Effect of cucurbiturils on cytokine production by peripheral blood mononuclear cells of healthy donors

Cover Page


Cite item

Full Text

Abstract

Many drug delivery systems are currently under study, e.g., nanosized cavitands cucurbiturils, which, due to the presence of a cavity, can incorporate drug molecules. Since the immune system is quite sensitive to influence of nanomaterials and other cell-damaging factors, it is necessary to study immunosafety of the new delivery systems, i.e., immunotoxicity and immunomodulatory properties. The aim of this study was to investigate the effect of nanosized cucurbituril cavitands on the cytokine-producing ability of peripheral blood mononuclear cells in apparently healthy donors.

Blood mononuclear cells (106/mL) were cultured in the presence of cucurbiturils at the following concentrations: 0.3 mM cucurbit[6]uril, 0.3 mM cucurbit[7]uril, and 0.01 mM cucurbit[8]uril for 72 h, under additional stimulation with aCD3 antibodies (1 µg/mL), or without it. The level of cytokines in the supernatants was determined using enzyme immunoassay.

It was shown that cucurbit[6]uril increased the level of spontaneous IL-4 production by 1.5 times (p < 0.01) compared with the control. In the case of stimulated cytokine production, we found that cucurbit[6]uril reduced the level of IL-6, and also shows a tendency (p = 0.09) towards an increase in the IL-4 level. When cells were cultured with cucurbit[7]uril, we gave revealed a trend for increased production of pro-inflammatory TNF. It was also found that cucurbit[7]uril is able to suppress the production of IL-10 in aCD3-stimulated cell culture by 1.5 times. Cucurbit[8]uril was shown to inhibit production of cytokines in non-stimulated cell cultures. A significant decrease in the level of IFNγ and IL-10 was revealed as compared with the production of these cytokines in control cultures. When assessing the effect of cucurbit[8]uril on the IFNγ production upon stimulation with aCD3 antibodies, no significant differences were found, but there is also a trend for a decreased concentration of this cytokine agains control levels.

Cucurbiturils can influence both spontaneous and stimulated production of cytokines by the blood mononuclear cells. The effect on cytokine-producing ability of the cells depends on the tested homologue compound.

Full Text

Использование наноразмерных систем доставки лекарственных средств является одним из перспективных направлений, стоящих перед современной наукой. Системы доставки лекарств предполагается применять для достижения определенных преимуществ, а именно: с целью контроля клиренса, защиты препарата от биодеградации, адресной доставки к определенным органам, тканям или клеткам, снижения токсичности, повышения растворимости и т. д. [7] Однако перед применением в клинике различных наноструктур и наноматериалов, используемых при создании систем доставки лекарственных препаратов, требуется всестороннее тщательное изучение новых материалов, в том числе и исследование иммунотропных свойств данных веществ, поскольку клетки иммунной системы являются наиболее чувствительными к повреждающему действию наноматериалов или иных факторов.

Кукурбитурилы – класс наноразмерных макроциклических соединений, способных инкапсулировать молекулу или фрагмент молекулы лекарственного соединения путем образования комплексов «гость – хозяин». Данные соединения состоят из гликольурильных фрагментов, число которых варьирует в зависимости от гомолога. Так, у кукурбит[6]урила шесть гликольурильных фрагментов, а у кукурбит[8]урила – восемь [4]. Несмотря на схожее строение, различные гомологи обладают разными физико-химическими свойствами.

