Experimental in vitro phenotype reprogramming of two subsets of neutrophilic granulocytes in children with acute destructive pneumonia by means of a synthetic hexapeptide

I. V. Nesterova; Нестерова И. В.; V. N. Chapurina; Чапурина В. Н.; G. A. Chudilova; Чудилова Г. А.; V. A. Tarakanov; Тараканов В. А.

doi:10.46235/1028-7221-1175-EIV

Experimental in vitro phenotype reprogramming of two subsets of neutrophilic granulocytes in children with acute destructive pneumonia by means of a synthetic hexapeptide

Authors: Nesterova I.V.¹^,2, Chapurina V.N.¹, Chudilova G.A.¹, Tarakanov V.A.¹
Affiliations:
1. Kuban State Medical University
2. Peoples’ Friendship University of Russia
Issue: Vol 25, No 4 (2022)
Pages: 465-470
Section: SHORT COMMUNICATIONS
Submitted: 13.07.2022
Accepted: 28.07.2022
Published: 07.10.2022
URL: https://rusimmun.ru/jour/article/view/1175
DOI: https://doi.org/10.46235/1028-7221-1175-EIV
ID: 1175

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Effector dysfunctions of neutrophil granulocytes are often associated with the occurrence of dysregulatory processes in the antibacterial immune defense. Acute destructive pneumonia is a severe purulent-inflammatory disease associated with discordant functions of effector mechanisms of neutrophil granulocytes and emergence of negatively transformed cell subsets. Therefore, the search for new experimental approaches aimed at re-orientation of negatively altered phenotype of distinct subsets of neutrophilic granulocytes in the children with acute destructive pneumonia by means of various immunotropic substances is quite relevant. The aim of the study was to evaluate the modulating effects of synthetic hexapeptide (Arginyl-alpha-Aspartyl-Lysyl-Valyl-Tyrosyl-Arginine) on the contents and phenotype of 2 functionally significant subsets of major (CD16⁺CD64^-CD32⁺CD11b⁺) and minor (CD16⁺CD64⁺CD32⁺CD11b⁺) subpopulations of neutrophils in a «closed in vitro experimental system» sampled in the children with atypical acute destructive pneumonia. We have examined twenty peripheral blood samples from 10 children with acute destructive pneumonia, and 40 blood samples of 20 healthy children 2-4 years old. Immunophenotyping of neutrophil granulocytes classified in 2 subsets was performed on the basis of expression density of membrane receptors, according to MFI criteria. Phenotypic features of neutrophil granulocyte subsets were evaluated in the in vitro system before and after incubation of peripheral blood with Hexapeptide (10^-6 g/L; 37 °C, 60 min). In children with acute destructive pneumonia, compared with conditionally healthy children, the following variants of negative transformation of the neutrophil subsets were established: a significant decrease in the ratios of the major subset, i.e., from 98.0 (96.9-98.7) % o 55.8 (35.3-74.8) %, with a decreased CD16 and CD11b density expression according to MFI, and a significantly increase ratio of the minor neutrophil subset: from 1.3 (0.4-1.6) % to 52.6 (41.8-54.9) %, with increased expression of CD11b receptor, and a decrease in CD64 expression. Immunomodulatory effects of Hexapeptide upon neutrophil granulocytes of children with acute destructive pneumonia have been demonstrated in the “closed in vitro system” showing positive phenotype remodeling of both cell subsets in the absence of significant quantitative changes. Thus, upon treatment with the hexapeptide, we have found a significantly increased expression of activation receptors CD16, CD11b in the major subset, and a significant decrease in their expression for the minor subset to the levels typical to healthy children. At the same time, hexapeptide did not affect the studied subsets of neutrophils from healthy children, except of increased CD64 expression in the minor subset. The obtained data can be used in future to develop new approaches to the targeted immunotherapy aimed at correcting the phenotype of neutrophil granulocyte subsets in acute destructive pneumonia in children.

Keywords

neutrophil granulocytes, phenotype of subsets, acute destructive pneumonia, hexapeptide, remodeling

Full Text

Введение

В настоящее время актуальной проблемой здравоохранения является поиск новых терапевтических стратегий в лечении тяжелых гнойно-воспалительных заболеваний (ГВЗ), таких как острая деструктивная пневмония (ОДП), ассоциированных с эффекторными дисфункциями нейтрофильных гранулоцитов (НГ), лежащих в основе дисрегуляторных процессов противоинфекционного иммунитета [3, 6].

