-19 disease. Front. Immunol., 2020, Vol. 11, 580237. doi: 10.3389/fimmu.2020.580237.
  8. Liszewski M.K., Atkinson J.P. Membrane cofactor protein (MCP; CD46): deficiency states and pathogen connections. Curr. Opin. Immunol., 2021, Vol. 72, pp. 126-134.
  9. Masselli E., Vaccarezza M., Carubbi C., Pozzi G., Presta V., Mirandola P., Vitale M. NK cells: A double edge sword against SARS-CoV-2. Adv. Biol. Regul., 2020, Vol. 77, 100737. doi: 10.1016/j.jbior.2020.100737.
  10. Mitsuyama Y., Yamakawa K., Kayano K., Maruyama M., Wada T., Fujimi S. Prolonged enhancement of cytotoxic T lymphocytes in the post-recovery state of severe COVID-19. J. Intensive Care, 2021, Vol. 9, 76. doi: 10.1186/s40560-021-00591-3.
  11. Persson B.D., John L., Rafie K., Strebl M., Frängsmyr L., Ballmann M.Z., Mindler K., Havenga M., Lemckert A., Stehle T., Carlson L.A., Arnberg N. Human species D adenovirus hexon capsid protein mediates cell entry through a direct interaction with CD46. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 2021, Vol. 118, no. 3, e2020732118. doi: 10.1073/pnas.2020732118.
  12. Stein K.R., Gardner T.J., Hernandez R.E., Kraus T.A., Duty J.A., Ubarretxena-Belandia I., Moran T.M., Tortorella D. CD46 facilitates entry and dissemination of human cytomegalovirus. Nat. Commun., 2019, Vol. 10, no. 1, 2699. doi: 10.1038/s41467-019-10587-1.
  13. Verdecchia P., Cavallini C., Spanevello A., Angelim F. The pivotal link between ACE2 deficiency and SARS-cov-2 infection. Eur. J. Intern. Med., 2020, Vol. 76, pp. 14-20.
  14. Wu Y., Huang X., Sun J., Xie T., Lei Y., Muhammad J., Li X., Zeng X., Zhou F., Qin H., Shao L., Zhang Q. Clinical characteristics and immune injury mechanisms in 71 patients with COVID-19. mSphere, 2020, Vol. 5, no. 4, e00362-20. doi: 10.1128/mSphere.00362-20.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML

© Добрынина М.А., Зурочка А.В., Комелькова М.В., Ло Ш., Зурочка В.А., Дэшэн Х., Рябова Л.В., Сарапульцев А.П., 2022

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № 77 - 11525 от 04.01.2002.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах