Email this article HBD1 and LL37 gene expression in children with atopic dermatitis
- Authors: Bystritskaya E.P.1, Murashkin N.N.2,3, Materikin A.I.2, Naumova E.A.4, Yakovleva I.V.1, Vartanova N.O.1, Svitich O.A.1,3
-
Affiliations:
- I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera
- Medical Research Center for Children’s Health
- I. Sechenov First Moscow State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation (Sechenov University)
- M. Lomonosov Moscow State University
- Issue: Vol 25, No 4 (2022)
- Pages: 405-410
- Section: SHORT COMMUNICATIONS
- URL: https://rusimmun.ru/jour/article/view/1194
- DOI: https://doi.org/10.46235/1028-7221-1194-HAL
- ID: 1194
Cite item
Full Text
Abstract
Atopic dermatitis (AD) is a multifactorial genetically determined inflammatory skin disease characterized by itching, chronic course, age-related features of localization and lesion morphology. Atopic dermatitis is caused by complex interactions between genetic, immunological, and environmental factors. The barrier function of the skin is impaired in atopic dermatitis. Antimicrobial peptides, e.g., LL-37, b-defensins are involved in maintaining the skin barrier function (especially, intercellular contacts). An imbalance of antimicrobial peptides may cause different disorders, including allergic pathologies. The aim of this study is to investigate gene expression profile of the HBD1 and LL37 encoding antimicrobial peptides in the samples of skin and blood mononuclear cells obtained from the children with moderate and severe atopic dermatitis before and after treatment. By means of real-time polymerase chain reaction, the levels of HBD1 and LL37 gene expression were evaluated in the samples. Statistical analysis showed significantly increased (p ≤ 0.017) expression levels of both HBD1 (H-test = 24.76; 2, n = 72; p = 0.00001), and LL37 genes (H-test = 15.69; 2, n = 72; p = 0.00039) in blood cells of AD patients compared to the control group, as well as decreased (p ≤ 0.05) levels of HBD1 expression in the affected skin compared to the control group. Our data on the cathelicidin gene in the skin do not differ from the literature data, since its expression is reduced in AD. In our series, an increase of the gene expression was revealed in PBMCs. The HBD1 peptide is expressed in both monocytes and macrophages, representing a link between innate and adaptive immunity. In our study, the expression of the HBD1 gene was increased only in blood, thus suggesting activation of innate immunity components at the systemic level in response to inflammation. Of importance, understanding the role of immunological markers in AD will help to develop novel prognostic approaches in management of the patients with atopic disorders. Therefore, one should understand pathogenetic mechanisms of allergic diseases.
Full Text
Введение
Атопический дерматит (АтД) – генетически детерминированное воспалительное заболевание кожи, характеризующееся зудом, хроническим рецидивирующим течением, возрастными особенностями локализации и морфологии очагов поражения [1]. Дебют заболевания, как правило, приходится на детский возраст. Распространенность АтД среди детского населения достигает 20%, среди взрослого населения – 8%.
АтД принадлежит к группе заболеваний, которые, как полагают, возникают в результате сложных взаимодействий между генетическими, иммунологическими факторами и факторами окружающей среды. Наследственность играет важную роль в развитии заболевания. Происходит также нарушение иммунного ответа (чаще всего баланс сдвигается в сторону Th2-ответа). Также повышается уровень IgE, наблюдается инфильтрация Т-клеток в коже [6]. Помимо генетических факторов, также определенную роль в развитии и поддержании заболевания играют эпигенетические механизмы. Нарушается и барьерная функция эпидермиса, что приводит к проникновению различных факторов окружающей среды (т. е. микроорганизмов, раздражителей, аллергенов, загрязняющих агентов); снижается способность кожи удерживать воду. Повышение уровня pH, нарушение барьерной функции и снижение уровня противомикробных пептидов вкупе способствуют дисбиозу кожи, возникновению кожных инфекций [8]. К первой линии защиты от патогенов относятся противомикробные пептиды. Это структуры врожденного иммунитета, обладающие антимикробной активностью. Дисбаланс противомикробных пептидов приводит к развитию различных заболеваний [2, 5], в том числе и аллергических. Противомикробные пептиды типа LL-37, b-дефенсины участвуют в поддержании барьерной функции кожи (в частности межклеточных контактов) [7].
Целью этой работы является изучение экспрессионного профиля генов противомикробных пептидов HBD1 и LL37 в кератиноцитах кожи и мононуклеарных клетках крови при среднетяжелом и тяжелом течении атопического дерматита у детей в динамике.
Материалы и методы
Исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» (WMA Declaration of Helsinki – Ethical Principles for Medical Research Involving Human Subjects, 2013). Исследование было одобрено локальным этическим комитетом при ФГБНУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» (протокол заседания локального совета по этике № 5 от 12 мая 2022 г.). Все пациенты подписывали добровольное информированное согласие на участие в исследовании.
Из ФГАУ «НМИЦ здоровья детей» Минздрава России был получен клинический материал от 53 пациентов обоих полов от 6 до 18 лет с диагнозом L.20 «Атопический дерматит» среднетяжелой (SCORAD 25-50) и тяжелой (SCORAD ≥ 50) степени. 48 пациентов получали топическую терапию (МГК средней и высокой активности, топические ингибиторы кальциневрина); 5 пациентов проходили системную терапию с применением препарата дупилумаба. Материалом для исследований послужили биопсии пораженных участков кожи и образцы цельной крови (пробирки с ЭДТА), из которых впоследствии выделялись мононуклеарные клетки крови (МНК). При анализе уровней экспрессии генов в образцах крови в группу «до лечения» вошли 36 пациентов, в группу «после лечения» – 22 пациента; группу сравнения («контроль») составили 17 здоровых доноров; при анализе экспрессии генов в коже группу пациентов «до лечения» составили 9 пациентов (повторную биопсию не брали), а группу сравнения – 9 здоровых волонтеров.
Из части биопсийного материала и МНК последовательно была выделена РНК (Extract RNA, Евроген, Россия), проведена реакция обратной транскрипции («ОТ-1», «Синтол», Россия). Методом ПЦР-РВ были определены уровни экспрессии генов LL37 и HBD1. В реакции использовались специфические последовательности праймеров («Синтол», Россия), которые подбирались с помощью программы Primer-BLAST (NCBI). ПЦР-анализ в режиме реального времени проводился на приборе Rotor-Gene Q (QIAGEN Hiden, Германия). Реакция проводилась при следующих условиях: 1) 95 °C – 5 мин – 1 цикл; 2) 95 °C – 15 сек, 60 °C (или 58 °C) – 50 сек – 40 циклов. Обработка полученных данных (Ct) проводилась методом 2-ÄÄC(t) относительно уровня экспрессии гена домашнего хозяйства â-актина (ACTB).
Анализ полученных данных, представленных в относительных единицах, проводился в несколько этапов в программе MC Excel. Статистическая достоверность между группами данных рассчитывалась при помощи непараметрического U-критерия Манна–Уитни, а также H-теста Краскела–Уоллиса.
Результаты и обсуждение
Так, на рисунках 1 и 2 представлены уровни экспрессии гена LL37 у больных с АтД по сравнению со здоровым контролем в крови и коже. Как видно из графиков, экспрессия LL37 снижена у пациентов с АтД на локальном уровне: медианные значения составляют 0,5 и 1 в группе пациентов и здоровых доноров соответственно (p ≤ 0,05). В крови, напротив, наблюдается повышение уровня экспрессии этого показателя как до терапии, так и после нее по сравнению с контролем (H-критерий = 15,69; 2, n = 72; p = 0,00039). Медианы равны 9, 7,6, 0,3 в группах до лечения, после лечения и в контрольной группе соответственно.
