Отправить статью по E-mail Экспериментальное перепрограммирование in vitro трансформированного фенотипа 2 субпопуляций нейтрофильных гранулоцитов детей с острой деструктивной пневмонией с использованием синтетического гексапептида
- Авторы: Нестерова И.В.1,2, Чапурина В.Н.1, Чудилова Г.А.1, Тараканов В.А.1
-
Учреждения:
- ФГБОУ ВО «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ
- ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов»
- Выпуск: Том 25, № 4 (2022)
- Страницы: 465-470
- Раздел: КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
- Дата подачи: 13.07.2022
- Дата принятия к публикации: 28.07.2022
- Дата публикации: 07.10.2022
- URL: https://rusimmun.ru/jour/article/view/1175
- DOI: https://doi.org/10.46235/1028-7221-1175-EIV
- ID: 1175
Цитировать
Полный текст
Аннотация
Эффекторные дисфункции нейтрофильных гранулоцитов часто ассоциированы с возникновением дисрегуляторных процессов в антибактериальной иммунной защите. Острая деструктивная пневмония – тяжелое гнойно-воспалительное заболевание, сопряженное с дискордантной работой эффекторных механизмов нейтрофильных гранулоцитов и появлением негативно трансформированных субпопуляций. В связи с чем поиск новых экспериментальных подходов, направленных на переориентирование негативно измененного фенотипа различных субпопуляций нейтрофильных гранулоцитов детей с острой деструктивной пневмонией с использованием различных иммунотропных субстанций, является весьма актуальным. Цель исследования: в «закрытой экспериментальной системе in vitro» оценить модулирующие эффекты влияния синтетического Гексапептида (Arginyl-alpha-Aspartyl-Lysyl-Valyl-Tyrosyl-Arginine) на содержание и фенотип 2 функционально-значимых субпопуляций мажорной – CD16+СD64-CD32+CD11b+ и минорной – CD16+СD64+CD32+CD11b+ нейтрофильных гранулоцитов детей с нетипично протекающей острой деструктивной пневмонией. Исследовано 20 образцов периферической крови 10 детей с острой деструктивной пневмонией и 40 образцов периферической крови 20 условно здоровых детей 2-4 лет. Проведено иммунофенотипирование 2 субпопуляций нейтрофильных гранулоцитов с учетом плотности экспрессии мембранных рецепторов по MFI. Фенотипические особенности субпопуляций нейтрофильных гранулоцитов оценивались в системе in vitro до и после инкубации периферической крови с Гексапептидом (10-6 г/л; t – 37 °C, 60 мин). У детей с острой деструктивной пневмонией, по сравнению с условно здоровыми детьми, установлены варианты негативной трансформации изучаемых субпопуляций нейтрофильных гранулоцитов: выявлено значительное уменьшение доли мажорной субпопуляции с 98,0 (96,9-98,7) % до 55,8 (35,3-74,8) % со снижением плотности экспрессии CD16 и CD11b по MFI и достоверное увеличение доли минорной субпопуляции с 1,3 (0,4-1,6) % до 52,6 (41,8-54,9) % с усилением экспрессии активационного рецептора CD11b и снижением экспрессии СD64. В «закрытой системе in vitro» продемонстрированы иммуномодулирующие эффекты влияний Гексапептида на нейтрофильные гранулоциты детей с острой деструктивной пневмонией: позитивное ремодулирование измененного фенотипа обеих субпопуляций при отсутствии достоверных количественных изменений. Так, под влиянием гексапептида установлено достоверное повышение экспрессии активационных рецепторов CD16, CD11b в мажорной субпопуляции и достоверное снижение их экспрессии в минорной субпопуляции до уровня таковых у условно здоровых детей. В то же время Гексапептид не повлиял на изучаемые субпопуляции нейтрофильных гранулоцитов условно здоровых детей. Исключение составило увеличение экспрессии СD64 в минорной субпопуляции. Полученные данные могут быть использованы в дальнейшем для разработки новых методов таргетной иммунотерапии, направленной на коррекцию фенотипа субпопуляций нейтрофильных гранулоцитов при острой деструктивной пневмонии у детей.
Полный текст
Введение
В настоящее время актуальной проблемой здравоохранения является поиск новых терапевтических стратегий в лечении тяжелых гнойно-воспалительных заболеваний (ГВЗ), таких как острая деструктивная пневмония (ОДП), ассоциированных с эффекторными дисфункциями нейтрофильных гранулоцитов (НГ), лежащих в основе дисрегуляторных процессов противоинфекционного иммунитета [3, 6].
