Modulating effects of hexapeptide on the altered phenotype of neutrophil granulocyte CD16+CD62L+CD11b+CD63- and CD16+CD62L+CD11b+CD63+ subsets in children with acute osteomyelitis in the in vitro system

G. A. Chudilova; Чудилова Г. А.; Yu. V. Teterin; Тетерин Ю. В.; V. N. Chapurina; Чапурина В. Н.; E. A. Chicherev; Чичерев Е. А.; V. A. Tarakanov; Тараканов В. А.; I. Vadimovna Nesterova; Нестерова И. В.

doi:10.46235/1028-7221-1206-MEO

Modulating effects of hexapeptide on the altered phenotype of neutrophil granulocyte CD16+CD62L+CD11b+CD63- and CD16+CD62L+CD11b+CD63+ subsets in children with acute osteomyelitis in the in vitro system

Authors: Chudilova G.A.¹, Teterin Y.V.¹, Chapurina V.N.¹, Chicherev E.A.¹, Tarakanov V.A.¹, Nesterova I.V.¹^,2
Affiliations:
1. Kuban State Medical University
2. Peoples’ Friendship University of Russia
Issue: Vol 25, No 4 (2022)
Pages: 571-576
Section: SHORT COMMUNICATIONS
Submitted: 17.07.2022
Accepted: 28.07.2022
Published: 07.10.2022
URL: https://rusimmun.ru/jour/article/view/1206
DOI: https://doi.org/10.46235/1028-7221-1206-MEO
ID: 1206

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

The problem of acute osteomyelitis in children is of special importance among the inflammatory diseases of musculoskeletal system, due to infectious conditions arising in the body and spreading to the bone tissue caused by impaired immune regulation, first of all, concerning neutrophilic granulocytes. Of interest is studying the subsets of neutrophilic granulocytes arising when the cells are involved into the inflammatory process in acute pediatric osteomyelitis, and determining the opportinity to influence the level of receptor expression aiming for correction of their functions. The purpose of our study was to evaluate the effect of hexapeptide arginyl-alpha-aspartyl-lysyl-valyl-tyrosyl-arginine on the altered phenotype of neutrophilic granulocytes in children with acute osteomyelitis using an in vitro experimental model. We examined the peripheral blood samples from children with acute hematogenous or post-traumatic osteomyelitis at the age of 10 to 17 years (n = 12) upon their admission to the hospital, and from healthy children (n = 7). Blood samples from children with acute osteomyelitis were incubated with hexapeptide (10^-6 g/L) for 60 min, at 37 °C. The content of neutrophilic granulocyte subsets (CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63^-and CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63⁺), expression density of appropriate membrane receptors were assessed by flow cytometric technique (FC 500 “Beckman Coulter”, USA). Phagocytic function was studied by assessing the degree of completed phagocytosis of S. aureus. It was found that, in acute osteomyelitis, a 8.5-fold increased proportion of activated CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63⁺NG subset with the CD16^brightCD62L^brightCD11b^brightCD63^dimNG phenotype was revealed, along with a decrease in the CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63^-NG subset and changes in the CD16^dimCD62L^brightCD11b^midCD63^- NG phenotype as compared with reference indexes of healthy children. At the same time, an increased number of actively phagocytic cells was noted, however, with decreased indexes characterizing capture and digestion of the bacterial antigen. In the in vitro experiments, the tested hexapeptide was shown to modulate the phenotypes of both studied subsets (CD16^brightCD62L^midCD11b^midCD63^- and CD16^midCD62L^midCD11b^midCD63^dimNG), thus promoting restoration of the receptor expression levels to the reference group values, as well as phagocytic activity, in terms of uptake and digestive capacity of microbial cells. Thus, the dominance of a diagnostically significant activated CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63⁺ neutrophil subset with the CD16^brightCD62L^brightCD11b^brightCD63^dimNG phenotype was found in acute osteomyelitis in children. The results of in vitro studies have shown that the hexapeptide caused phenotypic modulation of the CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63^- neutrophils, and CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63⁺NG subsets, along with recovery of their phagocytic activity. In the future, our results may provide a basis for the development of new effective therapeutic regimens.