Исследования, посвященные биологической безопасности кукурбитурилов in vitro и in vivo показали, что кукурбитурилы и их производные являются инертными и нетоксичными. При концентрации до 1 мМ кукурбит[7]урил не проявляет цитотоксическую активность по отношению к различным клеточных линиям человека и животных [5, 6]. При введении in vivo кукурбит[7]урила показано, что максимально переносимая доза составляет 250 мг/кг; внутривенное введение кукурбитурилов ограничено из-за низкой растворимости, а не из-за развития побочных эффектов. При пероральном введении смеси кукурбит[6]урила с кукурбит[8]урилом максимально переносимая доза была увеличена до 600 мг/кг, что говорит о низкой токсичности данной смеси [10]. Кукурбитурилы в экспериментах in vivo не показывают никаких признаков острой системной токсичности. При применении кукурбит[7]урила в очень высоких дозах возможны проявления миотоксичности и нейротоксичности, однако в стандартных концентрациях, используемых при комплексообразовании с лекарственными препаратами, признаков токсичности нет [2, 8]. При исследовании влияния на клетки крови было показано, что кукурбитурилы практически не обладают иммунотоксичностью, за исключением возможной индукции апоптоза в культурах иммунокомпетентных клеток, культивированых в присутствии кукурбит[8]урила [1]. Однако кроме иммунотоксичности необходимо также исследовать и возможные иммуномодулирующие свойства систем доставки. Так, к примеру, известно, что PAMAM дендримеры второго и третьего поколения могут усиливать продукцию противовоспалительных цитокинов, что ограничивает возможность применения данных систем доставки [3]. Следовательно, для оценки иммунологической безопасности кукурбитурилов представляется актуальным оценка влияния на цитокинпродуцирующую активность клеток.

Материалы и методы

В качестве материала для исследования служили мононуклеарные клетки периферической крови (МНК ПК) здоровых доноров (n = 7). После подписания информирования согласия у каждого донора кровь из кубитальной вены собиралась в пробирку с гепарином. Выделение МНК осуществлялось стандартным способом, а именно центрифугированием с использованием раствора фиколла с урографином для создания градиента плотности. Выделенные клетки (1 млн/ мл) культивировали в присутствии кукурбитурилов в следующих концентрациях: 0,3 мМ СВ[6], 0,3 мМ СВ[7] и 0,01 мМ СВ[8] в течение 72 ч с дополнительной стимуляцией с помощью аCD3-антител (1 мкг/мл) и без стимуляции. Выбор концентраций объясняется использованием нетоксичной дозы для CB[6] и CB[7] и максимально возможной концентрации CB[8] из-за его низкой растворимости. Далее клеточные культуры центрифугировали 10 минут при 1500 об/мин, после чего аккуратно собирали супернатант и замораживали при -20 °С до использования. Уровень цитокинов в супернатантах определялся с помощью иммуноферментого анализа с использованием тест-систем «Вектор-Бест», Россия (IL- 2, IL-4, IL-6, IL-10, IFNγ, TNF).

Результаты и обсуждение

Уровень продукции цитокинов оценивался в супернатантах от клеточных культур, в данном случае МНК условно здоровых доноров, культивированных в присутствии кукурбит[n]урилов (n = 6, 7, 8). Оценивалась как спонтанная (табл. 1), так и стимулированная анти-CD3-антителами (табл. 2) продукция. Было показано, что кукурбит[6]урил в 1,5 раза повышал уровень спонтанной продукции IL-4 (p < 0,01) по сравнению с контролем.

 

ТАБЛИЦА 1. ВЛИЯНИЕ КУКУРБИТУРИЛОВ НА СПОНТАННУЮ ПРОДУКЦИЮ ЦИТОКИНОВ МОНОНУКЛЕАРНЫМИ КЛЕТКАМИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ, Me (Q0,25-Q0,75)

TABLE 1. EFFECT OF CUCURBITURILS ON SPONTANEOUS CYTOKINE PRODUCTION BY PERIPHERAL BLOOD MONONUCLEAR CELLS OF HEALTHY DONORS, Me (Q0.25-Q0.75)

 

Контроль

Control

СВ[6]

CB[7]

CB[8]

IL-2

10,19

(5,47-11,67)

7,87

(4,56-12,97)

5,57

(2,59-11,80)

6,54#

(3,59-8,86)

IL-4

1,66

(1,39-2,17)

2,32*

(1,78-3,87)

1,56

(1,34-1,77)

1,54

(1,36-4,29)

IL-6

44,72

(39,59-56,63)

56,51

(39,25-59,16)

57,02

(34,86-59,26)

40,77

(31,34-53,95)

IL-10

35,84

(27,12-53,75)

43,36

(27,39-75,13)

35,44

(16,36-89,38)

30,68*

(22,46-45,94)

IFNγ

13,03

(3,83-26,08)

7,26

(3,17-9,02)

13,70

(4,50-29,67)

4,84*

(1,66-9,35)

TNF

23,62

(10,79-38,12)

24,57

(10,43-43,28)

84,16#

(23,26-95,67)

21,46

(16,30-42,56)

Примечание. * – достоверные различия по сравнению с контролем; # – тенденция (p < 0,09) по сравнению с контролем. Данные оценены с помощью критерия Манна–Уитни.