НГ – главенствующие клетки противобактериальной защиты, наделенные возможностями активации и регуляции иммунного ответа. Механизмы функционирования НГ зависят от рецепторного аппарата клетки, молниеносно реагирующего на сдвиги в иммунном гомеостазе [1, 8]. Существуют многообразные субпопуляции НГ с различной функциональной активностью, в основе которой лежат количественные и качественные характеристики мембранных рецепторов, таких как CD16 (FcãRIII), CD32 (FcãRII), CD11b (Mac-1/CR3A), CD64 (FcãRI), отвечающих за эффекторные механизмы клетки [5, 7]. При дисфункциях рецепторного аппарата НГ наблюдается срыв противомикробной защиты, приводящий к развитию тяжело протекающих ГВЗ, резистентных к антибактериальным препаратам [4]. С нашей точки зрения, векторное влияние на субпопуляции НГ может стать «ключом» в лечении нетипично протекающих ГВЗ, что позволит таргетно корректировать дисфункции НГ.

В плане исследования особый интерес представляет изучение эффектов Гексапептида (Arginyl-alpha-Aspartyl-Lysyl-Valyl-Tyrosyl-Arginine, ГП) – синтетической субстанции активного центра гормона тимуса – тимопоэтина, обладающей биологическими свойствами нативного гормона, с оценкой ее влияния на субпопуляции НГ [2].

Цель исследования – в «закрытой экспериментальной системе in vitro» оценить модулирующие эффекты влияния синтетического Гексапептида (Arginyl-alpha-Aspartyl-Lysyl-Valyl-Tyrosyl-Arginine) на содержание и фенотип 2 функционально-значимых субпопуляций мажорной – CD16⁺СD64^-CD32⁺CD11b⁺ и минорной – CD16⁺СD64⁺CD32⁺CD11b⁺ нейтрофильных гранулоцитов детей с нетипично протекающей острой деструктивной пневмонией.

Материалы и методы

Для изучения влияния ГП на субпопуляции НГ исследовано 60 образцов периферической крови (ПК). Обследовано 20 условно здоровых детей (10 мальчиков и 10 девочек) 2-4 лет: образцы ПК до инкубации вошли в группу сравнения 1, после инкубации с ГП – в группу исследования 1. Также под наблюдением находилось 10 детей (6 мальчиков и 4 девочек) 2-4 лет с ОДП, образцы ПК которых до инкубации составили группу сравнения 2, после инкубации с ГП – группу исследования 2.

Инкубацию с синтетическим ГП проводили в течение 1 часа при Т 37 °С в концентрации 10^-6 г/л. Методом проточной цитометрии (FC 500 Beckman Coulter, США) определяли содержание субпопуляций НГ (%НГ), одномоментно экспрессирующих рецепторы CD16, CD64, CD32, CD11b, с оценкой плотности экспрессии по интенсивности флуоресценции (MFI).

Перед включением детей в исследование у родителей было получено информированное согласие на участие в исследовании, забор ПК, обработку данных и публикацию результатов в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации.

Для статистической обработки использовались Microsoft Exel 2016 и StatPlus 2017. В сравнении групп применялись непараметрические критерии: U-критерий Манна–Уитни и критерий Шапиро–Уилка. Результаты выражали в виде медианы (Ме) и интерквантильного размаха (Q_0,25-Q_0,75). Различие групп полагали статистически значимым при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

Анализ полученных данных продемонстрировал, что в ПК условно здоровых детей регистрируется мажорная субпопуляция НГ – CD16⁺СD64^-CD32⁺CD11b⁺, доля которой составляет 98,0 (96,5-98,7)%, характеризующаяся высоким уровнем плотности экспрессии по MFI CD16, средним MFI CD11b и CD32, что соответствует фенотипу субпопуляции CD16^brightСD64^-CD32^midCD11b^mid. При этом в ПК группы сравнения 1 присутствует также минорная субпопуляция – CD16⁺СD64⁺CD32⁺CD11b⁺НГ, количество которой составляет 1,3 (0,4-1,6)%, имеющая одинаковое с мажорной субпопуляцией оснащение по MFI CD11b и CD32, более низкий MFI CD16 и отличающаяся экспрессией CD64, с фенотипом CD16^midСD64^brightCD32^midCD11b^mid (табл. 1).

