Interaction between MSCS and blood mononuclear cells during  in vitro  co-cultivation in the presence of a three-dimensional artificial matrix mimicking regenerating bone tissue

Kristina A. Yurova; Юрова Кристина Алексеевна; I. K. Norkin; Норкин И. К.; O. G. Khaziakhmatova; Хазиахматова О. Г.; V. V. Malashchenko; Малащенко В. В.; O. B. Melashchenko; Мелащенко О. Б.; P. A. Ivanov; Иванов П. А.; D. D. Ligatyuk; Лигатюк Д. Д.; I. A. Khlusov; Хлусов И. А.; L. S. Litvinova; Литвинова Л. С.

doi:10.46235/1028-7221-13547-IBM

Взаимовлияние ММСК и мононуклеарных клеток крови при сокультивировании in vitro в присутствии трехмерного искусственного матрикса, имитирующего регенерирующую костную ткань

Авторы: Юрова К.А.¹, Норкин И.К.¹, Хазиахматова О.Г.¹, Малащенко В.В.¹, Мелащенко О.Б.¹, Иванов П.А.¹, Лигатюк Д.Д.¹, Хлусов И.А.¹, Литвинова Л.С.¹
Учреждения:
1. ФГАОУ ВО «Балтийский федеральный университет имени Иммануила Канта»
Выпуск: Том 26, № 4 (2023)
Страницы: 443-448
Раздел: Школа Клинической Иммунологии "Сочи-2023"
Дата подачи: 08.07.2023
Дата принятия к публикации: 12.07.2023
Дата публикации: 22.09.2023
URL: https://rusimmun.ru/jour/article/view/13547
DOI: https://doi.org/10.46235/1028-7221-13547-IBM
ID: 13547

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Репарация и регенерация костной ткани – сложный процесс с участием множества клеток, регулируемый многими факторами. Иммунные клетки и цитокины играют решающую роль в регуляции баланса костеобразования и резорбции кости. Однако иммуномодулирующий механизм регенерации кости до сих пор неясен. Тем не менее достоверно известно о взаиморегулирующем влиянии иммунокомпетентных клеток и мезенхимальных стволовых клеток (МСК). МСК и иммунокомпетентные клетки секретируют несколько цитокинов, факторов роста и молекул внеклеточного матрикса, которые играют важную роль в регуляции кроветворения, ангиогенеза, иммунного и воспалительного ответа. Различные исследования подтверждают, что разные молекулы, экспрессируемые МСК, могут инициировать пролиферацию лимфоцитов. Таким образом, исследование взаимного влияния МСК и мононуклеарных клеток крови при совместном сокультивировании in vitro, в том числе в присутствии искусственного матрикса, имитирующего регенерирующую костную ткань, является актуальным и своевременным. В настоящем эксперименте были проведены исследования на границе раздела фаз живой / неживой материи, что имитировало систему «регенерирующая кость / кроветворное микроокружение». Был проведен цикл исследований, разделенных во времени, на пластиковой поверхности (2D-модель культивирования) и в присутствии трехмерных искусственных матриксов, имитирующих регенерирующую костную ткань (3D-модель культивирования).

Ключевые слова

ММСК, мононуклеарные клетки крови, 3D-матрикс, in vitro, ПЦР, мультиплексный анализ

Полный текст

Исследование выполнено в рамках реализации проекта Государственного задания № FZWM-2020-0010.

Введение

Иммунная система играет важную роль в формировании тканей и резорбции костей. В последнее время многие исследования продемонстрировали сложные взаимодействия между иммунной и скелетной системами. Иммунные клетки и секретируемые ими цитокины способствуют регуляции костного гомеостаза, а костные клетки, включая остеобласты, остеокласты, остеоциты, также влияют на клеточные функции иммунных клеток.

Лейкоциты крови являются одними из первых клеток, мигрирующих в участок физиологической и, в большей степени, репаративной регенерации костной ткани [4]. Для исследования закономерностей функционирования МНК в подобных условиях была разработана in vitro 3D-гомеостатическая модель сокультивирования иммунных клеток с МСК в присутствии искусственного матрикса, имитирующего в трехмерном масштабе минеральное вещество костной ткани.

Известно, что клетки существуют в тканях разной степени жесткости, от мягкой мозговой ткани до жесткой кортикальной кости. In vitro было показано, что жесткость матрикса или субстрата также играет важную роль в регуляции дифференцировки МСК [5]. Использование трехмерной (3D) пространственной организации клеточной культуры в условиях культивирования in vitro приближено к физиологическим параметрам клеточной жизнедеятельности [1].

В связи с вышесказанным, исследование физиологических механизмов, определяющих реакции МСК и иммунокомпетентных клеток на структурные и гуморальные сигналы микроокружения, является своевременным и актуальным.

В настоящее время появляется все больше данных, указывающих на то, что регуляция иммунного микроокружения является многообещающей терапевтической целью, способствующей функциональной регенерации костной ткани [6].

Таким образом, целью исследования явилось выявление функциональных особенностей МСК и мононуклеарных клеток крови (МНК) при совместном сокультивировании in vitro в присутствии трехмерного искусственного матрикса, имитирующего регенерирующую костную ткань.