Keywords

neutrophil granulocytes, phenotype of subsets, acute osteomyelitis, hexapeptide, children

Full Text

Введение

Трудно поддающиеся лечению глубокие инфекции, такие как остеомиелит (ООМ), остаются серьезной проблемой здравоохранения во всем мире [1, 5, 8] ООМ у детей отмечается в период укрепления и формирования костей. Причинами являются инфекционные процессы, возникшие в организме и распространившиеся на костную ткань при различных дисрегуляторных процессах иммунной системы. S. aureus из-за уникальной способности внедряться, колонизировать и размножаться в костной ткани является высоко специфическим патогенном при ООМ [1].

Нейтрофильные гранулоциты (НГ) хорошо известны своим вкладом в антимикробную защиту, эффективно уничтожая S. aureus посредством фагоцитоза, продукции антимикробных пептидов, активных форм кислорода, секреции провоспалительных цитокинов и хемокинов и образования нейтрофильных внеклеточных ловушек [7]. При этом дисфункции НГ связаны с различными воспалительными сигнатурами в патогенезе инфекции. S. aureus может выживать в фагоцитирующих НГ и в непрофессиональных фагоцитах остеоцитах и остеобластах в костной нише [9]. Процесс интернализации внутрь этих клеток достигается с помощью MSCRAMMs FnBPA и FnBPB, связывающихся с фибриногеном и соединяющихся с интегринами α5β1 на НГ или макрофагах [4]. Кроме того, MSCRAMM, такие как ClfA, ClfB, поверхностно-заякоренные белки (SdrC, SdrD и SdrE) и поверхностный белок SasG, способствуют агрегации бактерий и образованию биопленок на различных биологических поверхностях [4]. S. aureus препятствует комплемент-опосредованной опсонизации и фагоцитозу за счет секреции белков вирулентности – CHIPS, SCIN, CoA и внеклеточного фибриноген-связывающего белка (Efb) [4]. НГ, моноциты и, в меньшей степени, Т-клетки рекрутируются в зону инфекционного воспаления, где сформирована бактериальная биопленка [6]. В ответ на это вырабатываются и высвобождаются хемокины, такие как CXCL8, IL-1β, или воспалительные белки макрофагов CXCL2 и CCL3, которые впоследствии привлекают и активируют еще большее количество НГ, создавая воспалительную микросреду, которая способствует образованию костно-резорбирующих остеокластов [6]. Основными гистопатологическими находками при ООМ являются нейтрофильные инфильтраты, определяемые в них живые микроорганизмы, тромбированные кровеносные сосуды, что свидетельствует о дефектном функционировании НГ. Способность НГ к роллингу, хемотаксису и готовности включения микробицидного арсенала зависит от поверхностных мембранных рецепторов CD62L (селектин L, LAM), CD16 (FcγRIII), CD63 (тетраспанин LAMP-3), CD11b (Mac-1, CR3A). Рецептор адгезии CD62L необходим для перемещения НГ к очагу воспаления. CD63 – основной компонент мембраны лизосом и белок-посредник в передаче сигналов, влияющий на созревание и активацию НГ, оказывая регуляторное воздействие на адгезивную активность CD11/CD18. По уровню экспрессии CD63 можно судить об интенсивности активности миелопероксидазы [3]. CD11b (в присутствии субъединицы CD18) с миелопероксидазой индуцирует запуск каскада внутриклеточных сигнальных адаптерных структур, которые приводят к регулируемой дегрануляции НГ, активности NADPH-оксидаз и увеличению поверхностной экспрессии как CD11b, CD16 так и CD64 (FcγRI), CD32 (FcγRII), TLR, CD40, CD80, CD86, HLA-DR в аутокринной манере [3]. Учитывая высокую пластичность рецепторного аппарата НГ и появление разных субпопуляций НГ при включении клетки в воспалительный процесс, интерес представляет их определение при ООМ и оценка возможности влияния на уровень экспрессии молекул иммунотропными препаратами для корректировки их функций. В этой связи целью нашего исследования явилась оценка влияния гексапептида (ГП)-аргинил-альфа-аспартил-лизил- валил-тирозил-аргинина на измененный фенотип субпопуляций нейтрофильных гранулоцитов CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63^- и CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63⁺ детей с острым остеомиелитом в эксперименте in vitro.

Материалы и методы

Исследованы образцы периферической крови (ПК) детей 10-17 лет (n = 12) с острым остеомиелитом гематогенным или посттравматическим (ООМ) в первый день поступления в хирургический стационар (группа 1) и 7 условно здоровых детей сопоставимых по возрасту (группа сравнения). ПК детей с ООМ инкубировали с ГП (в концентрации 10^-6 г/л) в течение 60 мин при Т 37 °С. ГП – синтетический аналог активного центра гормона тимуса – тимопоэтина, который обладает всеми биологическими активностями нативного гормона тимуса [2]. Известно, что ГП связывается с рецепторами на различных клетках иммунной системы, в том числе на НГ, обладает иммунорегуляторным свойствами, способен восстанавливать баланс окислительно-антиокислительных реакций, инактивировать свободно-радикальные и перекисные соединения.

Проводили цитофлуометрическую оценку доли содержания в ПК НГ субпопуляций CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63^- и CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63⁺ с учетом плотности экспрессии мембранных рецепторов по показателю интенсивности флуоресценции (MFI) (FC 500, Beckman Coulter, США; МкАТ, Beckman Coulter International S.A., Франция). Параллельно исследовали фагоцитарные функции НГ: тестировали содержание активно-фагоцитирующих НГ (%ФАН); определяли объем захваченного бактериального материала (S. aureus, штамм 209) по показателям фагоцитарное число (ФЧ), фагоцитарный индекс (ФИ); для оценки завершения фагоцитарного акта-переваривания определялся процент переваривания (%П), индекс переваривания (ИП).

Статистическую обработку данных осуществляли в компьютерных программах Microsoft Exel 2016 и StatPlus 2010. После оценки нормальности распределения лабораторных показателей использовали непараметрические статистических критерии Вилкоксона–Манна–Уитни. Результаты представляли в виде медианы (верхний и нижний квартиль) – Me (Q_0,25-Q_0,75). Статистически значимые различия определяли при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

При тестировании НГ условно здоровых детей в ПК отмечалось наличие двух субпопуляций CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63^- и CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63⁺. Доля субпопуляций CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63^- составляла 89,5 (81,5-96,8) %, а CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63⁺НГ – 7,5 (0,3-8,7) %. Обе субпопуляции статистически значимо не отличались по уровню экспрессии поверхностных мембранных рецепторов СD16 и CD11b НГ (р > 0,05). При этом преобладающая субпопуляция имела более высокий уровень MFI CD62L – 7,1 (5,4-9,3) против 4,5 (3,5-8,8) на субпопуляции НГ дополнительно экспрессирующей CD63 с MFI 2,2 (1,7-3,2) (табл. 1).

ТАБЛИЦА 1. ВЛИЯНИЕ ГЕКСАПЕПТИДА НА ФЕНОТИП СУБПОПУЛЯЦИЙ СD16⁺СD62L⁺CD11b⁺CD63^-И СD16⁺СD62L⁺CD11b⁺CD63⁺НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ ДЕТЕЙ С ОСТРЫМ ОСТЕОМИЕЛИТОМ, Me (Q_0,25-Q_0,75)

TABLE 1. EFFECT OF HEXAPEPTIDE ON PHENOTYPE OF CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63^- AND CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63⁺ NEUTROPHIL GRANULOCYTES SUBPOPULATIONS OF CHILDREN WITH ACUTE OSTEOMYELITIS, Me (Q_0.25-Q_0.75)

Группа сравнения

Comparison group

Группа 1

Group 1

Группа 1 + ГП

Group 1 + HP

СD16⁺СD62L⁺CD11b⁺CD63^-НГ

СD16⁺СD62L⁺CD11b⁺CD63^-NG

НГ, %

NG, %

89,5

(81,5-96,8)

36,9*

(20,8-52,0)

41,0*

(30,3-45,5)

MFI СD16

129,5

(115,7-131,7)

115,0*

(97,5-105,0)

127^

(106,0-159,5)

MFI CD62L

7,1

(5,4-9,3)

11,2*

(10,9-13,5)

10,5

(9,1-12,0)

MFI CD11b

16,40

(9,6-20,9)

17,8

(16,2-27,5)

11,1

(9,3-14,5)

СD16⁺СD62L⁺CD11b⁺CD63⁺НГ

СD16⁺СD62L⁺CD11b⁺CD63⁺NG

НГ, %

NG, %

7,5

(0,3-8,7)

64,0*

(48,6-82,5)

56,6*

(51,7-68,4)

MFI СD16

127,0

(112,7-130,0)

137*

(130,5-160,0)

122,5^

(109,5-128,8)

MFI CD62L

4,5

(3,5-8,8)

11,2*

(9,8-13,1)

10,2

(9,7-12,0)

MFI CD11b

15,4

(14,9-15,9)

26,0*

(17,2-39,8)

13,4^

(10,4-16,5)

MFI CD63

2,2

(1,7-3,2)

1,4

(1,3-1,7)

1,3

(1,2-1,4)

Примечание. * – различия между показателями группы 1 и группы сравнения, p < 0,05; ^ – различия между показателями группы 1 и группы 1 + ГП, p < 0,05.

Note. *, differences between the indicators of group 1 and the comparison group, p < 0.05; ^, differences between the indicators of group 1 and group 1 + HP, p < 0.05.

При исследовании НГ ПК детей с ООМ выявлено значимое увеличение доли CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63⁺НГ в 8,5 раз по сравнению с показателями определяемыми в группе сравнения (р < 0,05). Также на мембране НГ данной субпопуляции установлено усиление экспрессии поверхностных рецепторов CD16, CD62L, CD11b, на фоне неменяющегося MFI CD63, который значимо не отличался от показателей группы сравнения (табл. 1).

В группе 1 показано снижение доли субпопуляции СD16⁺СD62L⁺CD11b⁺CD63^-НГ (р < 0,05). Кроме того эта субпопуляция характеризовалась более низкой MFI CD16 (р < 0,05) и повышенными уровнями MFI CD62L (р < 0,05) и CD11b (р > 0,05) (табл. 1).

Таким образом, при ООМ отмечается увеличение количества НГ активированной субпопуляции CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63⁺НГ с фенотипом CD16^brightCD62L^brightCD11b^brightCD63^dimНГ. Известно, что активированные НГ обладают высоким цитотоксическим и протеолитическим потенциалом, а также способностью повреждению тканей [3]. Кроме этого наблюдается негативное изменение рецепторного оснащения 2-й субпопуляции CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63^-НГ с формированием фенотипа CD16^dimCD62L^brightCD11b^midCD63^-НГ, который отличается повышенной способностью мигрировать в очаг воспаления, но обладает пониженным биоцидным потенциалом. Если предположить, однако, что бактерии организованы в виде биопленки и что инфильтрация в эту биопленку необходима для фагоцитоза бактерий, наши данные могут в некоторой степени объяснить, почему, несмотря на активацию, НГ не в состоянии контролировать инфекцию, но при этом высвобождают свой цитотоксический, протеолитический и коллагенолитический потенциал. Так обнаружено, что показатели фагоцитарной функции НГ в ПК детей с ООМ статистически значимо отличались от показателей группы сравнения, наблюдалось увеличение количества активно фагоцитирующих НГ (%ФАН) до 66 (58,5-71,1) % против 55 (50,0-57,0) %, что свидетельствовало об активации ответа на инфекционный процесс. Однако отмечалось снижение показателей, характеризующих процессы захвата бактериального антигена – ФЧ 3,8 (2,8-3,9) против 4,84 (4,1-7,05) р < 0,05); ФИ 2,3 (2,0-2,7) против 2,71 (2,2-3,73) в группе сравнения. На этом фоне показано снижение %П 47,8 (47,2-54,0) % против 62,64 (57,9-62,92) % и ИП 1,28 (1,02-1,31) против 1,57 (1,34-1,88) в группе сравнения (р₁ < 0,05; р₂ < 0,05).

Инкубация ПК детей с ООМ в системе in vitro с ГП позволила выявить модулирующие эффекты на фенотип НГ изучаемых субпопуляций при ООМ.

Показано усиление экспрессии MFI CD16 (p < 0,05), на фоне снижения MFI СD62L (p > 0,05) и CD11b (p > 0,05) в субпопуляции CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63^-НГ – с приобретением фенотипа CD16^brightCD62L^midCD11b^midCD63^- (табл. 1). При этом эффекты влияния ГП на субпопуляцию CD16⁺CD62L⁺CD11b⁺CD63⁺НГ проявлялись снижением MFI CD16(p < 0,05) и MFI СD62L(p > 0,05) и CD11b(p < 0,05). Под действием ГП плотность экспрессии CD63 не менялась – CD16^midCD62L^midCD11b^midCD63^dimНГ. Ожидается, что снижение способности к миграции НГ из кровеносного сосуда в инфицированный участок, снизит негативное влияние активированных при ООМ клеток. Интересно отметить, что на фоне перераспределения оснащенности рецепторами, снижения уровня молекул обеспечивающих хемотаксис, при анализе фагоцитарной функции НГ отмечалось восстановление функций переваривания (%П-57,4 (53,6-61,1); ИП-1,6 (1,3-1,8), на фоне интенсивного захвата S. aureus (%ФАН – 76 (70-77); ФЧ – 3,6 (3,3-3,9), ФИ – 2,7 (2,4-3,1).

Заключение

Author for correspondence.
Email: inesterova1@yandex.ru

PhD, MD (Medicine), Professor, Chief Research Associate, Department of Clinical and Experimental Immunology and Molecular Biology, Central Scientific Research Laboratory; Professor, Department of Allergology and Immunology, Faculty of Continuing Medical Education

Russian Federation, Krasnodar; Moscow

References

Гаврилюк В.П., Статина М.И., Северинов Д.А., Машошина Л.О. Иммунные и метаболические нарушения при остром гематогенном остеомиелите у детей // Вятский медицинский вестник, 2022. № 1 (73). С. 90-96. [Gavrilyuk V.P., Statina M.I., Severinov D.A., Mashoshina L.O. Immune and metabolic disorders in acute hematogenous osteomyelitis in children. Vyatskiy meditsinskiy vestnik = Vyatka Medical Bulletin, 2022, no. 1 (73), pp. 90-96. (In Russ.)]
Кологривова Е.Н., Плешко Р.И., Щербик Н.В., Староха А.В., Чичинскас Э. Влияние интраназального применения Имунофана на активность фагоцитов при комплексной терапии экссудативного среднего отита у детей // Медицинская иммунология, 2020. Т. 22, № 4. С. 741-750. [Kologrivova E.N., Pleshko R.I., Scherbik N.V., Starokha A.V., Chichinskas E. Effects of intranasal Imunofan administration upon phagocytic activity in treatment of exudative otitis media in children. Meditsinskaya immunologiya = Medical Immunology (Russia). 2020, Vol. 22 (4), рр. 741-750. (In Russ.)] doi: 10.15789/1563-0625-EOI-1720.
Нейтрофильные гранулоциты: отражение в зеркале современных представлений. Под ред. Нестеровой И.В., Чудиловой Г.А. UK, USA, Moscow: Capricorn Publishing, 2018. 338 с. [Neutrophil granulocytes: reflection in the mirror of modern ideas. Ed. Nesterova I.V., Chudilova G.A. UK, USA]. Moscow: Capricorn Publishing, 2018. 338 p.
Brandt S.L., Putnam N.E., Cassat J.E., Serezani C.H. Innate immunity to staphylococcus aureus: evolving paradigms in soft tissue and invasive infections. J. Immunol., 2018, Vol. 200, pp. 3871-3880.
Bryan A.J., Abdel M.P., Sanders T.L., Fitzgerald S.F., Hanssen A.D., Berry D.J. Irrigation and debridement with component retention for acute infection after hip arthroplasty: improved results with contemporary management. J. Bone Joint Surg. Am., 2017, Vol. 99, no. 23, pp. 2011-2018.
Dapunt U., Giese T., Maurer S., Stegmaier S., Prior B., Hänsch G.M., Gaida M.M. Neutrophil-derived MRP-14 is up-regulated in infectious osteomyelitis and stimulates osteoclast generation. J. Leukoc. Biol., 2015, Vol. 98, no. 4, pp. 575-582.
Rigby K.M., DeLeo F.R. Neutrophils in innate host defense against Staphylococcus aureus infections. Semin. Immunopathol, 2012, Vol. 34, pp. 237-259.
Tande A.J., Patel R. Prosthetic joint infection. Clin. Microbiol. Rev., 2014, Vol. 27, no. 2, pp. 302-345.
Yang D., Wijenayaka A.R., Solomon L.B., Pederson S.M., Findlay D.M., Kidd S.P., Atkins G.J. Novel insights into staphylococcus aureus deep bone infections: the involvement of osteocytes. mBio, 2018, Vol. 9, no. 2, e00415-18. doi: 10.1128/mBio.00415-18.

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

Username
Password
Remember me

Forgot password?	Register

Username
Password
Remember me

Forgot password?	Register

Modulating effects of hexapeptide on the altered phenotype of neutrophil granulocyte CD16+CD62L+CD11b+CD63- and CD16+CD62L+CD11b+CD63+ subsets in children with acute osteomyelitis in the in vitro system

Full Text

Abstract

Keywords

Full Text

Введение

Материалы и методы

Результаты и обсуждение

Заключение

About the authors

G. A. Chudilova

Yu. V. Teterin

V. N. Chapurina

E. A. Chicherev

V. A. Tarakanov

I. Vadimovna Nesterova

References

Supplementary files

This website uses cookies