Влияние кукурбитурилов на цитокинпродуцирующую способность мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров

Обложка


Цитировать

Полный текст

Аннотация

В настоящее время ведется большое число разработок, основанных на наноразмерных системах, для доставки лекарственных средств. Одной из таких систем могут служить наноразмерные кавитанды кукурбитурилы, которые благодаря наличию полости способны включать в себя молекулы лекарственного средства. Поскольку иммунная система довольно чувствительна к влиянию наноматериалов и иных повреждающих факторов, необходимо исследование иммунобезопасности новых систем доставки.

Целью данного исследования было исследование влияния наноразмерных кавитандов кукурбитурилов на цитокинпродуцирующую способность мононуклеарных клеток периферической крови условно здоровых доноров.

Мононуклеарные клетки (1 млн/мл) культивировали в присутствии кукурбитурилов в следующих концентрациях: 0,3 мМ кукурбит[6]урила, 0,3 мМ кукурбит[7]урила и 0,01 мМ кукурбит[8]урила в течение 72 ч с дополнительной стимуляцией с помощью аCD3-антител (1 мкг/мл) и без стимуляции. Уровень цитокинов в супернатантах определялся с помощью иммуноферментого анализа.

Было показано, что кукурбит[6]урил в 1,5 раза повышал уровень спонтанной продукции IL-4 (p < 0,01) по сравнению с контролем. В случае оценки стимулированной продукции нами было обнаружено, что кукурбит[6]урил снижает уровень продукции IL-6, а также демонстрирует тенденцию (p = 0,09) к повышению уровня IL-4.

При культивировании клеток с кукурбит[7]урилом была обнаружена тенденция по увеличению продукции провоспалительного TNF. Также было обнаружено, что кукурбит[7]урил способен подавлять продукцию IL-10 в стимулированной aCD3-антителами культуре МНК в 1,5 раза.

В то же время кукурбит[8]урил снижал уровень IFNγ и IL-10 по сравнению с продукцией данных цитокинов в контрольной культуре. В случае оценки влияния кукурбит[8]урила на продукцию IFNγ стимулированными анти-CD3 антителами МНК, достоверных различий не было обнаружено, но также имеется тенденция по снижению концентрации данного цитокина по сравнению с контролем.

Следовательно, кукурбитурилы способны влиять как на спонтанную, так и на стимулированную продукцию цитокинов мононуклеарными клетками крови, и направленность действия на цитокинпродуцирующую способность клеток зависит от рассматриваемого гомолога.

Полный текст

Использование наноразмерных систем доставки лекарственных средств является одним из перспективных направлений, стоящих перед современной наукой. Системы доставки лекарств предполагается применять для достижения определенных преимуществ, а именно: с целью контроля клиренса, защиты препарата от биодеградации, адресной доставки к определенным органам, тканям или клеткам, снижения токсичности, повышения растворимости и т. д. [7] Однако перед применением в клинике различных наноструктур и наноматериалов, используемых при создании систем доставки лекарственных препаратов, требуется всестороннее тщательное изучение новых материалов, в том числе и исследование иммунотропных свойств данных веществ, поскольку клетки иммунной системы являются наиболее чувствительными к повреждающему действию наноматериалов или иных факторов.

Кукурбитурилы – класс наноразмерных макроциклических соединений, способных инкапсулировать молекулу или фрагмент молекулы лекарственного соединения путем образования комплексов «гость – хозяин». Данные соединения состоят из гликольурильных фрагментов, число которых варьирует в зависимости от гомолога. Так, у кукурбит[6]урила шесть гликольурильных фрагментов, а у кукурбит[8]урила – восемь [4]. Несмотря на схожее строение, различные гомологи обладают разными физико-химическими свойствами.