НГ – главенствующие клетки противобактериальной защиты, наделенные возможностями активации и регуляции иммунного ответа. Механизмы функционирования НГ зависят от рецепторного аппарата клетки, молниеносно реагирующего на сдвиги в иммунном гомеостазе [1, 8]. Существуют многообразные субпопуляции НГ с различной функциональной активностью, в основе которой лежат количественные и качественные характеристики мембранных рецепторов, таких как CD16 (FcãRIII), CD32 (FcãRII), CD11b (Mac-1/CR3A), CD64 (FcãRI), отвечающих за эффекторные механизмы клетки [5, 7]. При дисфункциях рецепторного аппарата НГ наблюдается срыв противомикробной защиты, приводящий к развитию тяжело протекающих ГВЗ, резистентных к антибактериальным препаратам [4]. С нашей точки зрения, векторное влияние на субпопуляции НГ может стать «ключом» в лечении нетипично протекающих ГВЗ, что позволит таргетно корректировать дисфункции НГ.
В плане исследования особый интерес представляет изучение эффектов Гексапептида (Arginyl-alpha-Aspartyl-Lysyl-Valyl-Tyrosyl-Arginine, ГП) – синтетической субстанции активного центра гормона тимуса – тимопоэтина, обладающей биологическими свойствами нативного гормона, с оценкой ее влияния на субпопуляции НГ [2].
Цель исследования – в «закрытой экспериментальной системе in vitro» оценить модулирующие эффекты влияния синтетического Гексапептида (Arginyl-alpha-Aspartyl-Lysyl-Valyl-Tyrosyl-Arginine) на содержание и фенотип 2 функционально-значимых субпопуляций мажорной – CD16+СD64-CD32+CD11b+ и минорной – CD16+СD64+CD32+CD11b+ нейтрофильных гранулоцитов детей с нетипично протекающей острой деструктивной пневмонией.
Материалы и методы
Для изучения влияния ГП на субпопуляции НГ исследовано 60 образцов периферической крови (ПК). Обследовано 20 условно здоровых детей (10 мальчиков и 10 девочек) 2-4 лет: образцы ПК до инкубации вошли в группу сравнения 1, после инкубации с ГП – в группу исследования 1. Также под наблюдением находилось 10 детей (6 мальчиков и 4 девочек) 2-4 лет с ОДП, образцы ПК которых до инкубации составили группу сравнения 2, после инкубации с ГП – группу исследования 2.
Инкубацию с синтетическим ГП проводили в течение 1 часа при Т 37 °С в концентрации 10-6 г/л. Методом проточной цитометрии (FC 500 Beckman Coulter, США) определяли содержание субпопуляций НГ (%НГ), одномоментно экспрессирующих рецепторы CD16, CD64, CD32, CD11b, с оценкой плотности экспрессии по интенсивности флуоресценции (MFI).
Перед включением детей в исследование у родителей было получено информированное согласие на участие в исследовании, забор ПК, обработку данных и публикацию результатов в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации.
Для статистической обработки использовались Microsoft Exel 2016 и StatPlus 2017. В сравнении групп применялись непараметрические критерии: U-критерий Манна–Уитни и критерий Шапиро–Уилка. Результаты выражали в виде медианы (Ме) и интерквантильного размаха (Q0,25-Q0,75). Различие групп полагали статистически значимым при p < 0,05.
Результаты и обсуждение
Анализ полученных данных продемонстрировал, что в ПК условно здоровых детей регистрируется мажорная субпопуляция НГ – CD16+СD64-CD32+CD11b+, доля которой составляет 98,0 (96,5-98,7)%, характеризующаяся высоким уровнем плотности экспрессии по MFI CD16, средним MFI CD11b и CD32, что соответствует фенотипу субпопуляции CD16brightСD64-CD32midCD11bmid. При этом в ПК группы сравнения 1 присутствует также минорная субпопуляция – CD16+СD64+CD32+CD11b+НГ, количество которой составляет 1,3 (0,4-1,6)%, имеющая одинаковое с мажорной субпопуляцией оснащение по MFI CD11b и CD32, более низкий MFI CD16 и отличающаяся экспрессией CD64, с фенотипом CD16midСD64brightCD32midCD11bmid (табл. 1).
