Interaction between MSCS and blood mononuclear cells during  in vitro  co-cultivation in the presence of a three-dimensional artificial matrix mimicking regenerating bone tissue

Kristina A. Yurova; Юрова Кристина Алексеевна; I. K. Norkin; Норкин И. К.; O. G. Khaziakhmatova; Хазиахматова О. Г.; V. V. Malashchenko; Малащенко В. В.; O. B. Melashchenko; Мелащенко О. Б.; P. A. Ivanov; Иванов П. А.; D. D. Ligatyuk; Лигатюк Д. Д.; I. A. Khlusov; Хлусов И. А.; L. S. Litvinova; Литвинова Л. С.

doi:10.46235/1028-7221-13547-IBM

Interaction between MSCS and blood mononuclear cells during in vitro co-cultivation in the presence of a three-dimensional artificial matrix mimicking regenerating bone tissue

Authors: Yurova K.A.¹, Norkin I.K.¹, Khaziakhmatova O.G.¹, Malashchenko V.V.¹, Melashchenko O.B.¹, Ivanov P.A.¹, Ligatyuk D.D.¹, Khlusov I.A.¹, Litvinova L.S.¹
Affiliations:
1. Immanuel Kant Baltic Federal University
Issue: Vol 26, No 4 (2023)
Pages: 443-448
Section: Forum Sochi 2023
Submitted: 08.07.2023
Accepted: 12.07.2023
Published: 22.09.2023
URL: https://rusimmun.ru/jour/article/view/13547
DOI: https://doi.org/10.46235/1028-7221-13547-IBM
ID: 13547

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Bone tissue repair and regeneration is a complex process involving many cells and controlled by multiple factors. Immune cells and cytokines play a crucial role in regulating the balance of bone formation and resorption. However, the immunomodulatory mechanism of bone regeneration is still unclear. Nevertheless, the reciprocal regulatory influence of immunocompetent cells and mesenchymal stem cells (MSCs) is well known. MSCs and immunocompetent cells secrete various cytokines, growth factors, and extracellular matrix molecules that play important roles in regulating hematopoiesis, angiogenesis, immune and inflammatory responses. Several studies confirm that different molecules expressed by MSCs may induce lymphocyte proliferation. Therefore, the study of the mutual influence of MSCs and blood mononuclear cells during in vitro co-cultivation, even in the presence of an artificial matrix mimicking regenerating bone tissue, is relevant and expedient. In this experimental series, the studies were performed at the interface between living and non-living substrate phases thus mimicking the “regenerating bone / hematopoietic microenvironment” system. A series of separated in time experiments was performed on a plastic surface (2D culture model) and in the presence of three-dimensional artificial matrices mimicking regenerating bone tissue (3D culture model).

Keywords

mesenchymal stem cells, blood mononuclear cells, 3D matrix, in vitro, PCR, multiplex analysis

Full Text

Исследование выполнено в рамках реализации проекта Государственного задания № FZWM-2020-0010.

Введение

Иммунная система играет важную роль в формировании тканей и резорбции костей. В последнее время многие исследования продемонстрировали сложные взаимодействия между иммунной и скелетной системами. Иммунные клетки и секретируемые ими цитокины способствуют регуляции костного гомеостаза, а костные клетки, включая остеобласты, остеокласты, остеоциты, также влияют на клеточные функции иммунных клеток.

Лейкоциты крови являются одними из первых клеток, мигрирующих в участок физиологической и, в большей степени, репаративной регенерации костной ткани [4]. Для исследования закономерностей функционирования МНК в подобных условиях была разработана in vitro 3D-гомеостатическая модель сокультивирования иммунных клеток с МСК в присутствии искусственного матрикса, имитирующего в трехмерном масштабе минеральное вещество костной ткани.

Известно, что клетки существуют в тканях разной степени жесткости, от мягкой мозговой ткани до жесткой кортикальной кости. In vitro было показано, что жесткость матрикса или субстрата также играет важную роль в регуляции дифференцировки МСК [5]. Использование трехмерной (3D) пространственной организации клеточной культуры в условиях культивирования in vitro приближено к физиологическим параметрам клеточной жизнедеятельности [1].

В связи с вышесказанным, исследование физиологических механизмов, определяющих реакции МСК и иммунокомпетентных клеток на структурные и гуморальные сигналы микроокружения, является своевременным и актуальным.

В настоящее время появляется все больше данных, указывающих на то, что регуляция иммунного микроокружения является многообещающей терапевтической целью, способствующей функциональной регенерации костной ткани [6].

Таким образом, целью исследования явилось выявление функциональных особенностей МСК и мононуклеарных клеток крови (МНК) при совместном сокультивировании in vitro в присутствии трехмерного искусственного матрикса, имитирующего регенерирующую костную ткань.

Материалы и методы

Для реализации настоящего эксперимента были проведены исследования на границе раздела фаз живой/неживой материи, что имитировало систему «регенерирующая кость / кроветворное микроокружение». Был проведен цикл исследований, разделенных во времени, на пластиковой поверхности (2D-модель культивирования) и в присутствии трехмерных искусственных матриксов, имитирующих регенерирующую костную ткань (3D-модель культивирования).

В качестве нормальных иммунокомпетентных клеток, используемых для имитации модели физиологической регенерации in vitro, использовали мононуклерные лейкоциты (МНК). Выделение МНК из лейковзвеси здоровых доноров проводилось стандартным методом центрифугирования на градиенте плотности фиколл-урографин (Pharmacia, Швеция) (р = 1,077 г/см³). Разрешение на проведение исследования получено в локальном этическом комитете Инновационного парка БФУ имени И. Канта (№ 5 от 16 мая 2016 г.).

МСК выделялись из липоаспирата человека (Разрешение № 1 от 28.02.2019 г. локального этического комитета БФУ имени И. Канта), как описано [7].

Титановые подложки из коммерчески чистого титана ВТ1.0, размером 10 × 10 × 1 мм³ и индексом шероховатости (Ra) 2-3 мкм, используемые для имитации in vitro состояние трехмерной (3D) культуры, имели двухстороннее покрытие из фосфатов кальция, нанесенное методом микродугового оксидирования на установке Microarc-3.0 (Институт физики прочности и материаловедения СО РАН, г. Томск) в анодном режиме [3].

Для оценки иммунного ответа был произведен комплексный анализ функциональной активности мононуклеарных лейкоцитов в разных условиях культивирования in vitro по истечении 48 часов культивирования. На 14-е сутки культивирования оценивали особенности клеточного функционирования мезенхимальных стволовых клеток на пластике и в присутствии трехмерного матрикса. Для изучения особенностей клеточного взаимодействия МСК с клетками иммунной системы было проведено сокультивирование этих клеточных линий в разных условиях экспериментального исследовании в соответствии с дизайном эксперимента.

Культивирование МНК, МСК и смешанных культур проводили в полной питательной среде (ППС). ППС состояла из α-МЕМ (Sigma-Aldrich, США), 10% инактивированной (56 °С в течение 30 мин) сыворотки крови эмбрионов коров (Sigma-Aldrich, США), 2 mM/л L-глютамина (Sigma-Aldrich, США), 100 Е/мкг/мл пенициллин/ стрептамицин (Gibco Life Technologies, США). Культивирование проводилось в течение 48 часов/14 суток при 37 °С, во влажной атмосфере, содержащей 5% СO₂.

В качестве контрольных моделей использовали монокультуру МНК на пластике, 3D-монокультуру МНК, МСК на пластике, 3D-монокультуру МСК.

Оценка морфофункционального состояния (активации, дифференцировки, созревания, пролиферации) клеточных культур в условиях 2D- и 3D-сокультивирования проводилась с помощью следующих методов:

Изучение антигенных детерминант с использованием метода проточной цитофлюориметрии с использованием коктейля моноклональных антител к CD3, CD4, CD8, CD25, CD71, CD95, CD45, CD45RA, CD45RO (eВioscience, США), приготовленного ex temporo. А также MSC Phenotyping Kit human – 130-095-198 (Miltenyi Biotec, США) на проточном цитофлуориметре MACS Quant (Miltenyi Biotec, Германия).
Количественное определение факторов роста, про- и антивоспалительных цитокинов (IL-1β, IL-1ra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, Eotaxin, FGF, G-CSF, GM-CSF, IFNγ, IP-10, MCP-1, MIP-1α, PDGF-BB, MIP-1β, RANTES, TNFα, VEGF) в супернатантах исследуемых культур клеток проводилось методом проточной флюориметрии на автоматизированном анализаторе (Bio-Plex Protein Assay System, Bio-Rad, США) с использованием коммерческих тест-систем (Bio-PlexProHuman cytokine Group I Assays, Bio-Rad, США).
Определение экспрессии мРНК исследуемых генов, ассоциированных дифференцировкой (U2af1l4, Gfi1, hnRNPLL) иммунокомпетентных клеток проводили с методом полимеразной цепной реакции на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, США).

Статистическая обработка результатов осуществлялась с помощью программы IBM SPSS Statistics 20 (Statistical Package for the Social Sciences).

Результаты и обсуждение

В смешанной модели 2D-культивирования, по истечении 14 суток, соотношения популяций CD4/CD8 соответствовало таковому в монокультуре МНК. Анализ количества клеток, несущих на своей поверхности маркеры ранней (CD25⁺, CD71⁺) и длительной (CD95⁺) активации, показал увеличение клеток в смешанных 2D- и 3D-культурах по сравнению с данными, полученными при оценке краткосрочного (48 часов) культивирования монокультур МНК. Важно отметить, что присутствие трехмерных матриксов в смешанной культуре МСК + МНК статистически значимо увеличивало число клеток с фенотипом CD3⁺CD95⁺.