Исследования, посвященные биологической безопасности кукурбитурилов in vitro и in vivo показали, что кукурбитурилы и их производные являются инертными и нетоксичными. При концентрации до 1 мМ кукурбит[7]урил не проявляет цитотоксическую активность по отношению к различным клеточных линиям человека и животных [5, 6]. При введении in vivo кукурбит[7]урила показано, что максимально переносимая доза составляет 250 мг/кг; внутривенное введение кукурбитурилов ограничено из-за низкой растворимости, а не из-за развития побочных эффектов. При пероральном введении смеси кукурбит[6]урила с кукурбит[8]урилом максимально переносимая доза была увеличена до 600 мг/кг, что говорит о низкой токсичности данной смеси [10]. Кукурбитурилы в экспериментах in vivo не показывают никаких признаков острой системной токсичности. При применении кукурбит[7]урила в очень высоких дозах возможны проявления миотоксичности и нейротоксичности, однако в стандартных концентрациях, используемых при комплексообразовании с лекарственными препаратами, признаков токсичности нет [2, 8]. При исследовании влияния на клетки крови было показано, что кукурбитурилы практически не обладают иммунотоксичностью, за исключением возможной индукции апоптоза в культурах иммунокомпетентных клеток, культивированых в присутствии кукурбит[8]урила [1]. Однако кроме иммунотоксичности необходимо также исследовать и возможные иммуномодулирующие свойства систем доставки. Так, к примеру, известно, что PAMAM дендримеры второго и третьего поколения могут усиливать продукцию противовоспалительных цитокинов, что ограничивает возможность применения данных систем доставки [3]. Следовательно, для оценки иммунологической безопасности кукурбитурилов представляется актуальным оценка влияния на цитокинпродуцирующую активность клеток.

Материалы и методы

В качестве материала для исследования служили мононуклеарные клетки периферической крови (МНК ПК) здоровых доноров (n = 7). После подписания информирования согласия у каждого донора кровь из кубитальной вены собиралась в пробирку с гепарином. Выделение МНК осуществлялось стандартным способом, а именно центрифугированием с использованием раствора фиколла с урографином для создания градиента плотности. Выделенные клетки (1 млн/ мл) культивировали в присутствии кукурбитурилов в следующих концентрациях: 0,3 мМ СВ[6], 0,3 мМ СВ[7] и 0,01 мМ СВ[8] в течение 72 ч с дополнительной стимуляцией с помощью аCD3-антител (1 мкг/мл) и без стимуляции. Выбор концентраций объясняется использованием нетоксичной дозы для CB[6] и CB[7] и максимально возможной концентрации CB[8] из-за его низкой растворимости. Далее клеточные культуры центрифугировали 10 минут при 1500 об/мин, после чего аккуратно собирали супернатант и замораживали при -20 °С до использования. Уровень цитокинов в супернатантах определялся с помощью иммуноферментого анализа с использованием тест-систем «Вектор-Бест», Россия (IL- 2, IL-4, IL-6, IL-10, IFNγ, TNF).

Результаты и обсуждение

Уровень продукции цитокинов оценивался в супернатантах от клеточных культур, в данном случае МНК условно здоровых доноров, культивированных в присутствии кукурбит[n]урилов (n = 6, 7, 8). Оценивалась как спонтанная (табл. 1), так и стимулированная анти-CD3-антителами (табл. 2) продукция. Было показано, что кукурбит[6]урил в 1,5 раза повышал уровень спонтанной продукции IL-4 (p < 0,01) по сравнению с контролем.

 

ТАБЛИЦА 1. ВЛИЯНИЕ КУКУРБИТУРИЛОВ НА СПОНТАННУЮ ПРОДУКЦИЮ ЦИТОКИНОВ МОНОНУКЛЕАРНЫМИ КЛЕТКАМИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ, Me (Q0,25-Q0,75)

TABLE 1. EFFECT OF CUCURBITURILS ON SPONTANEOUS CYTOKINE PRODUCTION BY PERIPHERAL BLOOD MONONUCLEAR CELLS OF HEALTHY DONORS, Me (Q0.25-Q0.75)

 

Контроль

Control

СВ[6]

CB[7]

CB[8]

IL-2

10,19

(5,47-11,67)

7,87

(4,56-12,97)

5,57

(2,59-11,80)

6,54#

(3,59-8,86)

IL-4

1,66

(1,39-2,17)

2,32*

(1,78-3,87)

1,56

(1,34-1,77)

1,54

(1,36-4,29)

IL-6

44,72

(39,59-56,63)

56,51

(39,25-59,16)

57,02

(34,86-59,26)

40,77

(31,34-53,95)

IL-10

35,84

(27,12-53,75)

43,36

(27,39-75,13)

35,44

(16,36-89,38)

30,68*

(22,46-45,94)

IFNγ

13,03

(3,83-26,08)

7,26

(3,17-9,02)

13,70

(4,50-29,67)

4,84*

(1,66-9,35)

TNF

23,62

(10,79-38,12)

24,57

(10,43-43,28)

84,16#

(23,26-95,67)

21,46

(16,30-42,56)

Примечание. * – достоверные различия по сравнению с контролем; # – тенденция (p < 0,09) по сравнению с контролем. Данные оценены с помощью критерия Манна–Уитни.