ТАБЛИЦА 1. ВЛИЯНИЕ ГЕКСАПЕПТИДА НА ФЕНОТИП СУБПОПУЛЯЦИЙ CD16+СD64-CD32+CD11b+ И CD16+CD64+CD32+CD11b+ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ УСЛОВНО ЗДОРОВЫХ ДЕТЕЙ И ДЕТЕЙ С ОСТРОЙ ДЕСТРУКТИВНОЙ ПНЕВМОНИЕЙ IN VITRO, Me (Q0,25-Q0,75)
TABLE 1. EFFECT OF HEXAPEPTIDE ON PHENOTYPE OF CD16+СD64-CD32+CD11b+ AND CD16+CD64+CD32+CD11b+ NEUTROPHIL GRANULOCYTES OF CONDITIONALLY HEALTHY CHILDREN AND CHILDREN WITH ACUTE DESTRUCTIVE PNEUMONIA IN VITRO, Me (Q0.25-Q0.75)
Субпопуляция СD16+СD64- CD32+CD11b+НГ Subset СD16+СD64-CD32+CD11b+NG | |||||
Группы Groups | %НГ %NG | MFI СD16 | MFI CD32 | MFI CD11b | |
фенотип phenotype | CD16brightСD64-CD32midCD11bmid | ||||
НГ условно здоровых детей до инкубации NG of Healthy children before incubation | 98,0 (96,9-98,7) | 132,5 (120,5-144,5) | 5,7 (4,4-6,2) | 22,4 (20,9-25,7) | |
НГ условно здоровых детей после инкубации с ГП NG of Healthy children after incubation with HP | фенотип phenotype | CD16brightСD64-CD32midCD11bmid | |||
98,7 (97,8-99,2) | 131,8 (125,4-133,5) | 5,9 (4,8-7,6) | 19,7 (16,9-20,7) | ||
НГ детей с ОДП до инкубации NG of Children with ADP before incubation | фенотип phenotype | CD16midСD64-CD32midCD11bdim | |||
55,8* (35,3-74,8) | 112,2* (86,1-115,7) | 4,9 (3,7-6,2) | 15,2* (14,7-15,5) | ||
НГ детей с ОДП после инкубации с ГП NG of Children with ADP after incubation with HP | фенотип phenotype | CD16brightСD64-CD32midCD11bmid | |||
49,6* (24,1-73,4) | 123,5^ (118,5-134,7) | 6,11 (4,5-8,3) | 23,75^ (21,1-28,0) | ||
Субпопуляция СD16+СD64+CD32+CD11b+НГ Subset СD16+СD64+CD32+CD11b+NG | |||||
%НГ %NG | MFI CD16 | MFI CD64 | MFICD32 | MFI CD11b | |
НГ условно здоровых детей до инкубации NG of Healthy children before incubation | фенотип phenotype | CD16midСD64brightCD32midCD11bmid | |||
1,3 (0,4-1,6) | 91,5 (82,2-106,5) | 9,3 (9,2-9,6) | 6,5 (5,0-8,9) | 19,8 (16,4-26,9) | |
НГ условно здоровых детей после инкубации с ГП NG of Healthy children after incubation with HP | фенотип phenotype | CD16midСD64brightCD32midCD11bmid | |||
1,2 (0,9-1,3) | 89,6 (80,8-91,7) | 23,3* (14,98-30,20) | 7,6 (4,96-10,00) | 16,8 (16,0-19,2) | |
НГ детей с ОДП до инкубации NG of Children with ADP before incubation | фенотип phenotype | CD16midСD64dimCD32midCD11bbright | |||
52,6* (41,8-54,9) | 129 (83,5-131,0) | 3,1* (2,9-3,4) | 7,2 (5,6-7,9) | 31,2* (27,3-35,2) | |
НГ детей с ОДП после инкубации с ГП NG of Children with ADP after incubation with HP | фенотип phenotype | CD16midСD64dimCD32midCD11bmid | |||
47,9* (23,9-51,3) | 91,7 (57,8-117,0) | 3,3* (3,0-3,9) | 5,2 (2,8-8,6) | 17,3^ (15,8-17,9) | |
Примечание. * – значимые различия относительно группы условно здоровых детей, p < 0,05; ^ – значимые различия относительно группы детей с ОДП, p < 0,05.