Также было выявлено увеличение Т-клеток с фенотипом CD3⁺СD45R0⁺ и переходных форм CD3⁺CD45RO⁺CD45RA⁺, которое отмечалось за счет реэкспрессии высокомолекулярной изоформы СD45 – СD45RА⁺.

По истечении 14 суток культивирования в 3D-монокультуре МСК, а также в смешанной модели культивирования (МСК + МНК), как в присутствии трехмерных образцов, имитирующих регенерирующую костную ткань, так и без них, было выявлено достоверное увеличение числа клеток, экспрессирующих маркеры гемопоэтических клеток CD (45⁺, 34⁺, 14⁺, 20⁺). Кроме того, в трехмерной модели монокультуры МСК, а также в обеих смешанных моделях культивирования отмечалось статистически значимое снижение числа клеток, несущих на своей поверхности молекулы CD105⁺ и CD90⁺ (на 14-е сутки) по сравнению со значениями, полученными в 2D-модели. Количество CD73⁺ клеток по окончании времени культивирования фиксировалось на уровне контрольных значений.

Оценка содержания факторов в культуре МСК человека показала, что действие искусственного трехмерного матрикса, имитирующего регенерирующую костную ткань, направлено, преимущественно, на снижение концентрации факторов с провоспалительной (IFNα, IFNγ, IL-6, IP-10, TNFα), хемоаттрактантной (RANTES) и проапоптотической (TRAIL) активностью.

В смешанной модели культивирования МСК + МНК концентрация исследуемых провоспалительных цитокинов статистически значимо увеличивалась, как в условиях культивирования на пластике, так и при добавлении трехмерных матриксов. Отличия были зафиксированы при сравнении с монокультурой мононуклеарных клеток, а также с монокультурой МСК. Важно отметить, что в смешанной 3D-культуре наблюдалась максимальная продукция IFNγ и RANTES. Максимальные значения IL-6 были задетектированы в смешанной двумерной модели культивирования.

В монокультуре МСК добавление трехмерного матрикса в среду культивирования статистически значимо снижало уровень концентрации противовоспалительных цитокинов IL-4, IL-10, IL-13. Однако в смешанной модели культивирования МСК + МНК уровни исследуемых молекул статистически значимо повышались, как в условиях культивирования на пластике, так и в присутствии трехмерных матриксов.

Оценка уровня относительной экспрессии генов дифференцировки T-лимфоцитов при сокультивировании с трехмерным матриксом в смешанной культуре показала достоверное увеличение экспрессии мРНК гена U2af1l4 (в среднем на 87%). Увеличение транскрипции мРНК гена U2af1l4 положительно коррелировало с числом Т-клеток с фенотипом CD3⁺СD45R0⁺ в смешанной 3D-культуре. Экспрессия мРНК генов Gfi1, hnRNPLL детектировалась на уровне значений трехмерной монокультуры МНК.

По результатам исследования смешанной двумерной (2D) культуры МСК и МНК на пластике было выявлено достоверное увеличение уровня концентрации многих исследуемых цитокинов, по сравнению с контрольными культурами. Спектр цитокинов, продуцируемых МСК, способствовал увеличению числа МНК, несущих на своей поверхности маркеры ранней (CD25) и поздней (CD71) активации, а также содержания дубль позитивных лейкоцитов, преимущественно за счет повышения числа CD45R0⁺ клеток. Рост содержания Т-клеток с фенотипом CD3⁺СD45R0⁺ в смешанной культуре был обусловлен увеличением транскрипции мРНК гена U2AF26, что подтверждено позитивной корреляционной взаимосвязью между исследуемыми параметрами (r = 0,67; p < 0,05). При этом транскрипция мРНК гена Gfi1 оставалась на уровне значений, полученных при оценке монокультур МНК.

Нами было показано, что мононуклеарные клетки крови, в основном CD4⁺T-клетки, обладали костимулирующим эффектом на продукцию ангиогенных и остеомодулирующих молекул [2].

Паракринное влияние МНК на МСК способствовало увеличению числа гемопоэтических стволовых клеток в смешанной культуре. Таким образом, при in vitro моделировании инфильтрации МНК из крови в ткани отмечен всплеск секреторной активности смешанной культуры стромальных клеток и лейкоцитов крови, что лежит в основе воспалительных и регенераторных процессов.

Также было выявлено, что 3D-матриксы с шероховатым КФ покрытием, в условиях моделирования воспалительного инфильтрата МНК, индуцирующего продуктивное воспаление и/или фазу пролиферации воспалительного процесса, способствуют регенерации костной ткани, посредством усиления функциональной (секреторной) активности смешанной культуры стромальных клеток и нормальных лейкоцитов крови.

Заключение

Резюмируя вышесказанное: 3D-матриксы выступают в роли активационных агентов, опосредованно запускающих изменение цитокинового профиля микроокружения МСК и иммунокомпетентных клеток, что способствует инициации процессов активации, пролиферации и клеточной дифференцировки, необходимых для эффективной регенерации костной ткани.