Note. *, significant differences compared to control; #, trend (p < 0.09) compared to control. Data were assessed using the Mann–Whitney U test.

 

ТАБЛИЦА 2. ВЛИЯНИЕ КУКУРБИТУРИЛОВ НА ACD3-ИНДУЦИРОВАННУЮ ПРОДУКЦИЮ ЦИТОКИНОВ МОНОНУКЛЕАРНЫМИ КЛЕТКАМИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ

TABLE 2. EFFECT OF CUCURBITURILS ON ACD3-INDUCED CYTOKINE PRODUCTION BY PERIPHERAL BLOOD MONONUCLEAR CELLS OF HEALTHY DONORS

 

Контроль

Control

СВ[6]

CB[7]

CB[8]

IL-2

46,74

(30,11-58,17)

43,03

(26,91-62,98)

50,97

(23,96-54,41)

36,37

(28,83-48,40)

IL-4

2,24

(1,68-2,64)

2,63#

(2,07-3,34)

2,39

(1,96-3,12)

3,06#

(2,33-3,93)

IL-6

5124,55

(2864,09-5460,91)

4594,76#

(2777,33-5214,76)

4892,89

(3147,74-5029,46)

4770,74

(2844,71-5170,56)

IL-10

501,01

(353,90-600,54)

462,48

(357,06-695,64)

322,78*

(186,14-518,60)

368,14*

(342,34-459,93)

IFNγ

1928,96

(1675,52-2147,64)

1908,72

(1698,32-2241,89)

2096,79

(1541,11-2320,40)

1804,19#

(1525,63-2102,81)

TNF

1260,24

(1089,82-1795,65)

1257,24

(825,77-1804,28)

1508,76

(1149,83-1908,82)

1470,40

(1182,43-1540,29)

Примечание. См. примечание к таблице 1.

Note. As for Table 1.

 

В случае оценки стимулированной продукции нами было обнаружено, что кукурбит[6]урил снижает уровень продукции IL-6, а также демонстрирует тенденцию (p = 0,09) к повышению уровня IL-4. Предположительно, полученные данные о действии на спонтанную и стимулированную продукцию могут говорить о влиянии кукурбит[6]урила на Th1/Th2 баланс со смещением в сторону гуморального иммунного ответа. Ранее было продемонстрировано, что кукурбит[6]урил может способствовать увеличению экспрессии молекул HLA-DR на B-лимфоцитов [9], что также говорит о стимулирующем действии кукурбит[6]урила на гуморальное звено иммунитета.

Кукурбит[7]урил не приводил к статистически значимым изменениям в спонтанной продукции МНК исследуемых цитокинов, однако была замечена тенденция (p = 0,09) по увеличению продукции провоспалительного цитокина TNF. Также было обнаружено, что кукурбит[7]урил способен подавлять продукцию IL-10 в стимулированной aнти-CD3 антителами культуре МНК в 1,5 раза. Подобные результаты могут свидетельствовать об иммуностимулирующем и провоспалительном действии кукурбит[7]урила.

В то же время кукурбит[8]урил подавлял продукцию цитокинов в неактивированных стимуляторами лимфоцитов культурах МНК. Так, было показано достоверное снижение уровня IFNγ и IL-10 по сравнению с продукцией данных цитокинов в контрольной культуре. Кроме того, наблюдалась тенденция (p = 0,09) по снижению уровня IL-2 МНК ПК, культивированных в присутствии кукурбит[8]урила. Кроме того, кукурбит[8]урил приводил к снижению продукции IL-10 и стимулированными МНК ПК. В случае оценки влияния кукурбит[8]урила на продукцию IFNγ стимулированными анти-CD3 антителами МНК, достоверных различий не было обнаружено, но также имеется тенденция (p = 0,06) по снижению концентрации данного цитокина по сравнению с контролем. Наблюдаемое нами влияние кукурбит[8]урила на продукцию цитокинов может быть связано с индукцией апоптоза Т-хелперов, продуцирующих данные цитокины. Согласно ранее опубликованным нами данным, присутствие кукурбит[8]урила в культуре МНК в случае Т-хелперов способно повышать ранний апоптоз в 2,5 раза по сравнению с уровнем «нативного» раннего апоптоза в периферической крови [1].

