Экспрессия генов HBD1 и LL37 при атопическом дерматите у детей и подростков

Обложка


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Атопический дерматит – мультифакторное генетически детерминированное воспалительное заболевание кожи, характеризующееся зудом, хроническим рецидивирующим течением, возрастными особенностями локализации и морфологии очагов поражения. Атопический дерматит принадлежит к группе заболеваний, которые, как полагают, возникают в результате сложных взаимодействий между генетическими, иммунологическими факторами и факторами окружающей среды. При атопическом дерматите нарушается барьерная функция кожи. Противомикробные пептиды типа LL-37, b-дефенсины участвуют в поддержании барьерной функции кожи (в частности межклеточных контактов). Дисбаланс противомикробных пептидов приводит к развитию различных заболеваний, в том числе и аллергических. Целью этого исследования является изучение экспрессионного профиля генов противомикробных пептидов HBD1 и LL37 в коже и мононуклеарных клетках крови при среднетяжелом и тяжелом течении атопического дерматита у детей в динамике. С помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени в образцах кожи и в мононуклеарных клетках крови был выявлен уровень экспрессии генов HBD1 и LL37. Анализ экспрессионного профиля таргетных генов показал достоверное (p ≤ 0,017) повышение уровней экспрессии HBD1 (H-критерий = 24,76; 2, n = 72; p = 0,00001) и LL37 (H-критерий = 15,69; 2, n = 72; p = 0,00039) в крови у пациентов с атопическим дерматитом по отношению к группе сравнения, а также снижение (p ≤ 0,05) уровня экспрессии HBD1 в пораженной коже по отношению к контрольной группе. Наши данные по гену кателицидина в коже не расходятся с примерами из литературы, поскольку его экспрессия в случае атопического дерматита снижена. В нашем случае также имеет место повышение экспрессии этого гена в МНК. Пептид HBD1 экспрессируется как в моноцитах, так и в макрофагах и является, таким образом, связующим звеном между врожденным и приобретенным иммунитетом. В нашем исследовании экспрессия гена HBD1 повышалась только в крови, что свидетельствует об активации структур врожденного иммунитета на системном уровне в ответ на воспаление. Выявление роли иммунологических маркеров в течении атопического дерматита позволит создать новые прогностические подходы при ведении пациентов с атопической патологией. Поэтому важно иметь полное представление о патогенетических механизмах аллергического заболевания.

Полный текст

Введение

Атопический дерматит (АтД) – генетически детерминированное воспалительное заболевание кожи, характеризующееся зудом, хроническим рецидивирующим течением, возрастными особенностями локализации и морфологии очагов поражения [1]. Дебют заболевания, как правило, приходится на детский возраст. Распространенность АтД среди детского населения достигает 20%, среди взрослого населения – 8%.

АтД принадлежит к группе заболеваний, которые, как полагают, возникают в результате сложных взаимодействий между генетическими, иммунологическими факторами и факторами окружающей среды. Наследственность играет важную роль в развитии заболевания. Происходит также нарушение иммунного ответа (чаще всего баланс сдвигается в сторону Th2-ответа). Также повышается уровень IgE, наблюдается инфильтрация Т-клеток в коже [6]. Помимо генетических факторов, также определенную роль в развитии и поддержании заболевания играют эпигенетические механизмы. Нарушается и барьерная функция эпидермиса, что приводит к проникновению различных факторов окружающей среды (т. е. микроорганизмов, раздражителей, аллергенов, загрязняющих агентов); снижается способность кожи удерживать воду. Повышение уровня pH, нарушение барьерной функции и снижение уровня противомикробных пептидов вкупе способствуют дисбиозу кожи, возникновению кожных инфекций [8]. К первой линии защиты от патогенов относятся противомикробные пептиды. Это структуры врожденного иммунитета, обладающие антимикробной активностью. Дисбаланс противомикробных пептидов приводит к развитию различных заболеваний [2, 5], в том числе и аллергических. Противомикробные пептиды типа LL-37, b-дефенсины участвуют в поддержании барьерной функции кожи (в частности межклеточных контактов) [7].