Рисунок 1. Уровень экспрессии гена LL37 в коже пациентов с АтД по сравнению с контролем
Примечание.* – p ≤ 0,05.
Figure 1. LL37 gene expression level in the skin of AD patients compared to the control group
Note. *, p ≤ 0.05.
Рисунок 2. Уровень экспрессии гена LL37 в крови пациентов с АтД по сравнению с контролем
Примечание. * – p ≤ 0,017.
Figure 2. LL37 gene expression level in the blood of AD patients compared to the control group
Note. *, p ≤ 0.017.
Для гена HBD1 локально в коже разницы между группой пациентов и контрольной группой выявлено не было. Однако в крови его экспрессия значимо отличалась и имела тенденцию к снижению после лечения. На рисунке 3 представлены уровни экспрессии гена HBD1 в крови. Как показано на графике, экспрессия HBD1 повышалась в крови по сравнению с контролем (H-критерий = 24,76; 2, n = 72; p = 0,00001). Медианы равны 127, 18, 1 в группах до лечения, после лечения и в контрольной группе соответственно.
Рисунок 3. Уровень экспрессии гена HBD1 в крови пациентов с АтД по сравнению с контролем
Примечание. * – p ≤ 0,017.
Figure 3. HBD1 gene expression level in the blood of AD patients compared to the control group
Note. *, p ≤ 0.017.
Известно, что LL37 стимулирует продукцию провоспалительных цитокинов. Однако существуют данные, что при развитии АтД его экспрессия может быть снижена [7]. Наши данные по гену кателицидина в коже не расходятся с примерами из литературы, поскольку его экспрессия в случае АтД снижена. В другом исследовании было показано, что влияние кателицидина в крови на Т-клетки снижало их пролиферативную активность и увеличивало количество Т-регуляторных клеток [3]. В нашем случае имеет место повышение экспрессии этого гена в МНК. В настоящий момент недостаточно данных по поводу функционального значения этого пептида в крови при АтД, поэтому предстоит выяснить, в чем заключается подобное повышение этого показателя.
В отношении пептида HBD1 можно сказать, что он экспрессируется как в моноцитах, так и в макрофагах и является, таким образом, связующим звеном между врожденным и приобретенным иммунитетом [4]. Исследований HBD1 при АтД значительно меньше (например, по сравнению с HBD2 и HBD3). В нашем исследовании экспрессия гена HBD1 повышалась только в крови, что свидетельствует об активации структур врожденного иммунитета на системном уровне в ответ на воспаление.
Заключение
Выявление роли иммунологических маркеров в течении АтД позволит создать новые прогностические подходы при ведении пациентов с атопической патологией. Поэтому важно иметь полное представление о патогенетических механизмах аллергического заболевания.
Благодарности
Выражаем благодарность Центру коллективного пользования «НИИВС им. И.И. Мечникова», Москва, Россия. Исследование выполнено при финансовой поддержке проекта Российской Федерацией в лице Минобрнауки России, соглашение № 075-15-2021-676 от 28.07.2021.
About the authors
E. P. Bystritskaya
I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera
Author for correspondence.
Email: lisabystritskaya@gmail.com
Postgraduate Student, Junior Research Associate, Laboratory of Molecular Immunology
Russian Federation, MoscowN. N. Murashkin
Medical Research Center for Children’s Health; I. Sechenov First Moscow State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation (Sechenov University)
Email: lisabystritskaya@gmail.com
PhD, MD (Medicine), Professor, Senior Research Associate, Head, Department of Dermatology, Head, Laboratory of Skin Pathology in Children; Professor
Russian Federation, Moscow; MoscowAlexander I. Materikin
Medical Research Center for Children’s Health
Email: lisabystritskaya@gmail.com
PhD (Medicine), Dermatovenereologist, Department of Dermatology
Russian Federation, MoscowE. A. Naumova
M. Lomonosov Moscow State University
Email: lisabystritskaya@gmail.com
Research Associate, Department of Genetics, Faculty of Biology
Russian Federation, MoscowI. V. Yakovleva
I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera
Email: lisabystritskaya@gmail.com
PhD (Biology), Research Associate, Laboratory of Cells Hybridomas
Russian Federation, MoscowN. O. Vartanova
I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera
Email: lisabystritskaya@gmail.com
PhD (Biology), Senior Research Associate, Laboratory of Microbiology of Opportunistic Bacteria
Russian Federation, MoscowOxana A. Svitich
I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera; I. Sechenov First Moscow State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation (Sechenov University)
Email: lisabystritskaya@gmail.com
PhD, MD (Medicine), Corresponding Member, Russian Academy of Sciences, Head, Laboratory of Molecular Immunology, Director; Professor, Department of Microbiology, Virology and Immunology
Russian Federation, Moscow; MoscowReferences
- Мурашкин Н.Н., Амбарчян Э.Т., Материкин А.И., Епишев Р.В. Роль нарушений эпидермального барьера при атопическом дерматите: современные концепции патогенеза заболевания // Вопросы современной педиатрии, 2018. Т. 17, № 1. С. 85-88. [Murashkin N.N., Ambarchian E.T., Materikin A.I., Epishev R.V. The role of epidermal barrier impairments in atopic dermatitis: modern concepts of disease pathogenesis. Voprosy sovremennoy pediatrii = Current Pediatrics, 2018, Vol. 17, no. 1, pp. 85-88. (In Russ.)]
- Свитич О.А., Ганковская Л.В., Рахманова И.В., Зайцева И.А., Ганковский В.А. Ассоциация полиморфных маркеров, локализованных в 5’-нетранслируемой области гена Defb 1, с гипертрофией аденоидных вегетаций // Вестник Российского государственного медицинского университета, 2012. T. 3. C. 59-62. [Svitich O.A., Gankovskaya L.V., Rakhmanova I.V., Zaytseva I.A., Gankovskiy V.A. The association of polymorphic markers in the 5`-untranslated region of the DEFB1 gene with adenoid hypertrophy vegetations. Vestnik Rossiyskogo gosudarstvennogo meditsinskogo universiteta = Bulletin of Russian State Medical University, 2012, Vol. 3, pp. 59-62. (In Russ.)]
- Alexandre-Ramos D.S., Silva-Carvalho A.É., Lacerda M.G., Serejo T.R.T., Franco O.L., Pereira R.W., Carvalho J.L., Neves F., Saldanha-Araujo F. LL-37 treatment on human peripheral blood mononuclear cells modulates immune response and promotes regulatory T-cells generation. Biomed. Pharmacother., 2018, Vol. 108, pp. 1584-1590.
- Chieosilapatham P., Ogawa H., Niyonsaba F. Current insights into the role of human β-defensins in atopic dermatitis. Clin. Exp. Immunol., 2017, Vol. 190, no. 2, pp. 155-166.
- Kovalchuk L.V., Gankovskaya L.V., Gankovskaya O.A., Lavrov V.F. Herpes simplex virus: treatment with antimicrobial peptides. Adv. Exp. Med. Biol., 2007, no. 601, pp. 369-376.
- Luger T., Adaskevich U., Anfilova M., Dou X., Murashkin N.N., Namazova-Baranova L., et al. Practical algorithm to inform clinical decision-making in the topical treatment of atopic dermatitis. J. Dermatol., 2021, Vol. 48, no. 8, pp. 1139-1148.
- Reinholz M., Ruzicka T., Schauber J. Cathelicidin LL-37: An Antimicrobial Peptide with a Role in Inflammatory Skin Disease. Ann. Dermatol., 2012, Vol. 24, no. 2, 126. doi: 10.5021/ad.2012.24.2.126.
- Weidinger S., Beck L.A., Bieber T., Kabashima K., Irvine A.D. Atopic dermatitis. Nat. Rev. Dis. Primers, 2018, Vol. 4, 1. doi: 10.1038/s41572-018-0001-z.
Supplementary files
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).