Заключение

Таким образом, при оценке иммуномодулирующего действия кукурбитурилов было продемонстрировано, что различные гомологи оказывают разное действие на иммунную систему. Следовательно, кукурбит[n]урилы способны влиять как на спонтанную, так и на стимулированную продукцию цитокинов мононуклеарными клетками крови, и направленность действия зависит от выбранного гомолога.

×

Об авторах

А. А. Актанова

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии»

Автор, ответственный за переписку.
Email: aktanova_al@mail.ru

аспирант лаборатории клинической иммунопатологии

Россия, Новосибирск

Е. А. Коваленко

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии»; ФГБУН «Институт неорганической химии имени А.В. Николаева» Сибирского отделения Российской академии наук

Email: aktanova_al@mail.ru

к.х.н., научный сотрудник лаборатории химии кластерных и супрамолекулярных соединений

Россия, Новосибирск; Новосибирск

Е. А. Пашкина

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии»

Email: aktanova_al@mail.ru

к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории клинической иммунопатологии

Россия, Новосибирск

Список литературы

  1. Aktanova A., Abramova T., Pashkina E., Boeva O., Grishina L., Kovalenko E., Kozlov V. Assessment of the biocompatibility of cucurbiturils in blood cells. J. Nanomaterials, 2021, Vol. 11, no. 6, 1356. doi: 10.3390/nano11061356.
  2. Chen H., Chan J.Y.W., Yang X., Wyman I.W., Macartney D.H., Bardelang D., Lee S.M.Y., Wang R. Developmental and organspecific toxicity of cucurbit[7]uril: In vivo study on zebrafish models. J. RSC Adv., 2015, Vol. 5, pp. 30067-30074.
  3. Czarnomysy R., Bielawska A., Bielawski K. Effect of 2nd and 3rd generation PAMAM dendrimers on proliferation, differentiation, and pro-inflammatory cytokines in human keratinocytes and fibroblasts. Int. J. Nanomedicine, 2019, Vol. 14, pp. 7123-7139.
  4. Das D., Assaf K.I., Nau W.M. Applications of cucurbiturils in medicinal chemistry and chemical biology. J. Front. Chem, 2019, Vol. 7, pp. 619-631.
  5. Hettiarachchi G., Nguyen D., Wu J., Lucas D., Ma D., Isaacs L., Briken V. Toxicology and drug delivery by cucurbit[n]uril type molecular containers. PLoS One, 2010, Vol. 5, no. 5, e10514. doi: 10.1371/journal.pone.0010514.
  6. Jeon Y.J., Kim S.Y., Ko Y.H., Sakamoto S., Yamaguchi K., Kim K. Novel molecular drug carrier: Encapsulation of oxaliplatin in cucurbit[7]uril and its effects on stability and reactivity of the drug. J. Org. Biomol. Chem, 2005, Vol. 3, pp. 2122-2125.
  7. Mazdaei M., Asare-Addo K. A mini-review of nanocarriers in drug delivery systems. Br. J. Pharm., 2022, Vol. 7, iss. 1. doi: 10.5920/bjpharm.780.
  8. Oun R., Floriano R.S., Isaacs L., Rowana E.G., Wheate N.J. The ex vivo neurotoxic, myotoxic and cardiotoxic activity of cucurbiturilbased macrocyclic drug delivery vehicles. J. Toxicol. Res., 2014, Vol. 3, pp. 447-455.
  9. Pashkina E., Aktanova A., Blinova E., Mirzaeva I., Kovalenko E., Knauer N., Ermakov A., Kozlov V. Evaluation of the immunosafety of cucurbit[n]uril on peripheral blood mononuclear cells in vitro. Molecules, 2020, Vol. 25, no. 15, 3388. doi: 10.3390/molecules25153388.
  10. Uzunova V.D., Cullinane C., Brix K., Nau W.M., Day A.I. Toxicity of cucurbit[7]uril and cucurbit[8]uril: An exploratory in vitro and in vivo study. J. Org. Biomol. Chem., 2010, Vol. 8, pp. 2037-2042.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать

© Актанова А.А., Коваленко Е.А., Пашкина Е.А., 2022

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № 77 - 11525 от 04.01.2002.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах