Modulating effects of hexapeptide on the altered phenotype of neutrophil granulocyte CD16+CD62L+CD11b+CD63- and CD16+CD62L+CD11b+CD63+ subsets in children with acute osteomyelitis in the in vitro system

G. A. Chudilova; Чудилова Г. А.; Yu. V. Teterin; Тетерин Ю. В.; V. N. Chapurina; Чапурина В. Н.; E. A. Chicherev; Чичерев Е. А.; V. A. Tarakanov; Тараканов В. А.; I. Vadimovna Nesterova; Нестерова И. В.

doi:10.46235/1028-7221-1206-MEO

Модулирующие эффекты гексапептида на измененный фенотип субпопуляций нейтрофильных гранулоцитов CD16+CD62L+CD11b+CD63- и CD16+CD62L+CD11b+CD63+ детей с острым остеомиелитом в системе in vitro

Авторы: Чудилова Г.А.¹, Тетерин Ю.В.¹, Чапурина В.Н.¹, Чичерев Е.А.¹, Тараканов В.А.¹, Нестерова И.В.¹^,2
Учреждения:
1. ФГБОУ ВО «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ
2. ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов»
Выпуск: Том 25, № 4 (2022)
Страницы: 571-576
Раздел: КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
Дата подачи: 17.07.2022
Дата принятия к публикации: 28.07.2022
Дата публикации: 07.10.2022
URL: https://rusimmun.ru/jour/article/view/1206
DOI: https://doi.org/10.46235/1028-7221-1206-MEO
ID: 1206

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Проблема острого остеомиелита у детей занимает одно из центральных мест среди воспалительных заболеваний костно-мышечной системы. Причинами являются возникшие в организме инфекционные процессы, распространившиеся на костную ткань при различных дисрегуляторных процессах иммунной системы, и в первую очередь нейтрофильных гранулоцитов. Представляет интерес изучение субпопуляций нейтрофильных гранулоцитов, образующихся при включении клетки в воспалительный процесс, при остром остеомиелите у детей и определение возможности влияния на уровень экспрессии рецепторов для коррекции их функций. Целью исследования явилась оценка влияния гексапептида аргинил-альфа-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинина на измененный фенотип субпопуляций нейтрофильных гранулоцитов CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63^- и CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63⁺ детей с острым остеомиелитом в эксперименте in vitro. Исследованы образцы периферической крови детей 10-17 лет с острым остеомиелитом (гематогенным или посттравматическим, n = 12) при поступлении в стационар и условно здоровых детей (n = 7). Образцы крови детей с острым остеомиелитом инкубировали с гексапептидом (10^-6 г/л) 60 мин, Т 37 °С. Проводили определение содержания субпопуляций CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63^- и CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63⁺ нейтрофильных гранулоцитов, оценку плотности экспрессии мембранных рецепторов (FC 500, Beckman Coulter, США); исследовали фагоцитарную функцию с учетом степени завершенности фагоцитарного акта в отношении S. aureus. Установлено, что при остром остеомиелите выявлено значительное увеличение в 8,5 раз доли активированной субпопуляции CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63⁺НГ с фенотипом CD16^brightCD62L^brightCD11b^brightCD63^dimНГ, на фоне снижения субпопуляции CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63^-НГ и изменения ее фенотипа – CD16^dimCD62L^brightCD11b^midCD63^-НГ в сравнении с показателями условно здоровых детей. При этом отмечено увеличение количества активно фагоцитирующих клеток, но снижение показателей, характеризующих процессы захвата и переваривания бактериального антигена. Показано, что гексапептид в эксперименте in vitro модулирует фенотипы обеих изучаемых субпопуляций в CD16^brightCD62L^midCD11b^midCD63^- и CD16^midCD62L^midCD11b^midCD63^dimНГ, способствуя восстановлению уровня экспрессии рецепторов до показателей группы сравнения и фагоцитарной активности как процессов захвата, так и переваривающей способности клеток. Таким образом, установлено значительное доминирование диагностически значимой активированной субпопуляции CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63⁺НГ с фенотипом CD16^brightCD62L^brightCD11b^brightCD63^dimНГ при остром остеомиелите у детей. Показано, что гексапептид в системе in vitro модулирует фенотипы субпопуляций CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63^-НГ и CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63⁺НГ, при этом восстанавливая фагоцитарную активность клеток. В перспективе полученные результаты могут послужить основой при разработке новых эффективных терапевтических схем лечения.

Ключевые слова

нейтрофильные гранулоциты, фенотип субпопуляций, острого остеомиелит, гексапептид, дети

Полный текст

Введение

Трудно поддающиеся лечению глубокие инфекции, такие как остеомиелит (ООМ), остаются серьезной проблемой здравоохранения во всем мире [1, 5, 8] ООМ у детей отмечается в период укрепления и формирования костей. Причинами являются инфекционные процессы, возникшие в организме и распространившиеся на костную ткань при различных дисрегуляторных процессах иммунной системы. S. aureus из-за уникальной способности внедряться, колонизировать и размножаться в костной ткани является высоко специфическим патогенном при ООМ [1].

Нейтрофильные гранулоциты (НГ) хорошо известны своим вкладом в антимикробную защиту, эффективно уничтожая S. aureus посредством фагоцитоза, продукции антимикробных пептидов, активных форм кислорода, секреции провоспалительных цитокинов и хемокинов и образования нейтрофильных внеклеточных ловушек [7]. При этом дисфункции НГ связаны с различными воспалительными сигнатурами в патогенезе инфекции. S. aureus может выживать в фагоцитирующих НГ и в непрофессиональных фагоцитах остеоцитах и остеобластах в костной нише [9]. Процесс интернализации внутрь этих клеток достигается с помощью MSCRAMMs FnBPA и FnBPB, связывающихся с фибриногеном и соединяющихся с интегринами α5β1 на НГ или макрофагах [4]. Кроме того, MSCRAMM, такие как ClfA, ClfB, поверхностно-заякоренные белки (SdrC, SdrD и SdrE) и поверхностный белок SasG, способствуют агрегации бактерий и образованию биопленок на различных биологических поверхностях [4]. S. aureus препятствует комплемент-опосредованной опсонизации и фагоцитозу за счет секреции белков вирулентности – CHIPS, SCIN, CoA и внеклеточного фибриноген-связывающего белка (Efb) [4]. НГ, моноциты и, в меньшей степени, Т-клетки рекрутируются в зону инфекционного воспаления, где сформирована бактериальная биопленка [6]. В ответ на это вырабатываются и высвобождаются хемокины, такие как CXCL8, IL-1β, или воспалительные белки макрофагов CXCL2 и CCL3, которые впоследствии привлекают и активируют еще большее количество НГ, создавая воспалительную микросреду, которая способствует образованию костно-резорбирующих остеокластов [6]. Основными гистопатологическими находками при ООМ являются нейтрофильные инфильтраты, определяемые в них живые микроорганизмы, тромбированные кровеносные сосуды, что свидетельствует о дефектном функционировании НГ. Способность НГ к роллингу, хемотаксису и готовности включения микробицидного арсенала зависит от поверхностных мембранных рецепторов CD62L (селектин L, LAM), CD16 (FcγRIII), CD63 (тетраспанин LAMP-3), CD11b (Mac-1, CR3A). Рецептор адгезии CD62L необходим для перемещения НГ к очагу воспаления. CD63 – основной компонент мембраны лизосом и белок-посредник в передаче сигналов, влияющий на созревание и активацию НГ, оказывая регуляторное воздействие на адгезивную активность CD11/CD18. По уровню экспрессии CD63 можно судить об интенсивности активности миелопероксидазы [3]. CD11b (в присутствии субъединицы CD18) с миелопероксидазой индуцирует запуск каскада внутриклеточных сигнальных адаптерных структур, которые приводят к регулируемой дегрануляции НГ, активности NADPH-оксидаз и увеличению поверхностной экспрессии как CD11b, CD16 так и CD64 (FcγRI), CD32 (FcγRII), TLR, CD40, CD80, CD86, HLA-DR в аутокринной манере [3]. Учитывая высокую пластичность рецепторного аппарата НГ и появление разных субпопуляций НГ при включении клетки в воспалительный процесс, интерес представляет их определение при ООМ и оценка возможности влияния на уровень экспрессии молекул иммунотропными препаратами для корректировки их функций. В этой связи целью нашего исследования явилась оценка влияния гексапептида (ГП)-аргинил-альфа-аспартил-лизил- валил-тирозил-аргинина на измененный фенотип субпопуляций нейтрофильных гранулоцитов CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63^- и CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63⁺ детей с острым остеомиелитом в эксперименте in vitro.

Материалы и методы

Исследованы образцы периферической крови (ПК) детей 10-17 лет (n = 12) с острым остеомиелитом гематогенным или посттравматическим (ООМ) в первый день поступления в хирургический стационар (группа 1) и 7 условно здоровых детей сопоставимых по возрасту (группа сравнения). ПК детей с ООМ инкубировали с ГП (в концентрации 10^-6 г/л) в течение 60 мин при Т 37 °С. ГП – синтетический аналог активного центра гормона тимуса – тимопоэтина, который обладает всеми биологическими активностями нативного гормона тимуса [2]. Известно, что ГП связывается с рецепторами на различных клетках иммунной системы, в том числе на НГ, обладает иммунорегуляторным свойствами, способен восстанавливать баланс окислительно-антиокислительных реакций, инактивировать свободно-радикальные и перекисные соединения.

Проводили цитофлуометрическую оценку доли содержания в ПК НГ субпопуляций CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63^- и CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63⁺ с учетом плотности экспрессии мембранных рецепторов по показателю интенсивности флуоресценции (MFI) (FC 500, Beckman Coulter, США; МкАТ, Beckman Coulter International S.A., Франция). Параллельно исследовали фагоцитарные функции НГ: тестировали содержание активно-фагоцитирующих НГ (%ФАН); определяли объем захваченного бактериального материала (S. aureus, штамм 209) по показателям фагоцитарное число (ФЧ), фагоцитарный индекс (ФИ); для оценки завершения фагоцитарного акта-переваривания определялся процент переваривания (%П), индекс переваривания (ИП).

Статистическую обработку данных осуществляли в компьютерных программах Microsoft Exel 2016 и StatPlus 2010. После оценки нормальности распределения лабораторных показателей использовали непараметрические статистических критерии Вилкоксона–Манна–Уитни. Результаты представляли в виде медианы (верхний и нижний квартиль) – Me (Q_0,25-Q_0,75). Статистически значимые различия определяли при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

При тестировании НГ условно здоровых детей в ПК отмечалось наличие двух субпопуляций CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63^- и CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63⁺. Доля субпопуляций CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63^- составляла 89,5 (81,5-96,8) %, а CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63⁺НГ – 7,5 (0,3-8,7) %. Обе субпопуляции статистически значимо не отличались по уровню экспрессии поверхностных мембранных рецепторов СD16 и CD11b НГ (р > 0,05). При этом преобладающая субпопуляция имела более высокий уровень MFI CD62L – 7,1 (5,4-9,3) против 4,5 (3,5-8,8) на субпопуляции НГ дополнительно экспрессирующей CD63 с MFI 2,2 (1,7-3,2) (табл. 1).

ТАБЛИЦА 1. ВЛИЯНИЕ ГЕКСАПЕПТИДА НА ФЕНОТИП СУБПОПУЛЯЦИЙ СD16⁺СD62L⁺CD11b⁺CD63^-И СD16⁺СD62L⁺CD11b⁺CD63⁺НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ ДЕТЕЙ С ОСТРЫМ ОСТЕОМИЕЛИТОМ, Me (Q_0,25-Q_0,75)

TABLE 1. EFFECT OF HEXAPEPTIDE ON PHENOTYPE OF CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63^- AND CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63⁺ NEUTROPHIL GRANULOCYTES SUBPOPULATIONS OF CHILDREN WITH ACUTE OSTEOMYELITIS, Me (Q_0.25-Q_0.75)

Группа сравнения

Comparison group

Группа 1

Group 1

Группа 1 + ГП

Group 1 + HP

СD16⁺СD62L⁺CD11b⁺CD63^-НГ

СD16⁺СD62L⁺CD11b⁺CD63^-NG

НГ, %

NG, %

89,5

(81,5-96,8)

36,9*

(20,8-52,0)

41,0*

(30,3-45,5)

MFI СD16

129,5

(115,7-131,7)

115,0*

(97,5-105,0)

127^

(106,0-159,5)

MFI CD62L

7,1

(5,4-9,3)

11,2*

(10,9-13,5)

10,5

(9,1-12,0)

MFI CD11b

16,40

(9,6-20,9)

17,8

(16,2-27,5)

11,1

(9,3-14,5)

СD16⁺СD62L⁺CD11b⁺CD63⁺НГ

СD16⁺СD62L⁺CD11b⁺CD63⁺NG

НГ, %

NG, %

7,5

(0,3-8,7)

64,0*

(48,6-82,5)

56,6*

(51,7-68,4)

MFI СD16

127,0

(112,7-130,0)

137*

(130,5-160,0)

122,5^

(109,5-128,8)

MFI CD62L

4,5

(3,5-8,8)

11,2*

(9,8-13,1)

10,2

(9,7-12,0)

MFI CD11b

15,4

(14,9-15,9)

26,0*

(17,2-39,8)

13,4^

(10,4-16,5)

MFI CD63

2,2

(1,7-3,2)

1,4

(1,3-1,7)

1,3

(1,2-1,4)

Примечание. * – различия между показателями группы 1 и группы сравнения, p < 0,05; ^ – различия между показателями группы 1 и группы 1 + ГП, p < 0,05.

Note. *, differences between the indicators of group 1 and the comparison group, p < 0.05; ^, differences between the indicators of group 1 and group 1 + HP, p < 0.05.

При исследовании НГ ПК детей с ООМ выявлено значимое увеличение доли CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63⁺НГ в 8,5 раз по сравнению с показателями определяемыми в группе сравнения (р < 0,05). Также на мембране НГ данной субпопуляции установлено усиление экспрессии поверхностных рецепторов CD16, CD62L, CD11b, на фоне неменяющегося MFI CD63, который значимо не отличался от показателей группы сравнения (табл. 1).

В группе 1 показано снижение доли субпопуляции СD16⁺СD62L⁺CD11b⁺CD63^-НГ (р < 0,05). Кроме того эта субпопуляция характеризовалась более низкой MFI CD16 (р < 0,05) и повышенными уровнями MFI CD62L (р < 0,05) и CD11b (р > 0,05) (табл. 1).

Таким образом, при ООМ отмечается увеличение количества НГ активированной субпопуляции CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63⁺НГ с фенотипом CD16^brightCD62L^brightCD11b^brightCD63^dimНГ. Известно, что активированные НГ обладают высоким цитотоксическим и протеолитическим потенциалом, а также способностью повреждению тканей [3]. Кроме этого наблюдается негативное изменение рецепторного оснащения 2-й субпопуляции CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63^-НГ с формированием фенотипа CD16^dimCD62L^brightCD11b^midCD63^-НГ, который отличается повышенной способностью мигрировать в очаг воспаления, но обладает пониженным биоцидным потенциалом. Если предположить, однако, что бактерии организованы в виде биопленки и что инфильтрация в эту биопленку необходима для фагоцитоза бактерий, наши данные могут в некоторой степени объяснить, почему, несмотря на активацию, НГ не в состоянии контролировать инфекцию, но при этом высвобождают свой цитотоксический, протеолитический и коллагенолитический потенциал. Так обнаружено, что показатели фагоцитарной функции НГ в ПК детей с ООМ статистически значимо отличались от показателей группы сравнения, наблюдалось увеличение количества активно фагоцитирующих НГ (%ФАН) до 66 (58,5-71,1) % против 55 (50,0-57,0) %, что свидетельствовало об активации ответа на инфекционный процесс. Однако отмечалось снижение показателей, характеризующих процессы захвата бактериального антигена – ФЧ 3,8 (2,8-3,9) против 4,84 (4,1-7,05) р < 0,05); ФИ 2,3 (2,0-2,7) против 2,71 (2,2-3,73) в группе сравнения. На этом фоне показано снижение %П 47,8 (47,2-54,0) % против 62,64 (57,9-62,92) % и ИП 1,28 (1,02-1,31) против 1,57 (1,34-1,88) в группе сравнения (р₁ < 0,05; р₂ < 0,05).

Инкубация ПК детей с ООМ в системе in vitro с ГП позволила выявить модулирующие эффекты на фенотип НГ изучаемых субпопуляций при ООМ.

Показано усиление экспрессии MFI CD16 (p < 0,05), на фоне снижения MFI СD62L (p > 0,05) и CD11b (p > 0,05) в субпопуляции CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63^-НГ – с приобретением фенотипа CD16^brightCD62L^midCD11b^midCD63^- (табл. 1). При этом эффекты влияния ГП на субпопуляцию CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63⁺НГ проявлялись снижением MFI CD16(p < 0,05) и MFI СD62L(p > 0,05) и CD11b(p < 0,05). Под действием ГП плотность экспрессии CD63 не менялась – CD16^midCD62L^midCD11b^midCD63^dimНГ. Ожидается, что снижение способности к миграции НГ из кровеносного сосуда в инфицированный участок, снизит негативное влияние активированных при ООМ клеток. Интересно отметить, что на фоне перераспределения оснащенности рецепторами, снижения уровня молекул обеспечивающих хемотаксис, при анализе фагоцитарной функции НГ отмечалось восстановление функций переваривания (%П-57,4 (53,6-61,1); ИП-1,6 (1,3-1,8), на фоне интенсивного захвата S. aureus (%ФАН – 76 (70-77); ФЧ – 3,6 (3,3-3,9), ФИ – 2,7 (2,4-3,1).

Заключение

Таким образом, установлено значительное доминирование диагностически значимой активированной субпопуляции CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63⁺НГ с фенотипом CD16^brightCD62L^brightCD11b^brightCD63^dimНГ. Показано, что гексапептид в эксперименте in vitro модулирует фенотипы субпопуляций CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63^-НГ и CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63⁺НГ, приближая их к значениям группы сравнения при этом восстанавливая фагоцитарную активность клеток. В перспективе это даст возможность разработке наиболее эффективных терапевтических схем лечения, сократить продолжительность антибиотикотерапии, ускорить купирование воспалительного процесса, значительно снизив рост серьезных осложнений.

Исследование выполнено в рамках государственного задания Министерства здравоохранения Российской Федерации № 121031000071-4.