Материалы и методы

Для реализации настоящего эксперимента были проведены исследования на границе раздела фаз живой/неживой материи, что имитировало систему «регенерирующая кость / кроветворное микроокружение». Был проведен цикл исследований, разделенных во времени, на пластиковой поверхности (2D-модель культивирования) и в присутствии трехмерных искусственных матриксов, имитирующих регенерирующую костную ткань (3D-модель культивирования).

В качестве нормальных иммунокомпетентных клеток, используемых для имитации модели физиологической регенерации in vitro, использовали мононуклерные лейкоциты (МНК). Выделение МНК из лейковзвеси здоровых доноров проводилось стандартным методом центрифугирования на градиенте плотности фиколл-урографин (Pharmacia, Швеция) (р = 1,077 г/см³). Разрешение на проведение исследования получено в локальном этическом комитете Инновационного парка БФУ имени И. Канта (№ 5 от 16 мая 2016 г.).

МСК выделялись из липоаспирата человека (Разрешение № 1 от 28.02.2019 г. локального этического комитета БФУ имени И. Канта), как описано [7].

Титановые подложки из коммерчески чистого титана ВТ1.0, размером 10 × 10 × 1 мм³ и индексом шероховатости (Ra) 2-3 мкм, используемые для имитации in vitro состояние трехмерной (3D) культуры, имели двухстороннее покрытие из фосфатов кальция, нанесенное методом микродугового оксидирования на установке Microarc-3.0 (Институт физики прочности и материаловедения СО РАН, г. Томск) в анодном режиме [3].

Для оценки иммунного ответа был произведен комплексный анализ функциональной активности мононуклеарных лейкоцитов в разных условиях культивирования in vitro по истечении 48 часов культивирования. На 14-е сутки культивирования оценивали особенности клеточного функционирования мезенхимальных стволовых клеток на пластике и в присутствии трехмерного матрикса. Для изучения особенностей клеточного взаимодействия МСК с клетками иммунной системы было проведено сокультивирование этих клеточных линий в разных условиях экспериментального исследовании в соответствии с дизайном эксперимента.

Культивирование МНК, МСК и смешанных культур проводили в полной питательной среде (ППС). ППС состояла из α-МЕМ (Sigma-Aldrich, США), 10% инактивированной (56 °С в течение 30 мин) сыворотки крови эмбрионов коров (Sigma-Aldrich, США), 2 mM/л L-глютамина (Sigma-Aldrich, США), 100 Е/мкг/мл пенициллин/ стрептамицин (Gibco Life Technologies, США). Культивирование проводилось в течение 48 часов/14 суток при 37 °С, во влажной атмосфере, содержащей 5% СO₂.

В качестве контрольных моделей использовали монокультуру МНК на пластике, 3D-монокультуру МНК, МСК на пластике, 3D-монокультуру МСК.

Оценка морфофункционального состояния (активации, дифференцировки, созревания, пролиферации) клеточных культур в условиях 2D- и 3D-сокультивирования проводилась с помощью следующих методов:

Изучение антигенных детерминант с использованием метода проточной цитофлюориметрии с использованием коктейля моноклональных антител к CD3, CD4, CD8, CD25, CD71, CD95, CD45, CD45RA, CD45RO (eВioscience, США), приготовленного ex temporo. А также MSC Phenotyping Kit human – 130-095-198 (Miltenyi Biotec, США) на проточном цитофлуориметре MACS Quant (Miltenyi Biotec, Германия).
Количественное определение факторов роста, про- и антивоспалительных цитокинов (IL-1β, IL-1ra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, Eotaxin, FGF, G-CSF, GM-CSF, IFNγ, IP-10, MCP-1, MIP-1α, PDGF-BB, MIP-1β, RANTES, TNFα, VEGF) в супернатантах исследуемых культур клеток проводилось методом проточной флюориметрии на автоматизированном анализаторе (Bio-Plex Protein Assay System, Bio-Rad, США) с использованием коммерческих тест-систем (Bio-PlexProHuman cytokine Group I Assays, Bio-Rad, США).
Определение экспрессии мРНК исследуемых генов, ассоциированных дифференцировкой (U2af1l4, Gfi1, hnRNPLL) иммунокомпетентных клеток проводили с методом полимеразной цепной реакции на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, США).

Статистическая обработка результатов осуществлялась с помощью программы IBM SPSS Statistics 20 (Statistical Package for the Social Sciences).

Результаты и обсуждение

В смешанной модели 2D-культивирования, по истечении 14 суток, соотношения популяций CD4/CD8 соответствовало таковому в монокультуре МНК. Анализ количества клеток, несущих на своей поверхности маркеры ранней (CD25⁺, CD71⁺) и длительной (CD95⁺) активации, показал увеличение клеток в смешанных 2D- и 3D-культурах по сравнению с данными, полученными при оценке краткосрочного (48 часов) культивирования монокультур МНК. Важно отметить, что присутствие трехмерных матриксов в смешанной культуре МСК + МНК статистически значимо увеличивало число клеток с фенотипом CD3⁺CD95⁺.