ТАБЛИЦА 1. ВЛИЯНИЕ ГЕКСАПЕПТИДА НА ФЕНОТИП СУБПОПУЛЯЦИЙ CD16⁺СD64^-CD32⁺CD11b⁺ И CD16⁺CD64⁺CD32⁺CD11b⁺ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ УСЛОВНО ЗДОРОВЫХ ДЕТЕЙ И ДЕТЕЙ С ОСТРОЙ ДЕСТРУКТИВНОЙ ПНЕВМОНИЕЙ IN VITRO, Me (Q_0,25-Q_0,75)

TABLE 1. EFFECT OF HEXAPEPTIDE ON PHENOTYPE OF CD16⁺СD64^-CD32⁺CD11b⁺ AND CD16⁺CD64⁺CD32⁺CD11b⁺ NEUTROPHIL GRANULOCYTES OF CONDITIONALLY HEALTHY CHILDREN AND CHILDREN WITH ACUTE DESTRUCTIVE PNEUMONIA IN VITRO, Me (Q_0.25-Q_0.75)

Субпопуляция СD16⁺СD64^- CD32⁺CD11b⁺НГ

Subset СD16⁺СD64^-CD32⁺CD11b⁺NG

Группы

Groups

%НГ

%NG

MFI СD16

MFI CD32

MFI CD11b

фенотип

phenotype

CD16^brightСD64^-CD32^midCD11b^mid

НГ условно здоровых детей до инкубации

NG of Healthy children before incubation

98,0

(96,9-98,7)

132,5

(120,5-144,5)

5,7

(4,4-6,2)

22,4

(20,9-25,7)

НГ условно здоровых детей после инкубации с ГП

NG of Healthy children after incubation with HP

фенотип

phenotype

CD16^brightСD64^-CD32^midCD11b^mid

98,7

(97,8-99,2)

131,8

(125,4-133,5)

5,9

(4,8-7,6)

19,7

(16,9-20,7)

НГ детей с ОДП до инкубации

NG of Children with ADP before incubation

фенотип

phenotype

CD16^midСD64^-CD32^midCD11b^dim

55,8*

(35,3-74,8)

112,2*

(86,1-115,7)

4,9

(3,7-6,2)

15,2*

(14,7-15,5)

НГ детей с ОДП после инкубации с ГП

NG of Children with ADP after incubation with HP

фенотип

phenotype

CD16^brightСD64^-CD32^midCD11b^mid

49,6*

(24,1-73,4)

123,5^

(118,5-134,7)

6,11

(4,5-8,3)

23,75^

(21,1-28,0)

Субпопуляция СD16⁺СD64⁺CD32⁺CD11b⁺НГ

Subset СD16⁺СD64⁺CD32⁺CD11b⁺NG

%НГ

%NG

MFI CD16

MFI CD64

MFICD32

MFI CD11b

НГ условно здоровых детей до инкубации

NG of Healthy children before incubation

фенотип

phenotype

CD16^midСD64^brightCD32^midCD11b^mid

1,3

(0,4-1,6)

91,5

(82,2-106,5)

9,3

(9,2-9,6)

6,5

(5,0-8,9)

19,8

(16,4-26,9)

НГ условно здоровых детей после инкубации с ГП

NG of Healthy children after incubation with HP

фенотип

phenotype

CD16^midСD64^brightCD32^midCD11b^mid

1,2

(0,9-1,3)

89,6

(80,8-91,7)

23,3*

(14,98-30,20)

7,6

(4,96-10,00)

16,8

(16,0-19,2)

НГ детей с ОДП до инкубации

NG of Children with ADP before incubation

фенотип

phenotype

CD16^midСD64^dimCD32^midCD11b^bright

52,6*

(41,8-54,9)

129

(83,5-131,0)

3,1*

(2,9-3,4)

7,2

(5,6-7,9)

31,2*

(27,3-35,2)

НГ детей с ОДП после инкубации с ГП

NG of Children with ADP after incubation with HP

фенотип

phenotype

CD16^midСD64^dimCD32^midCD11b^mid

47,9*

(23,9-51,3)

91,7

(57,8-117,0)

3,3*

(3,0-3,9)

5,2

(2,8-8,6)

17,3^

(15,8-17,9)

Примечание. * – значимые различия относительно группы условно здоровых детей, p < 0,05; ^ – значимые различия относительно группы детей с ОДП, p < 0,05.

Note. *, significant differences relative to the group of healthy children, p < 0.05; ^, significant differences relative to the group of children with ADP, p < 0.05.

При оценке эффектов влияния ГП на НГ группы условно здоровых детей установлено сохранение содержания мажорной и минорной субпопуляций (р_{1, 2} > 0,05), MFI CD16, CD32 и CD11b в обеих субпопуляциях НГ оставались на уровне показателей группы сравнения 1 (р_{1, 2, 3} > 0,05) на фоне повышения в 3 раза MFI СD64 в субпопуляции CD16⁺СD64⁺CD32⁺CD11b⁺НГ относительно показателей до инкубации (р < 0,05) (табл. 1).