Целью этой работы является изучение экспрессионного профиля генов противомикробных пептидов HBD1 и LL37 в кератиноцитах кожи и мононуклеарных клетках крови при среднетяжелом и тяжелом течении атопического дерматита у детей в динамике.

Материалы и методы

Исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» (WMA Declaration of Helsinki – Ethical Principles for Medical Research Involving Human Subjects, 2013). Исследование было одобрено локальным этическим комитетом при ФГБНУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» (протокол заседания локального совета по этике № 5 от 12 мая 2022 г.). Все пациенты подписывали добровольное информированное согласие на участие в исследовании.

Из ФГАУ «НМИЦ здоровья детей» Минздрава России был получен клинический материал от 53 пациентов обоих полов от 6 до 18 лет с диагнозом L.20 «Атопический дерматит» среднетяжелой (SCORAD 25-50) и тяжелой (SCORAD ≥ 50) степени. 48 пациентов получали топическую терапию (МГК средней и высокой активности, топические ингибиторы кальциневрина); 5 пациентов проходили системную терапию с применением препарата дупилумаба. Материалом для исследований послужили биопсии пораженных участков кожи и образцы цельной крови (пробирки с ЭДТА), из которых впоследствии выделялись мононуклеарные клетки крови (МНК). При анализе уровней экспрессии генов в образцах крови в группу «до лечения» вошли 36 пациентов, в группу «после лечения» – 22 пациента; группу сравнения («контроль») составили 17 здоровых доноров; при анализе экспрессии генов в коже группу пациентов «до лечения» составили 9 пациентов (повторную биопсию не брали), а группу сравнения – 9 здоровых волонтеров.

Из части биопсийного материала и МНК последовательно была выделена РНК (Extract RNA, Евроген, Россия), проведена реакция обратной транскрипции («ОТ-1», «Синтол», Россия). Методом ПЦР-РВ были определены уровни экспрессии генов LL37 и HBD1. В реакции использовались специфические последовательности праймеров («Синтол», Россия), которые подбирались с помощью программы Primer-BLAST (NCBI). ПЦР-анализ в режиме реального времени проводился на приборе Rotor-Gene Q (QIAGEN Hiden, Германия). Реакция проводилась при следующих условиях: 1) 95 °C – 5 мин – 1 цикл; 2) 95 °C – 15 сек, 60 °C (или 58 °C) – 50 сек – 40 циклов. Обработка полученных данных (Ct) проводилась методом 2-ÄÄC(t) относительно уровня экспрессии гена домашнего хозяйства â-актина (ACTB).

Анализ полученных данных, представленных в относительных единицах, проводился в несколько этапов в программе MC Excel. Статистическая достоверность между группами данных рассчитывалась при помощи непараметрического U-критерия Манна–Уитни, а также H-теста Краскела–Уоллиса.

Результаты и обсуждение

Так, на рисунках 1 и 2 представлены уровни экспрессии гена LL37 у больных с АтД по сравнению со здоровым контролем в крови и коже. Как видно из графиков, экспрессия LL37 снижена у пациентов с АтД на локальном уровне: медианные значения составляют 0,5 и 1 в группе пациентов и здоровых доноров соответственно (p ≤ 0,05). В крови, напротив, наблюдается повышение уровня экспрессии этого показателя как до терапии, так и после нее по сравнению с контролем (H-критерий = 15,69; 2, n = 72; p = 0,00039). Медианы равны 9, 7,6, 0,3 в группах до лечения, после лечения и в контрольной группе соответственно.

 

Рисунок 1. Уровень экспрессии гена LL37 в коже пациентов с АтД по сравнению с контролем

Примечание.* – p ≤ 0,05.

Figure 1. LL37 gene expression level in the skin of AD patients compared to the control group

Note. *, p ≤ 0.05.

 

Рисунок 2. Уровень экспрессии гена LL37 в крови пациентов с АтД по сравнению с контролем

Примечание. * – p ≤ 0,017.

Figure 2. LL37 gene expression level in the blood of AD patients compared to the control group

Note. *, p ≤ 0.017.