Также было выявлено увеличение Т-клеток с фенотипом CD3⁺СD45R0⁺ и переходных форм CD3⁺CD45RO⁺CD45RA⁺, которое отмечалось за счет реэкспрессии высокомолекулярной изоформы СD45 – СD45RА⁺.

По истечении 14 суток культивирования в 3D-монокультуре МСК, а также в смешанной модели культивирования (МСК + МНК), как в присутствии трехмерных образцов, имитирующих регенерирующую костную ткань, так и без них, было выявлено достоверное увеличение числа клеток, экспрессирующих маркеры гемопоэтических клеток CD (45⁺, 34⁺, 14⁺, 20⁺). Кроме того, в трехмерной модели монокультуры МСК, а также в обеих смешанных моделях культивирования отмечалось статистически значимое снижение числа клеток, несущих на своей поверхности молекулы CD105⁺ и CD90⁺ (на 14-е сутки) по сравнению со значениями, полученными в 2D-модели. Количество CD73⁺ клеток по окончании времени культивирования фиксировалось на уровне контрольных значений.

Оценка содержания факторов в культуре МСК человека показала, что действие искусственного трехмерного матрикса, имитирующего регенерирующую костную ткань, направлено, преимущественно, на снижение концентрации факторов с провоспалительной (IFNα, IFNγ, IL-6, IP-10, TNFα), хемоаттрактантной (RANTES) и проапоптотической (TRAIL) активностью.

В смешанной модели культивирования МСК + МНК концентрация исследуемых провоспалительных цитокинов статистически значимо увеличивалась, как в условиях культивирования на пластике, так и при добавлении трехмерных матриксов. Отличия были зафиксированы при сравнении с монокультурой мононуклеарных клеток, а также с монокультурой МСК. Важно отметить, что в смешанной 3D-культуре наблюдалась максимальная продукция IFNγ и RANTES. Максимальные значения IL-6 были задетектированы в смешанной двумерной модели культивирования.

В монокультуре МСК добавление трехмерного матрикса в среду культивирования статистически значимо снижало уровень концентрации противовоспалительных цитокинов IL-4, IL-10, IL-13. Однако в смешанной модели культивирования МСК + МНК уровни исследуемых молекул статистически значимо повышались, как в условиях культивирования на пластике, так и в присутствии трехмерных матриксов.

Оценка уровня относительной экспрессии генов дифференцировки T-лимфоцитов при сокультивировании с трехмерным матриксом в смешанной культуре показала достоверное увеличение экспрессии мРНК гена U2af1l4 (в среднем на 87%). Увеличение транскрипции мРНК гена U2af1l4 положительно коррелировало с числом Т-клеток с фенотипом CD3⁺СD45R0⁺ в смешанной 3D-культуре. Экспрессия мРНК генов Gfi1, hnRNPLL детектировалась на уровне значений трехмерной монокультуры МНК.

По результатам исследования смешанной двумерной (2D) культуры МСК и МНК на пластике было выявлено достоверное увеличение уровня концентрации многих исследуемых цитокинов, по сравнению с контрольными культурами. Спектр цитокинов, продуцируемых МСК, способствовал увеличению числа МНК, несущих на своей поверхности маркеры ранней (CD25) и поздней (CD71) активации, а также содержания дубль позитивных лейкоцитов, преимущественно за счет повышения числа CD45R0⁺ клеток. Рост содержания Т-клеток с фенотипом CD3⁺СD45R0⁺ в смешанной культуре был обусловлен увеличением транскрипции мРНК гена U2AF26, что подтверждено позитивной корреляционной взаимосвязью между исследуемыми параметрами (r = 0,67; p < 0,05). При этом транскрипция мРНК гена Gfi1 оставалась на уровне значений, полученных при оценке монокультур МНК.

Нами было показано, что мононуклеарные клетки крови, в основном CD4⁺T-клетки, обладали костимулирующим эффектом на продукцию ангиогенных и остеомодулирующих молекул [2].

Паракринное влияние МНК на МСК способствовало увеличению числа гемопоэтических стволовых клеток в смешанной культуре. Таким образом, при in vitro моделировании инфильтрации МНК из крови в ткани отмечен всплеск секреторной активности смешанной культуры стромальных клеток и лейкоцитов крови, что лежит в основе воспалительных и регенераторных процессов.

Также было выявлено, что 3D-матриксы с шероховатым КФ покрытием, в условиях моделирования воспалительного инфильтрата МНК, индуцирующего продуктивное воспаление и/или фазу пролиферации воспалительного процесса, способствуют регенерации костной ткани, посредством усиления функциональной (секреторной) активности смешанной культуры стромальных клеток и нормальных лейкоцитов крови.

Заключение

Резюмируя вышесказанное: 3D-матриксы выступают в роли активационных агентов, опосредованно запускающих изменение цитокинового профиля микроокружения МСК и иммунокомпетентных клеток, что способствует инициации процессов активации, пролиферации и клеточной дифференцировки, необходимых для эффективной регенерации костной ткани.