Note. *, significant differences relative to the group of healthy children, p < 0.05; ^, significant differences relative to the group of children with ADP, p < 0.05.
При оценке эффектов влияния ГП на НГ группы условно здоровых детей установлено сохранение содержания мажорной и минорной субпопуляций (р1, 2 > 0,05), MFI CD16, CD32 и CD11b в обеих субпопуляциях НГ оставались на уровне показателей группы сравнения 1 (р1, 2, 3 > 0,05) на фоне повышения в 3 раза MFI СD64 в субпопуляции CD16+СD64+CD32+CD11b+НГ относительно показателей до инкубации (р < 0,05) (табл. 1).
Исследование ПК детей с ОДП позволило установить достоверное снижение в 1,7 раз доли мажорной субпопуляции (р < 0,05) относительно показателей условно здоровых детей, с появлением трансформированного фенотипа CD16midСD64-CD32midCD11bdimНГ, имеющего сниженный MFI CD16 и CD11b (р1, 2 < 0,05) и неизмененный MFI CD32 (р > 0,05). Количество НГ минорной субпопуляции в группе сравнения 2 увеличилось в 30 раз относительно группы сравнения 1 (р < 0,05), на фоне снижения в 3 раза MFI CD64, увеличения в 1,6 раз MFI CD11b (р1, 2 < 0,05) и тенденций к увеличению MFI CD16 и СD32 (р1, 2 > 0,05), что характеризует фенотип субпопуляции как CD16brighСD64dimCD32midCD11bbright (табл. 1).
В образцах ПК детей с ОДП после инкубации с ГП содержание субпо- пуляций CD16+СD64-CD32+CD11b+НГ и CD16+СD64+CD32+CD11b+НГ не изменялось и оставалось на уровне показателей группы сравнения 2. При этом отмечалась реорганизация фенотипических профилей до показателей условно здоровых детей: усиление MFI CD16 и MFI CD11b в мажорной субпопуляции (р1, 2 > 0,05), с восстановлением фенотипа CD16brightСD64-CD32midCD11bmid, и снижение их экспрессии в минорной субпопуляции (р1, 2 < 0,05), с приобретением фенотипа CD16midСD64dimCD32midCD11bmid (табл. 1).
Таким образом, в «закрытой экспериментальной системе in vitro» выявлены иммуномодулирующие эффекты ГП, выражающиеся в отсутствии влияния на не измененный фенотип субпопуляций НГ условно здоровых детей и позитивным ремодулированием негативно трансформированного фенотипа мажорной и минорной субпопуляций НГ детей с нетипично протекающей ОДП.
Заключение
Проведенное в «закрытой экспериментальной системе in vitro» исследование продемонстрировало модулирующее влияние ГП на субпопуляции CD16+СD64-CD32+CD11b+ и CD16+СD64+CD32+CD11b+НГ. Так под действием ГП в ПК условно здоровых детей не изменялось содержание и фенотип изучаемых субпопуляций НГ, исключение составило достоверное увеличение в 3 раза экспрессии СD64 в минорной субпопуляции. Эффекты ГП на НГ детей с ОДП проявлялись позитивным ремодулированием фенотипа изучаемых субпопуляций при отсутствии количественных изменений. В обеих субпопуляциях отмечалось восстановление MFI активационных рецепторов CD16 и CD11b до показателей условно здоровых детей. Полученные данные оцениваются как положительный иммуномодулирующий эффект ГП и в дальнейшем могут быть использованы для разработки новых методов таргетной иммунотерапии с использованием лекарственной формы данной субстанции, направленной на коррекцию фенотипа субпопуляций нейтрофильных гранулоцитов при ОДП у детей.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 20-315-90069.
Об авторах
И. В. Нестерова
ФГБОУ ВО «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ; ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов»
Автор, ответственный за переписку.
