Экспрессия и продукция цитокинов у пациентов с тяжелым течением SARS-CoV-2

Полный текст

Введение

Заболевание COVID-19, вызванное SARS-CoV-2 инфицировало миллионы людей на планете и продолжает вызывать заболеваемость и смертность во всем мире. Многие респираторные вирусные инфекции протекают в легкой форме, включая заболевание COVID-19, однако у некоторых пациентов наблюдается тяжелое системное воспаление, повреждение тканей, острый респираторный дистресс-синдром, а также вызывается цитокиновый шторм. Долгое время считалось, что цитокины играют важную роль в иммунопатологии при вирусной инфекции. Быстрый и хорошо скоординированный врожденный иммунный ответ является первой линией защиты от вирусной инфекции. Однако нерегулируемые и чрезмерные иммунные реакции могут вызвать иммунное повреждение человеческого организма [3, 4]. В то время как продукция и высвобождение цитокинов у здоровых людей лежат в основе существенного баланса воспалительных и гомеостатических факторов, в случае заболевания COVID-19 часто происходит неконтролируемое перепроизводство цитокинов, имеющее фатальные последствия для организма. В связи с этим повсеместно обсуждаемым термином является феномен цитокинового шторма, который проявляется как гиперактивность клеток иммунной системы, продуцирующих провоспалительные цитокины, и может привести к тяжелым и/или фатальным случаям полиорганной недостаточности [1, 11]. Клеточные эксперименты показывают, что замедленное высвобождение цитокинов и хемокинов происходит в клетках респираторного эпителия, дендритных клетках (ДК) и макрофагах на ранней стадии инфекции SARS-CoV-2. Позже клетки секретируют низкие уровни противовирусных факторов интерферонов (IFN) и высокие уровни провоспалительных цитокинов таких, как интерлейкин IL-1β, IL- 6, IL-18 и TNFα.

Поскольку такой провопалительный цитокин, как TNFα, является одним из наиболее интенсивно изучаемых цитокинов и, как известно, играет решающую роль во множестве воспалительных заболеваний, TNFα выполняет ключевые функции в поддержании иммунной системы и физиологического гомеостаза. Однако способность TNFα форсировать активацию иммунных клеток может приводить к гипервоспалительной реакции и повреждению тканей при определенных обстоятельствах, как в случае возникновения цитокинового шторма при заболевании COVID-19 [7, 9].

Заболевание COVID-19 традиционно имеет двухфазное течение. Первая фаза характеризуется вирусным ответом, за которым следует фаза гипервоспалительной реакции. Гипервоспалительная реакция обычно возникает примерно через 8-15 дней после появления первых симптомов, когда вирусная репликация ослабевает [6, 10]. Данная гипервоспалительная фаза характеризуется избыточной продукцией воспалительных цитокинов и хемокинов в легких, что приводит к рекрутированию провоспалительных клеток, еще больше усиливая воспаление и вызывая повреждение легких. Известно, что инфламмасомы активируются во время вирусных инфекций в том числе и респираторных, и эти инфламмасомы участвуют в активации цитокинов семейства интерлейкинов IL-1, особенно IL-1β и IL-18, биологическая активность которых зависит от активности каспазы-1 [2]. Нарушенная активация инфламмасом может быть триггером гипервоспаления, наблюдаемого при тяжелом течении COVID-19.

Такая чрезмерная реакция провоспалительных цитокинов, опосредованных быстрым иммунным ответом, может привести к цитокиновому шторму, который, как известно, отвечает как за критическое состояния, так и за полиорганные повреждения и, следовательно, приводит к высокому риску смертности при заболевании COVID-19. Известно, что у пациентов, с чрезмерной гипервоспалительный реакцией и у них более вероятно развитие синдрома высвобождения цитокинов и острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС), который характеризуется сильной воспалительной реакцией в легочной ткани, отдышкой и даже после выздоровления значительно ухудшает качество жизни.

Поэтому цель данной работы изучение экспрессии генов IL-1β, IL-18 и TNFα, а также их продукцию на уровне слизистых оболочек верхних дыхательных путей у пациентов с тяжелым течением заболевания COVID-19.

Материалы и методы

В настоящее исследование были включены пациенты (n = 20), переболевшие тяжелой формой заболевания COVID-19. Контрольную группу составили (n = 10) условно здоровые пациенты, контактировавших с инфекцией SARS-CoV-2, но без подтвержденного анализа на SARS-CoV-2. В работе использовали биоматериал в виде соскобов слизистых оболочек ротоглотки. Забор материала производился цитощеточкой типа А («Юнона», Россия), и он транспортировался в лабораторию в пробирке на 1,5 мл в физиологическом растворе («Панеко», Россия) в закрытом пакете. Всем пациентам с новой коронавирусной инфекцией проводили комплексное клиническое обследование, включавшее компьютерную томографию (КТ) органов грудной клетки, пульсоксиметрию и лабораторные тесты на наличие РНК (антигена) SARS-CoV-2. Исследование проводилось при информированном согласии пациентов.