Исследование ПК детей с ОДП позволило установить достоверное снижение в 1,7 раз доли мажорной субпопуляции (р < 0,05) относительно показателей условно здоровых детей, с появлением трансформированного фенотипа CD16^midСD64^-CD32^midCD11b^dimНГ, имеющего сниженный MFI CD16 и CD11b (р_{1, 2} < 0,05) и неизмененный MFI CD32 (р > 0,05). Количество НГ минорной субпопуляции в группе сравнения 2 увеличилось в 30 раз относительно группы сравнения 1 (р < 0,05), на фоне снижения в 3 раза MFI CD64, увеличения в 1,6 раз MFI CD11b (р_{1, 2} < 0,05) и тенденций к увеличению MFI CD16 и СD32 (р_{1, 2} > 0,05), что характеризует фенотип субпопуляции как CD16^brighСD64^dimCD32^midCD11b^bright (табл. 1).

В образцах ПК детей с ОДП после инкубации с ГП содержание субпо- пуляций CD16⁺СD64^-CD32⁺CD11b⁺НГ и CD16⁺СD64⁺CD32⁺CD11b⁺НГ не изменялось и оставалось на уровне показателей группы сравнения 2. При этом отмечалась реорганизация фенотипических профилей до показателей условно здоровых детей: усиление MFI CD16 и MFI CD11b в мажорной субпопуляции (р_{1, 2} > 0,05), с восстановлением фенотипа CD16^brightСD64^-CD32^midCD11b^mid, и снижение их экспрессии в минорной субпопуляции (р_{1, 2} < 0,05), с приобретением фенотипа CD16^midСD64^dimCD32^midCD11b^mid (табл. 1).

Таким образом, в «закрытой экспериментальной системе in vitro» выявлены иммуномодулирующие эффекты ГП, выражающиеся в отсутствии влияния на не измененный фенотип субпопуляций НГ условно здоровых детей и позитивным ремодулированием негативно трансформированного фенотипа мажорной и минорной субпопуляций НГ детей с нетипично протекающей ОДП.

Заключение

Проведенное в «закрытой экспериментальной системе in vitro» исследование продемонстрировало модулирующее влияние ГП на субпопуляции CD16⁺СD64^-CD32⁺CD11b⁺ и CD16⁺СD64⁺CD32⁺CD11b⁺НГ. Так под действием ГП в ПК условно здоровых детей не изменялось содержание и фенотип изучаемых субпопуляций НГ, исключение составило достоверное увеличение в 3 раза экспрессии СD64 в минорной субпопуляции. Эффекты ГП на НГ детей с ОДП проявлялись позитивным ремодулированием фенотипа изучаемых субпопуляций при отсутствии количественных изменений. В обеих субпопуляциях отмечалось восстановление MFI активационных рецепторов CD16 и CD11b до показателей условно здоровых детей. Полученные данные оцениваются как положительный иммуномодулирующий эффект ГП и в дальнейшем могут быть использованы для разработки новых методов таргетной иммунотерапии с использованием лекарственной формы данной субстанции, направленной на коррекцию фенотипа субпопуляций нейтрофильных гранулоцитов при ОДП у детей.

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 20-315-90069.

About the authors

I. V. Nesterova

Kuban State Medical University; Peoples’ Friendship University of Russia

Author for correspondence.
Email: inesterova1@yandex.ru

MD, PhD (Medicine), Professor, Chief Research Associate, Department of Clinical and Experimental Immunology and Molecular Biology, Central Research Laboratory; Professor, Department of Allergology and Immunology, Faculty of Continuing Medical Education

Russian Federation, Krasnodar; Moscow

V. N. Chapurina

Kuban State Medical University

Email: inesterova1@yandex.ru

Assistant Professor, Department of Clinical Immunology, Allergology and Laboratory Diagnostics

Russian Federation, Krasnodar

G. A. Chudilova

Kuban State Medical University

Email: inesterova1@yandex.ru

PhD, MD (Biology), Associate Professor, Head, Department of Clinical and Experimental Immunology and Molecular Biology, Central Research Laboratory; Professor, Department of Clinical Immunology, Allergology and Laboratory Diagnostics