 

Для гена HBD1 локально в коже разницы между группой пациентов и контрольной группой выявлено не было. Однако в крови его экспрессия значимо отличалась и имела тенденцию к снижению после лечения. На рисунке 3 представлены уровни экспрессии гена HBD1 в крови. Как показано на графике, экспрессия HBD1 повышалась в крови по сравнению с контролем (H-критерий = 24,76; 2, n = 72; p = 0,00001). Медианы равны 127, 18, 1 в группах до лечения, после лечения и в контрольной группе соответственно.

 

Рисунок 3. Уровень экспрессии гена HBD1 в крови пациентов с АтД по сравнению с контролем

Примечание. * – p ≤ 0,017.

Figure 3. HBD1 gene expression level in the blood of AD patients compared to the control group

Note. *, p ≤ 0.017.

 

Известно, что LL37 стимулирует продукцию провоспалительных цитокинов. Однако существуют данные, что при развитии АтД его экспрессия может быть снижена [7]. Наши данные по гену кателицидина в коже не расходятся с примерами из литературы, поскольку его экспрессия в случае АтД снижена. В другом исследовании было показано, что влияние кателицидина в крови на Т-клетки снижало их пролиферативную активность и увеличивало количество Т-регуляторных клеток [3]. В нашем случае имеет место повышение экспрессии этого гена в МНК. В настоящий момент недостаточно данных по поводу функционального значения этого пептида в крови при АтД, поэтому предстоит выяснить, в чем заключается подобное повышение этого показателя.

В отношении пептида HBD1 можно сказать, что он экспрессируется как в моноцитах, так и в макрофагах и является, таким образом, связующим звеном между врожденным и приобретенным иммунитетом [4]. Исследований HBD1 при АтД значительно меньше (например, по сравнению с HBD2 и HBD3). В нашем исследовании экспрессия гена HBD1 повышалась только в крови, что свидетельствует об активации структур врожденного иммунитета на системном уровне в ответ на воспаление.

Заключение

Выявление роли иммунологических маркеров в течении АтД позволит создать новые прогностические подходы при ведении пациентов с атопической патологией. Поэтому важно иметь полное представление о патогенетических механизмах аллергического заболевания.

Благодарности

Выражаем благодарность Центру коллективного пользования «НИИВС им. И.И. Мечникова», Москва, Россия. Исследование выполнено при финансовой поддержке проекта Российской Федерацией в лице Минобрнауки России, соглашение № 075-15-2021-676 от 28.07.2021.

×

Об авторах

Е. П. Быстрицкая

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова»

Автор, ответственный за переписку.
Email: lisabystritskaya@gmail.com

аспирант, младший научный сотрудник лаборатории молекулярной иммунологии

Россия, Москва

Н. Н. Мурашкин

ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр здоровья детей» Министерства здравоохранения РФ; ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения РФ (Сеченовский университет)

Email: lisabystritskaya@gmail.com

д.м.н., профессор, главный научный сотрудник, заведующий отделением дерматологии с группой лазерной хирургии, заведующий лабораторией патологии кожи у детей отдела научных исследований в педиатрии; профессор 

Россия, Москва; Москва

А. И. Материкин

ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр здоровья детей» Министерства здравоохранения РФ

Email: lisabystritskaya@gmail.com

к.м.н., врач-дерматовенеролог отделения дерматологии с группой лазерной хирургии

Россия, Москва

Е. А. Наумова

ФГБОУ ВО «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова»

Email: lisabystritskaya@gmail.com

научный сотрудник кафедры генетики, биологический факультет

Россия, Москва

И. В. Яковлева

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова»

Email: lisabystritskaya@gmail.com

к.б.н., научный сотрудник лаборатории клеточных гибридов

Россия, Москва

Н. О. Вартанова

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова»

Email: lisabystritskaya@gmail.com

к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории условно-патогенных бактерий

Россия, Москва

О. А. Свитич

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова»; ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения РФ (Сеченовский университет)