Из полученного биоматериала выделяли РНК методом сорбции на селикагеле с использованием коммерческого набора «РИБО-сорб» (Amplisense, Россия) в соответствии с протоколом проведения для данного набора. Проверка качества выделенной РНК для исследования экспрессии генов IL-1β, IL-18 и TNFα осуществлялась с помощью спектрофотометра Nanodrop 2000^® (Thermo Scientific, США). Реакцию обратной транскрипции и последующую ПЦР-РВ анализ проводили с помощью коммерческих наборов «Набор для обратной транскрипции ОТ-1» «Набор реагентов для проведения ПЦР-РВ в присутствии красителя SYBR Green I» («Синтол», Россия). Последовательность праймеров для генов IL-1β, IL-18 и TNFα подбирали с помощью программы Vector NTI, анализируя последовательность интересующих генов, полученную из GenBank.

Стандартизация результатов ПЦР-РВ проводилась по уровню экспрессии гена «домашнего хозяйства» β-актина. Обхват экспрессии гена был посчитан методом относительного анализа экспрессии гена с использованием метода ∆∆Ct.

Определение уровня цитокинов на уровне слизистых оболочек ротоглотки проводили с использованием флуоресцентного ридера MAGPIX компании Bio-Rad. Для измерения использовался набор реактивов Bio-Plex Pro Human Cytokine Screening Panel компании Bio-Rad. Анализ проводился строго по прилагаемой к набору методике. Полученные данные (концентрации пг/ мл) далее подвергались статистическому анализу. Статистическая обработка результатов проводилась с использованием программного обеспечения GraphPad ver. 8.

Результаты и обсуждение

Поскольку вирус SARS-CoV-2 инфицирует в первую очередь слизистый эпителий верхних дыхательный путей, то основная вирусная нагрузка приходится на эпителий слизистой оболочки ротоглотки.

Достоверно увеличивается в 2,7 × 10³ раза экспрессия провоспалительного цитокина IL- 1β на 30-й день тяжелого течения заболевания COVID-19 относительно группы условно здоровых лиц (рис. 1). Также нами было выявлено достоверное увеличение в 6,8 × 10² раза экспрессия IL-1β на 30-й день течения заболевания COVID-19 относительно группы лиц с тяжелым течением заболевания на 15-е сутки. Так же нами было выявлено незначительное увеличение уровня экспрессии IL-1β как в дебюте заболевания, так и на 15-е сутки от начала заболевания, однако достоверных отличий от группы условно здоровых лиц выявлено не было (рис. 2).

 

Рисунок 1. Экспрессионный профиль цитокинов IL 1β, IL-18 на уровне слизистой оболочки ротовой полости

Примечание. А – экспрессия IL-1β на уровне слизистой оболочки ротовой полости. По оси абсцисс – время и группы. По оси ординат – относительные единицы от числа копий β-актина. p ≤ 0,05 по тесту Манна–Уитни. Б – экспрессия IL-1β на уровне слизистой оболочки ротовой полости. По оси абсцисс время и группы. По оси ординат Относительные единицы от числа копий β-актина. * – p ≤ 0,05 по тесту Манна–Уитни; ** – 0,001 < p ≤ 0,05 по тесту Манна–Уитни; *** – p < 0,001 по тесту Манна–Уитни.

Figure 1. Expression profile of cytokines IL-1β, IL-18 at the level of the oral mucosa

Note. (A) Expression of IL-1β at the level of the oral mucosa. The abscissa shows time and groups. Y-axis relative, units of the number of copies of β-actin. p ≤ 0.05 according to the Mann–Whitney test. (B) Expression of IL-1β at the level of the oral mucosa. The abscissa shows time and groups. Y-axis Relative units of number of β-actin copies. *, p ≤ 0.05 according to the Mann–Whitney test; **, 0.001 < p ≤ 0.05 according to the Mann–Whitney test; ***, p < 0.001 according to the Mann–Whitney test;

 

Рисунок 2. Экспрессия TNFα на уровне слизистой оболочки ротовой полости

Примечание. По оси абсцисс – время и группы. По оси ординат – относительные единицы от числа копий β-актина. ** – 0,001 < p ≤ 0,05 по тесту Манна–Уитни.

Figure 2. TNFα expression at the level of the oral mucosa.

Note. The abscissa shows time and groups. Y-axis, relative units of the number of copies of β-actin. **, 0.001 < p ≤ 0.05 according to the Mann–Whitney test.

 

Что касается провосполительного цитокина IL-18, то нами было выявлено достоверное снижение уровня экспрессии в 1,3 × 10² раза у лиц в дебюте заболевания COVID-19 относительно группы условно здоровых лиц (рис. 1). Также нами выявлена тенденция к увеличению уровня экспрессии в последующие дни заболевания, в частности, тенденция к увеличению уровня экспрессии на 30-е сутки относительно 15 суток от начала заболевания, однако достоверных отличий не было выявлено. Касаемо продукции нами было выявлено снижение уровня продукции IL- 18 на уровне слизистой оболочки ротоглотки в дебюте заболевания относительно контрольной группы, однако достоверных отличий не было выявлено (рис. 3).

 

Рисунок 3. Продукция цитокинов IL-1β, IL-18, TNFα на уровне слизистой оболочки ротовой полости

Примечание. По оси абсцисс – группы и белок. По оси ординат – концентрации (пг/мл). Серым цветом – 1-й день заболевания COVID-19. Черным цветом – контрольная группа.

Figure 3. Production of cytokines IL-1β, IL-18, TNFα at the level of the oral mucosa

Note. The abscissa shows groups and proteins. Y-axis concentration (pg/mL). Gray color, 1 day of COVID-19 disease. Black color, control group.

 

Касаемо TNFα нами было выявлено достоверное увеличение уровня экспрессии в 9,2 раза у пациентов в дебюте заболевания относительно контрольной группы (рис. 2). Относительно продукции TNFα на уровне слизистой оболочки ротоглотки было выявлено увеличение в 1,89 раза в начале заболевания относительно условно здоровой группы лиц (рис. 3).

Поскольку, как было сказано ранее, заболевание COVID-19 имеет двухфазное течение, основная цитокиновая нагрузка происходит в фазу, когда вирус SARS-CoV-2 почти не реплицируется, т. е. на 8-15-е сутки. Такое повышение уровня экспрессии IL-1β на 30-е сутки с момента начала заболевания может объясняться тем, что S-белок вируса индуцирует повышенную экспрессию в моноцитах человека [5], однако уровень белка при этом остается низким в особенности на 1-е сутки от начала заболевания (рис. 2). Таким образом можно сделать вывод, что вирус запускает пиропотоз, но в течение 15-30 суток от начала заболевания, когда вирусная репликация уже минимальна. Этот факт, возможно, и приводит к серьезным последствиям, таким как: полиорганная недостаточность, респираторный дистресс-синдром, а также к длительному периоду восстановления («постковидный» синдом). Сниженный уровень экспрессии и продукции провоспалительных цитокинов IL-1β, IL-18 в дебюте заболевания c последующим увеличением уровня экспрессии на 15-30-е сутки свидетельствует о гипервоспалительной реакции врожденной иммунной системы в ответ на элиминацию вируса [8] IL-6, IL-8, IL-10 и sTNFR1 (soluble tumor necrosis factor receptor 1. Касаемо уровня экспрессии и продукции TNFα, то наши данные в полной мере согласуется с литературными источниками. Qing Ye, Bili Wang в своем исследовании показали также повышенные уровни продукции TNFα и привели корреляцию с тем, что такие высокие уровни TNFα способствуют возникновению острого респираторного дистресс-синдрома [11].

Благодарности

Авторы выражают благодарность центру коллективного пользования НИИВС им И.И. Мечникова. Исследование выполнено с использованием научного оборудования центра коллективного пользования «НИИВС им. И.И. Мечникова» – при финансовой поддержке проекта Российской Федерацией в лице Министерства образования и науки России, Соглашение № 075-15-2021-676 от 28.07.2021.

Авторы выражают благодарность сотрудникам, старшему врачу-терапевту Осипцову В.Н., а также начальнику 2-го терапевтического отделения Татевосову В.Р. ФГКУЗ «Главный военный клинический госпиталь войск национальной гвардии Российской Федерации» за предоставление материала исследования

Об авторах

Наталья Дмитриевна Абрамова

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»

Автор, ответственный за переписку.
Email: and960911@gmail.com

младший научный сотрудник лаборатории молекулярной иммунологии ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»

Россия, Москва

Е. А. Меремьянина

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»; ФГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования»

Email: ekaterina@meremianina.ru

к.м.н., научный сотрудник лаборатории молекулярной иммунологии ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»; старший преподаватель кафедры вирусологии ФГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования»

Россия, Москва; Москва

Н. О. Калюжная

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»

Email: nat_kalyuzhnaya@mail.ru

младший научный сотрудник лаборатории молекулярной иммунологии ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»

Россия, Москва

А. В. Поддубиков

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»

Email: poddubikov@yandex.ru

к.б.н., заведующий лабораторией микробиологии условно-патогенных бактерий, ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»

Россия, Москва

М. П. Костинов

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»; ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения РФ (Сеченовский университет)

Email: monolit.96@mail.ru

д.м.н., профессор, член-корр. РАН, заведующий лабораторией вакцинопрофилактики и иммунотерапии аллергических заболеваний, ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»; профессор кафедры эпидемиологии и современных технологий вакцинации ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения РФ (Сеченовский университет)

Россия, Москва; Москва

В. В. Греченко

ФГАОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения РФ

Email: grechenko_v@mail.ru

к.м.н., доцент кафедры иммунологии МБФ ФГАОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения РФ

Россия, Москва

О. А. Свитич

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»; ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения РФ (Сеченовский университет)

Email: svitichoa@yandex.ru

д.м.н., профессор, член-корр. РАН, директор ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»; профессор кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии имени академика А.А. Воробьева ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения РФ (Сеченовский университет)

Россия, Москва; Москва

Список литературы

Дополнительные файлы