Russian Federation, Krasnodar

V. A. Tarakanov

Kuban State Medical University

Email: inesterova1@yandex.ru

MD, PhD (Medicine), Professor, Head, Department of Surgical Diseases in Childhood

Russian Federation, Krasnodar

References

Долгушин И.И. Нейтрофильные гранулоциты: новые лица старых знакомых // Бюллетень сибирской медицины, 2019. Т. 18, № 1. С. 30-37. [Dolgushin I.I. Neutrophil granulocytes: new faces of old acquaintances. Byulleten sibirskoy meditsiny = Bulletin of Siberian Medicine, 2019, Vol. 18, no. 1, pp. 30-37. (In Russ.)]
Маркова Т.П., Чувиров Д.Г. Имунофан в комплексном лечении детей c повторными респираторными заболеваниями и микоплазменной инфекцией // Эффективная фармакотерапия, 2022. Т. 18, № 12. С. 12-18. [Markova T.P., Chuvirov D.G. Immunotherapy with imunofan to the treatment of children with recurrent respiratory deseasis and mycoplasma pneumoniae infection. Effektivnaya farmakoterapiya = Effective Pharmacotherapy, 2022, Vol. 18, no. 12, pp. 12-18. (In Russ.)]
Мехриддинов М.К. Роль иммунологических факторов в патогенезе развития деструктивных форм пневмоний у детей // Central Asian Journal of Medical and Natural Sciences, 2022. Т. 3, №. 2. С. 234-238. [Mehriddinov M.K. The role of immunological factors in the pathogenesis of the development of destructive forms of pneumonia in children. Central Asian Journal of Medical and Natural Sciences, 2022, Vol. 3, no. 2, pp. 234-238.
Нестерова И.В., Ковалева С.В., Чудилова Г.А., Малиновская В.В. Интерфероно- и иммунотерапия в реабилитации иммунокомпрометированных детей с возвратными респираторными инфекциями // Иммунотерапия в практике ЛОР-врача и терапевта / Под ред. А.С. Симбирцев, Г.В. Лавренова. СПб.: Диалог, 2018. С. 167-189. [Nesterova I.V., Kovaleva S.V., Chudilova G.A., Malinovskaya V.V. Interferon and immunotherapy in the rehabilitation of immunocompromised children with recurrent respiratory infections. Immunotherapy in the practice of ENT doctor and therapist / Ed. Simbirtsev A.S., Lavrenova G.V.] St. Petersburg: Dialog, 2018, pp. 167-189.
Нестерова И.В., Колесникова Н.В., Чудилова Г.А., Ломтатидзе Л.В., Ковалева С.В., Евглевский А.А., Нгуен Т.Л. Новый взгляд на нейтрофильные гранулоциты: переосмысление старых догм. Часть 2 // Инфекция и иммунитет, 2018. Т. 8, № 1. С. 7-18. [Nesterova I.V., Kolesnikova N.V., Chudilova G.A., Lomtatidze L.V., Kovaleva S.V., Evglevsky A.A., Nguyen T.L. The new look at neutrophilic granulocytes: rethinking old dogmas. Part 2. Infektsiya i immunitet = Russian Journal of Infection and Immunity, 2018, Vol. 8, no. 1. pp. 7-18. (In Russ.)] doi: 10.15789/2220-7619-2018-1-7-18.
Оптимизация диагностики и лечения гнойно-воспалительных заболеваний (Инновационные технологии): Практическое руководство / Под ред. Ревишвили А.Ш., Земскова В.М., Земскова А.М. СПб.: СпецЛит, 2020. 319 с. [Optimization of diagnostics and treatment of purulent-inflammatory diseases (innovative technologies) / Ed. Revishvili A.Sh., Zemskov V.M., Zemskov A.M.]. St. Petersburg: SpetsLit, 2020. 319 p.
Hong C.W. Current understanding in neutrophil differentiation and heterogeneity. Immune Netw., 2017, Vol. 17, no. 5, pp. 298-306.
Neutrophils. Ed. Khajah M. London: Intechopen limited, 2019. 85 p.

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

Username
Password
Remember me

Forgot password?	Register

Username
Password
Remember me

Forgot password?	Register

Experimental in vitro phenotype reprogramming of two subsets of neutrophilic granulocytes in children with acute destructive pneumonia by means of a synthetic hexapeptide

Full Text

Abstract

Keywords

Full Text

Введение

Материалы и методы

Результаты и обсуждение

Заключение

About the authors

I. V. Nesterova

V. N. Chapurina

G. A. Chudilova

V. A. Tarakanov

References

Supplementary files

This website uses cookies