Email: inesterova1@yandex.ru
д.м.н., профессор, главный научный сотрудник отдела клинико-экспериментальной иммунологии и молекулярной биологии Центральной научно-исследовательской лаборатории; профессор кафедры аллергологии и иммунологии факультета непрерывного медицинского образования
Россия, Краснодар; МоскваВ. Н. Чапурина
ФГБОУ ВО «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ
Email: inesterova1@yandex.ru
ассистент кафедры клинической иммунологии, аллергологии и лабораторной диагностики ФПК и ППС
Россия, КраснодарГ. А. Чудилова
ФГБОУ ВО «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ
Email: inesterova1@yandex.ru
д.б.н., доцент, заведующая отделом клинико-экспериментальной иммунологии и молекулярной биологии Центральной научно-исследовательской лаборатории, профессор кафедры клинической иммунологии, аллергологии и лабораторной диагностики ФПК и ППС
Россия, КраснодарВ. А. Тараканов
ФГБОУ ВО «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ
Email: inesterova1@yandex.ru
д.м.н., профессор, заведующий кафедрой хирургических болезней детского возраста
Россия, КраснодарСписок литературы
- Долгушин И.И. Нейтрофильные гранулоциты: новые лица старых знакомых // Бюллетень сибирской медицины, 2019. Т. 18, № 1. С. 30-37. [Dolgushin I.I. Neutrophil granulocytes: new faces of old acquaintances. Byulleten sibirskoy meditsiny = Bulletin of Siberian Medicine, 2019, Vol. 18, no. 1, pp. 30-37. (In Russ.)]
- Маркова Т.П., Чувиров Д.Г. Имунофан в комплексном лечении детей c повторными респираторными заболеваниями и микоплазменной инфекцией // Эффективная фармакотерапия, 2022. Т. 18, № 12. С. 12-18. [Markova T.P., Chuvirov D.G. Immunotherapy with imunofan to the treatment of children with recurrent respiratory deseasis and mycoplasma pneumoniae infection. Effektivnaya farmakoterapiya = Effective Pharmacotherapy, 2022, Vol. 18, no. 12, pp. 12-18. (In Russ.)]
- Мехриддинов М.К. Роль иммунологических факторов в патогенезе развития деструктивных форм пневмоний у детей // Central Asian Journal of Medical and Natural Sciences, 2022. Т. 3, №. 2. С. 234-238. [Mehriddinov M.K. The role of immunological factors in the pathogenesis of the development of destructive forms of pneumonia in children. Central Asian Journal of Medical and Natural Sciences, 2022, Vol. 3, no. 2, pp. 234-238.
- Нестерова И.В., Ковалева С.В., Чудилова Г.А., Малиновская В.В. Интерфероно- и иммунотерапия в реабилитации иммунокомпрометированных детей с возвратными респираторными инфекциями // Иммунотерапия в практике ЛОР-врача и терапевта / Под ред. А.С. Симбирцев, Г.В. Лавренова. СПб.: Диалог, 2018. С. 167-189. [Nesterova I.V., Kovaleva S.V., Chudilova G.A., Malinovskaya V.V. Interferon and immunotherapy in the rehabilitation of immunocompromised children with recurrent respiratory infections. Immunotherapy in the practice of ENT doctor and therapist / Ed. Simbirtsev A.S., Lavrenova G.V.] St. Petersburg: Dialog, 2018, pp. 167-189.
- Нестерова И.В., Колесникова Н.В., Чудилова Г.А., Ломтатидзе Л.В., Ковалева С.В., Евглевский А.А., Нгуен Т.Л. Новый взгляд на нейтрофильные гранулоциты: переосмысление старых догм. Часть 2 // Инфекция и иммунитет, 2018. Т. 8, № 1. С. 7-18. [Nesterova I.V., Kolesnikova N.V., Chudilova G.A., Lomtatidze L.V., Kovaleva S.V., Evglevsky A.A., Nguyen T.L. The new look at neutrophilic granulocytes: rethinking old dogmas. Part 2. Infektsiya i immunitet = Russian Journal of Infection and Immunity, 2018, Vol. 8, no. 1. pp. 7-18. (In Russ.)] doi: 10.15789/2220-7619-2018-1-7-18.
- Оптимизация диагностики и лечения гнойно-воспалительных заболеваний (Инновационные технологии): Практическое руководство / Под ред. Ревишвили А.Ш., Земскова В.М., Земскова А.М. СПб.: СпецЛит, 2020. 319 с. [Optimization of diagnostics and treatment of purulent-inflammatory diseases (innovative technologies) / Ed. Revishvili A.Sh., Zemskov V.M., Zemskov A.M.]. St. Petersburg: SpetsLit, 2020. 319 p.
- Hong C.W. Current understanding in neutrophil differentiation and heterogeneity. Immune Netw., 2017, Vol. 17, no. 5, pp. 298-306.
- Neutrophils. Ed. Khajah M. London: Intechopen limited, 2019. 85 p.
Дополнительные файлы
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).