In vitro  effects of recombinant IFNα2B on the content of antigen-presenting CD66b + CD16 + CD33 + HLA - DR +  subset of neutrophils in children with acute osteomyelitis

I. V. Nesterova; Нестерова И. В.; Galina A. Chudilova; Чудилова Галина Анатольевна; Yu. V. Teterin; Тетерин Ю. В.; E. A. Chicherev; Чичерев Е. А.; V. N. Chapurina; Чапурина В. Н.; V. A. Tarakanov; Тараканов В. А.; N. K. Barova; Барова Н. К.

doi:10.46235/1028-7221-13769-IVE

Эффекты влияния рекомбинантного IFNα2b на содержание антигенпрезентирующей субпопуляции CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA^-DR⁺ нейтрофильных гранулоцитов у детей с острым остеомиелитом в системе in vitro

Авторы: Нестерова И.В.¹^,2, Чудилова Г.А.¹, Тетерин Ю.В.¹, Чичерев Е.А.¹, Чапурина В.Н.¹, Тараканов В.А.¹, Барова Н.К.¹
Учреждения:
1. ФГБОУ ВО «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ
2. ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов имени Патриса Лумумбы»
Выпуск: Том 26, № 4 (2023)
Страницы: 689-696
Раздел: Школа Клинической Иммунологии "Сочи-2023"
Дата подачи: 09.07.2023
Дата принятия к публикации: 12.07.2023
Дата публикации: 22.09.2023
URL: https://rusimmun.ru/jour/article/view/13769
DOI: https://doi.org/10.46235/1028-7221-13769-IVE
ID: 13769

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Условием распространения инфекционного процесса в кости при остром остеомиелите (ООМ) является негативное влияние S. aureus, нарушение его элиминации из-за дисфункции иммунной системы (ИС), в частности нейтрофильных гранулоцитов (НГ). Коррекция дисфункций НГ при ООМ через модуляцию фенотипа субпопуляций НГ под влиянием иммунотропных веществ и цитокинов представляет интерес. Цель исследования – уточнить эффекты влияния рекомбинантного IFNá2b на количество и фенотип субпопуляций CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^-, CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA- DR⁺ и фагоцитарную функцию нейтрофильных гранулоцитов при остром остеомиелите у детей в системе in vitro.

Проведено исследование образцов периферической крови (ПК) детей 8-15 лет: с ООМ (n = 24) – группа исследования 1 (ГИ1), условно здоровых детей (n = 13) – группа сравнения (ГС). ПК детей с ООМ инкубировали с рекIFNá2b (50 МЕ/мкл, 60 мин, 37 °С) – группа исследования 1а (ГИ1а). До и после инкубации с рекIFNá2b определяли количество НГ субпопуляций CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA- DR⁺, CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^- и плотность экспрессии рецепторов по интенсивности флюоресценции (MFI)(FC 500, Beckman Coulter, США), фагоцитарную активность НГ по содержанию активно-фагоцитирующих НГ (%ФАН), объему захваченного бактериального патогена S. aureus (штамм 209) по показателям – фагоцитарное число (ФЧ), фагоцитарный индекс (ФИ); для оценки киллинговой активности – процент переваривания (%П), индекс переваривания (ИП).

При ООМ была выявлена субпопуляция, экспрессирующая HLA-DR-рецептор – СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺НГ, отсутствующая в ПК детей ГС, с праймированным фенотипом: увеличенной плотностью экспрессии активационных рецепторов CD16 и CD66b. Инкубация ПК при ООМ с рекIFNá2b приводила к увеличению доли субпопуляции CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺, активно фагоцитирующих НГ, и улучшению процессов переваривания.

В настоящем исследовании показано появление у детей с ООМ активированной субпопуляции «долгоживущих» НГ СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺ со свойствами АПК представляющими АГ Т-лимфоцитам, с сохраняющимися эффекторными свойствами. В экспериментальной системе in vitro продемонстрировано позитивное влияние рекIFNá2b, приводящее к увеличению количества НГ субпопуляции СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺ и восстановлению фагоцитарной функции НГ по отношению к S. aureus, что может быть использовано в будущем для разработки новых подходов к оптимизации комплексной терапии в послеоперационном периоде лечения ООМ, профилактики осложнений и возможности реставрации нарушений в иммунной системе.

Ключевые слова

дети, острый остеомиелит, нейтрофильные гранулоциты, антигенстимулирующая субпопуляция, рекомбинантный IFNα2b, фенотип

Полный текст

Исследование выполнено в рамках государственного задания Министерства здравоохранения Российской Федерации № 121031000071-4.