Email: lisabystritskaya@gmail.com

д.м.н., член-корр. РАН, заведующая лабораторией молекулярной иммунологии, директор; профессор кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии 

Россия, Москва; Москва

Список литературы

  1. Мурашкин Н.Н., Амбарчян Э.Т., Материкин А.И., Епишев Р.В. Роль нарушений эпидермального барьера при атопическом дерматите: современные концепции патогенеза заболевания // Вопросы современной педиатрии, 2018. Т. 17, № 1. С. 85-88. [Murashkin N.N., Ambarchian E.T., Materikin A.I., Epishev R.V. The role of epidermal barrier impairments in atopic dermatitis: modern concepts of disease pathogenesis. Voprosy sovremennoy pediatrii = Current Pediatrics, 2018, Vol. 17, no. 1, pp. 85-88. (In Russ.)]
  2. Свитич О.А., Ганковская Л.В., Рахманова И.В., Зайцева И.А., Ганковский В.А. Ассоциация полиморфных маркеров, локализованных в 5’-нетранслируемой области гена Defb 1, с гипертрофией аденоидных вегетаций // Вестник Российского государственного медицинского университета, 2012. T. 3. C. 59-62. [Svitich O.A., Gankovskaya L.V., Rakhmanova I.V., Zaytseva I.A., Gankovskiy V.A. The association of polymorphic markers in the 5`-untranslated region of the DEFB1 gene with adenoid hypertrophy vegetations. Vestnik Rossiyskogo gosudarstvennogo meditsinskogo universiteta = Bulletin of Russian State Medical University, 2012, Vol. 3, pp. 59-62. (In Russ.)]
  3. Alexandre-Ramos D.S., Silva-Carvalho A.É., Lacerda M.G., Serejo T.R.T., Franco O.L., Pereira R.W., Carvalho J.L., Neves F., Saldanha-Araujo F. LL-37 treatment on human peripheral blood mononuclear cells modulates immune response and promotes regulatory T-cells generation. Biomed. Pharmacother., 2018, Vol. 108, pp. 1584-1590.
  4. Chieosilapatham P., Ogawa H., Niyonsaba F. Current insights into the role of human β-defensins in atopic dermatitis. Clin. Exp. Immunol., 2017, Vol. 190, no. 2, pp. 155-166.
  5. Kovalchuk L.V., Gankovskaya L.V., Gankovskaya O.A., Lavrov V.F. Herpes simplex virus: treatment with antimicrobial peptides. Adv. Exp. Med. Biol., 2007, no. 601, pp. 369-376.
  6. Luger T., Adaskevich U., Anfilova M., Dou X., Murashkin N.N., Namazova-Baranova L., et al. Practical algorithm to inform clinical decision-making in the topical treatment of atopic dermatitis. J. Dermatol., 2021, Vol. 48, no. 8, pp. 1139-1148.
  7. Reinholz M., Ruzicka T., Schauber J. Cathelicidin LL-37: An Antimicrobial Peptide with a Role in Inflammatory Skin Disease. Ann. Dermatol., 2012, Vol. 24, no. 2, 126. doi: 10.5021/ad.2012.24.2.126.
  8. Weidinger S., Beck L.A., Bieber T., Kabashima K., Irvine A.D. Atopic dermatitis. Nat. Rev. Dis. Primers, 2018, Vol. 4, 1. doi: 10.1038/s41572-018-0001-z.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рисунок 1. Уровень экспрессии гена LL37 в коже пациентов с АтД по сравнению с контролем

Скачать (138KB)
Метаданные
3. Рисунок 2. Уровень экспрессии гена LL37 в крови пациентов с АтД по сравнению с контролем

Скачать (176KB)
Метаданные
4. Рисунок 3. Уровень экспрессии гена HBD1 в крови пациентов с АтД по сравнению с контролем

Скачать (192KB)
Метаданные

© Быстрицкая Е.П., Мурашкин Н.Н., Материкин А.И., Наумова Е.А., Яковлева И.В., Вартанова Н.О., Свитич О.А., 2022

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № 77 - 11525 от 04.01.2002.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах