HBD1 and LL37 gene expression in children with atopic dermatitis

Full Text

Введение

Атопический дерматит (АтД) – генетически детерминированное воспалительное заболевание кожи, характеризующееся зудом, хроническим рецидивирующим течением, возрастными особенностями локализации и морфологии очагов поражения [1]. Дебют заболевания, как правило, приходится на детский возраст. Распространенность АтД среди детского населения достигает 20%, среди взрослого населения – 8%.

АтД принадлежит к группе заболеваний, которые, как полагают, возникают в результате сложных взаимодействий между генетическими, иммунологическими факторами и факторами окружающей среды. Наследственность играет важную роль в развитии заболевания. Происходит также нарушение иммунного ответа (чаще всего баланс сдвигается в сторону Th2-ответа). Также повышается уровень IgE, наблюдается инфильтрация Т-клеток в коже [6]. Помимо генетических факторов, также определенную роль в развитии и поддержании заболевания играют эпигенетические механизмы. Нарушается и барьерная функция эпидермиса, что приводит к проникновению различных факторов окружающей среды (т. е. микроорганизмов, раздражителей, аллергенов, загрязняющих агентов); снижается способность кожи удерживать воду. Повышение уровня pH, нарушение барьерной функции и снижение уровня противомикробных пептидов вкупе способствуют дисбиозу кожи, возникновению кожных инфекций [8]. К первой линии защиты от патогенов относятся противомикробные пептиды. Это структуры врожденного иммунитета, обладающие антимикробной активностью. Дисбаланс противомикробных пептидов приводит к развитию различных заболеваний [2, 5], в том числе и аллергических. Противомикробные пептиды типа LL-37, b-дефенсины участвуют в поддержании барьерной функции кожи (в частности межклеточных контактов) [7].

Целью этой работы является изучение экспрессионного профиля генов противомикробных пептидов HBD1 и LL37 в кератиноцитах кожи и мононуклеарных клетках крови при среднетяжелом и тяжелом течении атопического дерматита у детей в динамике.

Материалы и методы

Исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» (WMA Declaration of Helsinki – Ethical Principles for Medical Research Involving Human Subjects, 2013). Исследование было одобрено локальным этическим комитетом при ФГБНУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» (протокол заседания локального совета по этике № 5 от 12 мая 2022 г.). Все пациенты подписывали добровольное информированное согласие на участие в исследовании.

Из ФГАУ «НМИЦ здоровья детей» Минздрава России был получен клинический материал от 53 пациентов обоих полов от 6 до 18 лет с диагнозом L.20 «Атопический дерматит» среднетяжелой (SCORAD 25-50) и тяжелой (SCORAD ≥ 50) степени. 48 пациентов получали топическую терапию (МГК средней и высокой активности, топические ингибиторы кальциневрина); 5 пациентов проходили системную терапию с применением препарата дупилумаба. Материалом для исследований послужили биопсии пораженных участков кожи и образцы цельной крови (пробирки с ЭДТА), из которых впоследствии выделялись мононуклеарные клетки крови (МНК). При анализе уровней экспрессии генов в образцах крови в группу «до лечения» вошли 36 пациентов, в группу «после лечения» – 22 пациента; группу сравнения («контроль») составили 17 здоровых доноров; при анализе экспрессии генов в коже группу пациентов «до лечения» составили 9 пациентов (повторную биопсию не брали), а группу сравнения – 9 здоровых волонтеров.

Из части биопсийного материала и МНК последовательно была выделена РНК (Extract RNA, Евроген, Россия), проведена реакция обратной транскрипции («ОТ-1», «Синтол», Россия). Методом ПЦР-РВ были определены уровни экспрессии генов LL37 и HBD1. В реакции использовались специфические последовательности праймеров («Синтол», Россия), которые подбирались с помощью программы Primer-BLAST (NCBI). ПЦР-анализ в режиме реального времени проводился на приборе Rotor-Gene Q (QIAGEN Hiden, Германия). Реакция проводилась при следующих условиях: 1) 95 °C – 5 мин – 1 цикл; 2) 95 °C – 15 сек, 60 °C (или 58 °C) – 50 сек – 40 циклов. Обработка полученных данных (Ct) проводилась методом 2^-ÄÄC(t) относительно уровня экспрессии гена домашнего хозяйства â-актина (ACTB).

Анализ полученных данных, представленных в относительных единицах, проводился в несколько этапов в программе MC Excel. Статистическая достоверность между группами данных рассчитывалась при помощи непараметрического U-критерия Манна–Уитни, а также H-теста Краскела–Уоллиса.

Результаты и обсуждение

Так, на рисунках 1 и 2 представлены уровни экспрессии гена LL37 у больных с АтД по сравнению со здоровым контролем в крови и коже. Как видно из графиков, экспрессия LL37 снижена у пациентов с АтД на локальном уровне: медианные значения составляют 0,5 и 1 в группе пациентов и здоровых доноров соответственно (p ≤ 0,05). В крови, напротив, наблюдается повышение уровня экспрессии этого показателя как до терапии, так и после нее по сравнению с контролем (H-критерий = 15,69; 2, n = 72; p = 0,00039). Медианы равны 9, 7,6, 0,3 в группах до лечения, после лечения и в контрольной группе соответственно.

 

Рисунок 1. Уровень экспрессии гена LL37 в коже пациентов с АтД по сравнению с контролем

Примечание.* – p ≤ 0,05.

Figure 1. LL37 gene expression level in the skin of AD patients compared to the control group

Note. *, p ≤ 0.05.

 

Рисунок 2. Уровень экспрессии гена LL37 в крови пациентов с АтД по сравнению с контролем

Примечание. * – p ≤ 0,017.

Figure 2. LL37 gene expression level in the blood of AD patients compared to the control group

Note. *, p ≤ 0.017.

 

Для гена HBD1 локально в коже разницы между группой пациентов и контрольной группой выявлено не было. Однако в крови его экспрессия значимо отличалась и имела тенденцию к снижению после лечения. На рисунке 3 представлены уровни экспрессии гена HBD1 в крови. Как показано на графике, экспрессия HBD1 повышалась в крови по сравнению с контролем (H-критерий = 24,76; 2, n = 72; p = 0,00001). Медианы равны 127, 18, 1 в группах до лечения, после лечения и в контрольной группе соответственно.

 

Рисунок 3. Уровень экспрессии гена HBD1 в крови пациентов с АтД по сравнению с контролем

Примечание. * – p ≤ 0,017.

Figure 3. HBD1 gene expression level in the blood of AD patients compared to the control group

Note. *, p ≤ 0.017.

 

Известно, что LL37 стимулирует продукцию провоспалительных цитокинов. Однако существуют данные, что при развитии АтД его экспрессия может быть снижена [7]. Наши данные по гену кателицидина в коже не расходятся с примерами из литературы, поскольку его экспрессия в случае АтД снижена. В другом исследовании было показано, что влияние кателицидина в крови на Т-клетки снижало их пролиферативную активность и увеличивало количество Т-регуляторных клеток [3]. В нашем случае имеет место повышение экспрессии этого гена в МНК. В настоящий момент недостаточно данных по поводу функционального значения этого пептида в крови при АтД, поэтому предстоит выяснить, в чем заключается подобное повышение этого показателя.

В отношении пептида HBD1 можно сказать, что он экспрессируется как в моноцитах, так и в макрофагах и является, таким образом, связующим звеном между врожденным и приобретенным иммунитетом [4]. Исследований HBD1 при АтД значительно меньше (например, по сравнению с HBD2 и HBD3). В нашем исследовании экспрессия гена HBD1 повышалась только в крови, что свидетельствует об активации структур врожденного иммунитета на системном уровне в ответ на воспаление.

Заключение

Выявление роли иммунологических маркеров в течении АтД позволит создать новые прогностические подходы при ведении пациентов с атопической патологией. Поэтому важно иметь полное представление о патогенетических механизмах аллергического заболевания.

Благодарности

Выражаем благодарность Центру коллективного пользования «НИИВС им. И.И. Мечникова», Москва, Россия. Исследование выполнено при финансовой поддержке проекта Российской Федерацией в лице Минобрнауки России, соглашение № 075-15-2021-676 от 28.07.2021.

About the authors

E. P. Bystritskaya

I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera

Author for correspondence.
Email: lisabystritskaya@gmail.com

Postgraduate Student, Junior Research Associate, Laboratory of Molecular Immunology

Russian Federation, Moscow

N. N. Murashkin

Medical Research Center for Children’s Health; I. Sechenov First Moscow State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation (Sechenov University)

Email: lisabystritskaya@gmail.com

PhD, MD (Medicine), Professor, Senior Research Associate, Head, Department of Dermatology, Head, Laboratory of Skin Pathology in Children; Professor

Russian Federation, Moscow; Moscow

Alexander I. Materikin

Medical Research Center for Children’s Health

Email: lisabystritskaya@gmail.com

PhD (Medicine), Dermatovenereologist, Department of Dermatology

Russian Federation, Moscow

E. A. Naumova

M. Lomonosov Moscow State University

Email: lisabystritskaya@gmail.com

Research Associate, Department of Genetics, Faculty of Biology

Russian Federation, Moscow

I. V. Yakovleva

I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera

Email: lisabystritskaya@gmail.com

PhD (Biology), Research Associate, Laboratory of Cells Hybridomas

Russian Federation, Moscow

N. O. Vartanova

I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera

Email: lisabystritskaya@gmail.com

PhD (Biology), Senior Research Associate, Laboratory of Microbiology of Opportunistic Bacteria

Russian Federation, Moscow

Oxana A. Svitich

I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera; I. Sechenov First Moscow State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation (Sechenov University)

Email: lisabystritskaya@gmail.com

PhD, MD (Medicine), Corresponding Member, Russian Academy of Sciences, Head, Laboratory of Molecular Immunology, Director; Professor, Department of Microbiology, Virology and Immunology

Russian Federation, Moscow; Moscow

References

Supplementary files