Введение

Остеомиелит (ОМ) – гнойно-некротический процесс, развивающийся в кости и костном мозге (КМ), под воздействием высоко специфического патогенна S. aureus. S. aureus способен внедряться, колонизировать и размножаться в костной ткани, продуцируя факторы вирулентности: деградация тканей хозяина, прилипание к компонентам внеклеточного матрикса, образование биопленок, для уклонения от уничтожения фагоцитами [1, 2]. В ответ на это вырабатываются хемокины CXCL8, IL-1β, CXCL2 и CCL3, которые привлекают и активируют большое количество НГ, создавая воспалительную микросреду, которая способствует образованию костно-резорбирующих остеокластов. Важнейшим условием распространения инфекционного процесса в кости является как негативное влияние самого S. aureus, так и нарушение его элиминации из-за дисфункции иммунной системы (ИС) и, в первую очередь, нейтрофильных гранулоцитов (НГ) [1, 15].

НГ являются фенотипически и функционально гетерогенными клетками, которые не только эффективно уничтожают патогены посредством фагоцитоза, продукции антимикробных пептидов, активных форм кислорода, секреции провоспалительных цитокинов и хемокинов, образования нейтрофильных экстрацеллюлярных сетей (NET), но и участвуют в перекрестных взаимодействиях с другими популяциями лейкоцитов, обеспечивая связь между врожденным и адаптивным иммунитетом [5, 10].

Показано, что НГ КМ, подвергшиеся воздействию GM-CSF, IL-3, TNFα, интерферонами (IFNγ) и бактериальными продуктами, экспрессируют на своей поверхности молекулы HLA класса II (MHC-II), дифференцируются в гибриды нейтрофил-DC, демонстрируя DC-подобный фенотип и антигенпрезентирующую функцию, сохраняя при этом свойства НГ [10, 13]. НГ могут влиять на адаптивный иммунный ответ, модулируя ответы CD4⁺Т-клеток через молекулы MHC-II [9]. Кроме того, рецептор CD66b, экспрессируемый исключительно на НГ, может функционировать как рецептор для галектина-3, который экспрессируется CD4⁺Т-клетками памяти, на низком уровне – наивными Т-клетками [9]. Взаимодействия рецептор-лиганд между Т-клетками памяти и НГ инициируют экспрессию MHC-II на мембране НГ, происходит дальнейшая амплификация лигирования MHC-TCR, в результате активируется большее количество Т-клеток, секретирующих цитокины, вызывающие увеличение экспрессии MHC-II на мембране НГ. Эта петля положительной обратной связи может играть центральную роль в индукции и поддержании презентации антигена НГ [9]. Установлено, что субпопуляции НГ, экспрессирующие HLA-DR, дополнительно экспрессируют ко-рецепторы CD80 и CD49d и характеризуются значительно увеличенной продолжительностью жизни. При этом «долгоживущие» НГ HLA- DR⁺ содержат больше миелопероксидазы (MPO), у них повышены фагоцитарный индекс и адгезия, их отличает ограниченная способность к хемотаксису и экзоцитозу первичных и вторичных гранул по сравнению с НГ-HLA-DR^-[4]. При ООМ у детей нами была определена антигенпрезентирующая субпопуляция НГ CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA- DR^+, экспрессирующая высокоспецифические маркеры НГ (CD66b, CD16, CD33) и позитивная по HLA- DR [11].

CD66b (CEACAM8), GPI-заякоренный гликопротеин суперсемейства Ig, экспрессируется исключительно на НГ со стадии промиелоцитов, – маркер активации НГ [7]. CD16 (FcγRIII) рецептор – маркер палочкоядерных и сегментированных НГ и их активации. При контакте с антигеном происходит быстрая транслокация рецептора из цитоплазматического депо НГ на его поверхность. Повышенная экспрессия мембранных CD16 на НГ свидетельствует об активации клетки, а сниженная экспрессия или полное отсутствие CD16 характеризует незрелость НГ и/ или «обратную дифференцировку» клетки, которая наблюдается при тяжелых бактериальных инфекциях или некрозах тканей [5]. CD33 (Siglec-3), принадлежит суперсемейству Ig, содержит два домена (IgV и IgC2) – маркер дифференцировки миелоидных клеток. Плотность экспрессии CD33 постепенно снижается от стадии миелобластов до сегментоядерных НГ. Внутриклеточная часть CD33 содержит ингибиторные мотивы на основе тирозина (ITIM), которые участвуют в ингибировании клеточной активности [8].

Следует подчеркнуть, что HLA-DR, который экспрессируется на миелобластах, отсутствует на зрелых НГ, но экспрессируется на поверхности тканевых НГ при хронических воспалительных состояниях [14]. Иммунный ответ на бактерии в костях имеет уникальные особенности по сравнению с другими инфицированными тканями и значительно модифицируется локальными факторами. Повышенная активация и функциональная способность НГ-HLA-DR⁺ предполагает наличие праймированного фенотипа [4], в связи с этим интерес представляет оценка возможности влияния на уровень экспрессии поверхностных рецепторов альтернативными инициирующими сигналами, в т. ч. на экспрессию HLA-DR НГ с целью возможной корректировки функций НГ.

Цель исследования – уточнить эффекты влия- ния рекомбинантного IFNα2b на количество и фе- нотип субпопуляций CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^-, CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺ и фагоцитарную функцию нейтрофильных гранулоцитов при остром остеомиелите у детей в системе in vitro.

Материалы и методы

Проведено исследование образцов периферической крови (ПК) 24 детей с острым (ООМ) 8-15 лет – группа исследования 1 (ГИ1). Группу сравнения (ГС) составили образцы ПК 13 здоровых детей в возрасте 8-15 лет.

Для оценки влияния рекомбинантного IFNα2b образцы ПК детей с ООМ инкубировали с рекIFNα2b (50 МЕ/мкл, 60 мин, 37 °С) – группа исследования 1а (ГИ1а).

До и после инкубации с рекIFNα2b определяли количество НГ субпопуляций CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺, CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^- и плотность экспрессии рецепторов по интенсивности флюоресценции (MFI) (FC 500, Beckman Coulter, США), фагоцитарную активность НГ по содержанию активно-фагоцитирующих НГ (%ФАН), объему захваченного бактериального патогена S. aureus (штамм 209) по показателям – фагоцитарное число (ФЧ), фагоцитарный индекс (ФИ); для оценки киллинговой активности – процент переваривания (%П), индекс переваривания (ИП).

У всех законных представителей пациентов было получено информированное согласие на участие в исследовании и забор крови согласно WMA Declaration of Helsinki – Ethical Principles for Medical Research Involving Human Subjects, 2013). Исследование одобрено локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава РФ.

Статистическая обработка данных проводилась компьютерной программой Microsoft Excel 2016 и StatPlus 2020. После оценки нормальности распределения лабораторных показателей использовали критерии Вилкоксона–Манна–Уитни. Представление результатов в виде медианы (верхний и нижний квартиль) – Me (Q_0,25-Q_0,75). Определение статистически значимых различий при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

Установлено, что в ПК условно-здоровых детей ГС регистрируется субпопуляция CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^- доля которой составляет 98,8 (98,0-100)%. Фенотип данной субпопуляции: низкая плотность экспрессии маркеров НГ по MFI CD66b – 4,6 (4,2-5,0), CD33 – 3,7 (3,3-4,6) и средние значения MFI CD16 – 81,45 (69,3-99,2), характеризует зрелые палочкоядерные и сегментоядерные НГ [3].

В ПК ГИ1 детей с ООМ показано снижение в 1,4 раза доли НГ субпопуляции СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^- до 71,2 (62,5-78,5)% относительно 98,8 (98,0-100)% в ГС (р < 0,05). При этом наблюдалась увеличение плотности экспрессии рецепторов по MFI CD16 до 114,5 (100,3- 139,0) против 81,45 (69,3-99,2) и CD66b до 6,2 (5,7-7,3) против 4,6 (4,2-5,0) (р_{1, 2} < 0,05) и неменяющемся MFI CD33- 2,9 (2,5-3,4) (р > 0,05) относительно ГС, дополнительная транслокация внутриклеточных резервных пулов CD16, CD66b рецепторов на мембрану демонстрирует активированный фенотип НГ, способных к дегрануляции, окислительный взрыву и фагоцитозу НГ [4] (табл. 1).

ТАБЛИЦА 1. СОДЕРЖАНИЕ И ФЕНОТИП СУБПОПУЛЯЦИЙ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^- И СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺ ПРИ ОСТРОМ ОСТЕОМИЕЛИТЕ ДО И ПОСЛЕ ИНКУБАЦИИ СИСТЕМЕ IN VITRO С РЕКОМБИНАНТНЫМ IFNα2b, Me (Q_0,25-Q_0,75)

TABLE 1. CONTENT AND PHENOTYPE OF CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^- AND CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺ NEUTROPHILIC GRANULOCYTE SUBSETS IN ACUTE OSTEOMYELITIS BEFORE AND AFTER IN VITRO INCUBATION WITH RECOMBINANT IFNα2b, Me (Q_0.25-Q_0.75)

Показатели

Indicators

Группа сравнения

Comparison group

n = 13

Группа исследования 1

до инкубации с рекIFNα2b

Study group 1

before incubation with recIFNα2b

n = 24

Группа исследования 1а

после инкубации с рекIFNα2b

Study group 1a

after incubation with recIFNα2b

n = 24

СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^-

НГ, %

NG, %

98,8

(98,0-100,0)

71,2*

(62,5-78,5)

49,0* ^

(41,4-61,1)

MFI CD66b

4,6

(4,2-5,0)

6,2

(5,7-7,3)

8,7* ^

(7,6-8,9)

MFI СD16

81,5

(69,3-99,2)

114,5

(100,3-139,0)

104,7

(74,3-119,9)

MFI CD33

3,7

(3,3-4,6)

2,9

(2,5-3,4)

2,5*

(2,1-2,5)

СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺

НГ, %

NG, %

29,9*

(18,4-37,6)

45,0* ^

(38,9-58,9)

MFI CD66b

8,20

(6,5-9,0)

8,7

(7,6-8,9)

MFI СD16

112,5

(100,3-137,0)

104,0

(73,7-120,8)

MFI CD33

3,5

(3,3-4,2)

3,5

(2,8-3,8)

HLA-DR

2,2

(1,8-4,0)

1,6

(1,5-2,0)

Примечание. * – значимые различия между показателями группы сравнения и группы исследования (ООМ), p < 0,05; ^ – значимые различия между показателями группы исследования до и после инкубации in vitro c рекIFNα2b, p < 0,05.

Note. *, significant differences between the indicators of the comparison group and the study group (AOM) p < 0.05; ^, significant differences between the parameters of the study group before and after in vitro incubation with recIFNα2b, p < 0.05.

В то же время при ООМ была выявлена субпопуляция экспрессирующая HLA-DR рецептор – СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺НГ, отсутствующая в ПК детей ГС, доля которой составила 29,9 (18,4-37,6)%. Плотность экспрессии была определена по MFI HLA-DR – 2,2 (1,8-4,0), MFI CD33 – 3,5 (3,3-4,2), при этом плотность экспрессии рецепторов CD66b и CD16 была сопоставима с показателями субпопуляции СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^-НГ (табл. 1).

Инкубация ПК ГИ1 при ООМ с рекIFNα2b приводила к перераспределению доли содержания субпопуляций CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^-, CD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺ (табл. 1).

Отмечалось снижение количества НГ субпопуляции СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR^- – 49,0 (41,4-61,1) % против 71,2 (52,5-80,5) % до инкубации (р > 0,05). При этом выявлено увеличение плотности экспрессии в 1,3 раза CD66b – 8,7 (7,6-8,9) против 6,23 (5,7-7,3) в ГИ1 (р < 0,05) и снижение MFI CD33 до 2,5 (2,1-2,5) против 2,9 (2,5-3,4) до инкубации (р < 0,05). Выявлено отсутствие эффектов влияния рекIFNα2b по отношению к MFI CD16 рецепторов (табл. 1).

При этом определялось более высокое количество НГ субпопуляции СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺ – 45,0 (38,9-58,9) % против 29,9 (18,4-37,6) %. (р < 0,05) в ГИ1 до инкубации с рекIFNα2b. С плотностью экспрессии рецепторов CD66b, CD16, CD33 и HLA-DR не отличающихся от значений ГИ1 до инкубации (р_1-4 > 0,05) (табл. 1).

При исследование фагоцитарной функции после инкубации с рекIFNα2b НГ в ГИ1а с ООМ в системе in vitro отмечено повышение %ФАГ до 76,0 (70,0-77,0) % против 51,0 (42,8-58,3) % (р < 0,05) в группе исследования и 54,7 (51,0-57,0) % в группе сравнения (р < 0,05). Также установлено увеличение киллинговой способности НГ с 41,9 (37,8-44,8) % в группе исследования с ООМ до 57,4 (53,6-61,1) % (р < 0,05), т. е. практически до показателей группы сравнения 64,5 (62,6-66,9) (р < 0,05) (табл. 2).

ТАБЛИЦА 2. ЭФФЕКТЫ ВЛИЯНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО IFNα2b НА ФАГОЦИТАРНУЮ ФУНКЦИЮ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ ПРИ ОСТРОМ ОСТЕОМИЕЛИТЕ IN VITRO, Me (Q_0,25-Q_0,75)

TABLE 2. EFFECTS OF RECOMBINANT IFNα2b ON THE PHAGOCYTIC FUNCTION OF NEUTROPHILIC GRANULOCYTES IN ACUTE OSTEOMYELITIS IN VITRO, Me (Q_0.25-Q_0.75)

Показатели

Indicators

Группа сравнения

Comparison group

n = 13

Группа исследования 1

до инкубации

с рекIFNα2b

Study group 1

before incubation with recIFNα2b

n = 24

Группа исследования 1а после инкубации

с рекIFNα2b

Study group 1a

after incubation with recIFNα2b

n = 24

%ФАН

%PhAN

54,7

(51,0-57,0)

51,0

(42,8-58,3)

76,0* ^

(70,0-77,0)

ФЧ

PhN

4,4

(3,8-4,7)

1,9*

(1,7-2,3)

2,7*

(2,2-3,5)

ФИ

PhI

1,9

(1,7-2,2)

1,0*

(0,9-1,5)

2,0

(1,5-2,7)

%П

64,5

(62,6-66,9)

41,9*

(37,8-44,8)

57,4* ^

(53,6-61,1)

ИП

1,7

(1,5-2,0)

0,5*

(0,3-0,7)

0,9*

(0,5-1,4)

Примечание. См. примечание к таблице 1.

Note. As for Table 1.

Таким образом, данные полученные в результате проведенного эксперимента in vitro продемонстрировали возможность позитивного влияния рекIFNα2b на функционирование НГ при ООМ. Установлено повышение содержания субпопуляции СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺ «долгоживущих» НГ, обладающих уникальным профилем DC-подобных клеток с антигенпрезентирующей функцией, которые, по литературным данным, способны презентировать суперантиген Staphylococcus enterotoxin E (SEE) Т-клеткам, связываясь с молекулами MHC II класса [6]. «Долгоживущие» НГ, обладающих уникальным профилем DC-подобных клеток, продуцируют значительные количества IL-8, IL-1β, рецепторного антагониста IL-1, при этом не только сохраняя, но и усиливая эффекторные свойства коротокоживущих НГ [3].

Результаты исследования также подтверждают гипотезу о способности НГ трансформироваться с «классического» фенотипа на фенотип «долгоживущих нейтрофилов» под влиянием от экстрацеллюлярного окружения клеток [3]. Детекция новой антигенпредставляющей субпопуляции НГ со смешанным нейтрофильно-дендритным фенотипом при остром остеомиелите у детей, возможно, связано с гнойно-инфекционным процессом, затрагивающим не только костные ткани, но и костный мозг. При этом следует отметить, что ранее появление молекул CD66b и HLA-DR на мембране НГ наблюдали только при хронических инфекционно-воспалительных заболеваниях (лейшманиоз) и аутоиммунных процессах (грануломатоз Вегенера и ревматоидный артрит) [4]. Выявленный нами эффект позитивного влияния IFNα2b в системе in vitro демонстрирует пластичность субпопуляций СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA- DR⁺ СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR: их трансформацию в сторону увеличения, субпопуляции с антигенпрезентирущими свойствами, что необходимо, с нашей точки зрения, для достижения полноценной регрессии гнойного воспалительного процесса.

Заключение

В экспериментальной системе in vitro, продемонстрировано позитивное влияние рекIFNα2b, приводящее к увеличению количества НГ субпопуляции СD66b⁺CD16⁺CD33⁺HLA-DR⁺ и восстановлению фагоцитарной функции НГ по отношению к S. aureus, что может быть использовано в будущем разработки новых подходов к оптимизации комплексной терапии в послеоперационном периоде лечения ООМ, профилактике осложнений и возможности реставрации нарушений в иммунной системе.

Об авторах

И. В. Нестерова

ФГБОУ ВО «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ; ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов имени Патриса Лумумбы»

Email: inesterova1@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5339-4504
SPIN-код: 4714-2488
Scopus Author ID: 56553330300

д.м.н., профессор, главный научный сотрудник отдела клинико-экспериментальной иммунологии и молекулярной биологии Центральной научно-исследовательской лаборатории ФГБОУ ВО «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ, г. Краснодар; профессор кафедры клинической иммунологии, аллергологии и адаптологии факультета непрерывного медицинского образования Медицинского института, ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов им. Патриса Лумумбы»

Россия, г. Краснодар; Москва