Note. *, significant differences compared to control; #, trend (p < 0.09) compared to control. Data were assessed using the Mann–Whitney U test.

 

ТАБЛИЦА 2. ВЛИЯНИЕ КУКУРБИТУРИЛОВ НА ACD3-ИНДУЦИРОВАННУЮ ПРОДУКЦИЮ ЦИТОКИНОВ МОНОНУКЛЕАРНЫМИ КЛЕТКАМИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ

TABLE 2. EFFECT OF CUCURBITURILS ON ACD3-INDUCED CYTOKINE PRODUCTION BY PERIPHERAL BLOOD MONONUCLEAR CELLS OF HEALTHY DONORS

 

Контроль

Control

СВ[6]

CB[7]

CB[8]

IL-2

46,74

(30,11-58,17)

43,03

(26,91-62,98)

50,97

(23,96-54,41)

36,37

(28,83-48,40)

IL-4

2,24

(1,68-2,64)

2,63#

(2,07-3,34)

2,39

(1,96-3,12)

3,06#

(2,33-3,93)

IL-6

5124,55

(2864,09-5460,91)

4594,76#

(2777,33-5214,76)

4892,89

(3147,74-5029,46)

4770,74

(2844,71-5170,56)

IL-10

501,01

(353,90-600,54)

462,48

(357,06-695,64)

322,78*

(186,14-518,60)

368,14*

(342,34-459,93)

IFNγ

1928,96

(1675,52-2147,64)

1908,72

(1698,32-2241,89)

2096,79

(1541,11-2320,40)

1804,19#

(1525,63-2102,81)

TNF

1260,24

(1089,82-1795,65)

1257,24

(825,77-1804,28)

1508,76

(1149,83-1908,82)

1470,40

(1182,43-1540,29)

Примечание. См. примечание к таблице 1.

Note. As for Table 1.

 

В случае оценки стимулированной продукции нами было обнаружено, что кукурбит[6]урил снижает уровень продукции IL-6, а также демонстрирует тенденцию (p = 0,09) к повышению уровня IL-4. Предположительно, полученные данные о действии на спонтанную и стимулированную продукцию могут говорить о влиянии кукурбит[6]урила на Th1/Th2 баланс со смещением в сторону гуморального иммунного ответа. Ранее было продемонстрировано, что кукурбит[6]урил может способствовать увеличению экспрессии молекул HLA-DR на B-лимфоцитов [9], что также говорит о стимулирующем действии кукурбит[6]урила на гуморальное звено иммунитета.

Кукурбит[7]урил не приводил к статистически значимым изменениям в спонтанной продукции МНК исследуемых цитокинов, однако была замечена тенденция (p = 0,09) по увеличению продукции провоспалительного цитокина TNF. Также было обнаружено, что кукурбит[7]урил способен подавлять продукцию IL-10 в стимулированной aнти-CD3 антителами культуре МНК в 1,5 раза. Подобные результаты могут свидетельствовать об иммуностимулирующем и провоспалительном действии кукурбит[7]урила.

В то же время кукурбит[8]урил подавлял продукцию цитокинов в неактивированных стимуляторами лимфоцитов культурах МНК. Так, было показано достоверное снижение уровня IFNγ и IL-10 по сравнению с продукцией данных цитокинов в контрольной культуре. Кроме того, наблюдалась тенденция (p = 0,09) по снижению уровня IL-2 МНК ПК, культивированных в присутствии кукурбит[8]урила. Кроме того, кукурбит[8]урил приводил к снижению продукции IL-10 и стимулированными МНК ПК. В случае оценки влияния кукурбит[8]урила на продукцию IFNγ стимулированными анти-CD3 антителами МНК, достоверных различий не было обнаружено, но также имеется тенденция (p = 0,06) по снижению концентрации данного цитокина по сравнению с контролем. Наблюдаемое нами влияние кукурбит[8]урила на продукцию цитокинов может быть связано с индукцией апоптоза Т-хелперов, продуцирующих данные цитокины. Согласно ранее опубликованным нами данным, присутствие кукурбит[8]урила в культуре МНК в случае Т-хелперов способно повышать ранний апоптоз в 2,5 раза по сравнению с уровнем «нативного» раннего апоптоза в периферической крови [1].

Заключение

Таким образом, при оценке иммуномодулирующего действия кукурбитурилов было продемонстрировано, что различные гомологи оказывают разное действие на иммунную систему. Следовательно, кукурбит[n]урилы способны влиять как на спонтанную, так и на стимулированную продукцию цитокинов мононуклеарными клетками крови, и направленность действия зависит от выбранного гомолога.

×

About the authors

A. A. Aktanova

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Author for correspondence.
Email: aktanova_al@mail.ru

Postgraduate Student, Laboratory of Clinical Immunopathology

Russian Federation, Novosibirsk

E. A. Kovalenko

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology; A. Nikolaev Institute of Inorganic Chemistry, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences

Email: aktanova_al@mail.ru

PhD (Сhemistry), Research Associate

Russian Federation, Novosibirsk; Novosibirsk

E. A. Pashkina

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Email: aktanova_al@mail.ru

PhD (Biology), Senior Research Associate, Laboratory of Clinical Immunopathology

Russian Federation, Novosibirsk

References

  1. Aktanova A., Abramova T., Pashkina E., Boeva O., Grishina L., Kovalenko E., Kozlov V. Assessment of the biocompatibility of cucurbiturils in blood cells. J. Nanomaterials, 2021, Vol. 11, no. 6, 1356. doi: 10.3390/nano11061356.
  2. Chen H., Chan J.Y.W., Yang X., Wyman I.W., Macartney D.H., Bardelang D., Lee S.M.Y., Wang R. Developmental and organspecific toxicity of cucurbit[7]uril: In vivo study on zebrafish models. J. RSC Adv., 2015, Vol. 5, pp. 30067-30074.
  3. Czarnomysy R., Bielawska A., Bielawski K. Effect of 2nd and 3rd generation PAMAM dendrimers on proliferation, differentiation, and pro-inflammatory cytokines in human keratinocytes and fibroblasts. Int. J. Nanomedicine, 2019, Vol. 14, pp. 7123-7139.
  4. Das D., Assaf K.I., Nau W.M. Applications of cucurbiturils in medicinal chemistry and chemical biology. J. Front. Chem, 2019, Vol. 7, pp. 619-631.
  5. Hettiarachchi G., Nguyen D., Wu J., Lucas D., Ma D., Isaacs L., Briken V. Toxicology and drug delivery by cucurbit[n]uril type molecular containers. PLoS One, 2010, Vol. 5, no. 5, e10514. doi: 10.1371/journal.pone.0010514.
  6. Jeon Y.J., Kim S.Y., Ko Y.H., Sakamoto S., Yamaguchi K., Kim K. Novel molecular drug carrier: Encapsulation of oxaliplatin in cucurbit[7]uril and its effects on stability and reactivity of the drug. J. Org. Biomol. Chem, 2005, Vol. 3, pp. 2122-2125.
  7. Mazdaei M., Asare-Addo K. A mini-review of nanocarriers in drug delivery systems. Br. J. Pharm., 2022, Vol. 7, iss. 1. doi: 10.5920/bjpharm.780.
  8. Oun R., Floriano R.S., Isaacs L., Rowana E.G., Wheate N.J. The ex vivo neurotoxic, myotoxic and cardiotoxic activity of cucurbiturilbased macrocyclic drug delivery vehicles. J. Toxicol. Res., 2014, Vol. 3, pp. 447-455.
  9. Pashkina E., Aktanova A., Blinova E., Mirzaeva I., Kovalenko E., Knauer N., Ermakov A., Kozlov V. Evaluation of the immunosafety of cucurbit[n]uril on peripheral blood mononuclear cells in vitro. Molecules, 2020, Vol. 25, no. 15, 3388. doi: 10.3390/molecules25153388.
  10. Uzunova V.D., Cullinane C., Brix K., Nau W.M., Day A.I. Toxicity of cucurbit[7]uril and cucurbit[8]uril: An exploratory in vitro and in vivo study. J. Org. Biomol. Chem., 2010, Vol. 8, pp. 2037-2042.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

Copyright (c) 2022 Aktanova A.A., Kovalenko E.A., Pashkina E.A.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № 77 - 11525 от 04.01.2002.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies