Субпопуляционный состав цитотоксических Т-лимфоцитов периферической крови и спинномозговой жидкости при рассеянном склерозе

Полный текст

Работа выполнена в рамках плановой темы НИР ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины» FGWG-2022-0005 (рег. № 122020300186-5).

Введение

Рассеянный склероз – нейродегенеративное заболевание, при котором в организме пациента обнаруживаются аутореактивные Т-хелперы, которые способны мигрировать в нервную ткань через гемато-энцефалический барьер. На сегодняшний день рассматривается также вопрос об участии цитотоксических Т-лимфоцитов (Тцит) в развитии данного заболевания. Многочисленные исследования функциональных особенностей Тцит показали, что эти клетки, подобно Т-хелперам 17, способны продуцировать широкий спектр провоспалительных цитокинов, влияющих на проницаемость гемато-энцефалического барьера, что делает его проницаемым для иммунных клеток, циркулирующих в периферической крови [28]. С использованием молекулярно-биологических методов было показано, что у больных РС в периферической крови, спинно-мозговой жидкости (СМЖ) и в участках поражения нервной ткани обнаруживались CD3⁺CD8⁺ лимфоциты всего лишь нескольких клонов, выявленных на основании анализа последовательности CDR3 участка Т-клеточного рецептора (ТcR) [26]. Более того, такая узко специфическая олигоклональность клеток была характерна только для цитотоксических Т-лимфоцитов, тогда как популяция Т-хелперов во всех исследованных тканях была весьма гетерогенна с точки зрения строения TcR. Эти результаты подтверждаются тем, что большинство клонов CD3⁺CD8⁺ клеток, обнаруживаемых в составе очагов поражения нервной системы, обычно представлены на значительном уровне и в периферической крови больных [22].

Другим важнейшим фактором, свидетельствующим о существенной роли цитотоксических Т-лимфоцитов в патогенезе РС, являются результаты генетических исследований, указывающих на значимость некоторых аллельных форм молекул главного комплекса гистосовместимости I класса, распознавание которых связано с функциональной активностью именно CD3⁺CD8⁺ клеток. Показано, что вероятность развития РС резко возрастала при наличии у пациентов аллели HLA-A*0301, тогда как присутствие в геноме аллели HLA-A*0201 существенно снижала риски развития данной патологии [11]. Анализ гистохимического строения зон поражения нервной ткани выявил, что в составе периваскулярных лимфатических скоплений, встречающихся по периферии активных демиелинизирующих бляшек, относительное содержание CD8⁺Т-лимфоцитов в пятьдесят и более раз превосходит содержание Т-хелперов [12]. Хотя в настоящее время чаще указывается, что соотношение CD8/CD4 в рамках очагов оставляет в среднем 10:1 [18]. В зонах воспаления с демиелинизированными нервными волокнами отмечается накопление зрелых эффекторных CD8⁺Т-клеток, несущих в своей цитоплазме гранулы с гранзимом В, способным вызывать апоптоз в клетках-мишенях [18]. Накопление CD3⁺CD8⁺ лимфоцитов в составе очагов поражения нервной ткани тесно связано с уровнем демиелинизации поврежденных аксонов [7].

Направленная миграция в нервную ткань обеспечивается наличием на поверхности лимфоцитов набора молекул-адрессинов и при этом отсутствием молекул «хоуминга» в лимфоидную ткань. Такое сочетание характерно для прошедших антиген-зависимую дифференцировку зрелых Т-клеток с эффекторным потенциалом. Цитотоксические Т-лимфоциты, обладающие комплексом описанных свойств, способны синтезировать эффекторные цитокины и разрушать клетки-мишени за счет секреции перфоринов и гранзимов, что позволяет рассматривать их в качестве ключевых игроков в патогенезе РС и других заболеваний. В связи с вышеизложенным целью данного исследования стал анализ субпопуляционного состава и поиск взаимосвязей между разными субпопуляциями Тцит в периферической крови и СМЖ пациентов с РС на стадии обострения и в ремиссии.

Материалы и методы

Исследования проводили на образцах венозной крови и спинно-мозговой жидкости 52 пациентов с рецидивирующе-ремиттирующей формой рассеянного склероза, диагностированного на основании критериев МакДональда [2]. Для сравнения использовали образцы периферической крови 51 условно здорового добровольца. Общий пул пациентов разделялся на две группы: 20 больных находились в ремиссии, а у 32 наблюдалось клиническое обострение, проявляющееся в появлении новой или усугублении имеющейся очаговой неврологической симптоматики, сохранявшейся не менее 48 часов при отсутствии лихорадки и других возможных причин псевдообострения. Все группы имели сходный половой и возрастной состав.

Пациенты никогда не проходили лечение препаратами, изменяющими течение РС, а также не получали системные кортикостероидные препараты на протяжении трех месяцев, предшествующих исследованию. Для всех больных производилась бальная оценка степени поражения функциональных систем, и рассчитывался балл по расширенной шкале инвалидизации EDSS [16]. При определении обострения не учитывались результаты магнитно-резонансно томографического исследования.

Все пациенты с рассеянным склерозом подписывали информированное согласие на участие в исследованиях в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2000 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. № 266. Исследование одобрено Комиссией по этике ФГБУН «Институт мозга человека им. Н.П. Бехтеревой» РАН 23 октября 2014 года.

Образцы крови получали пункцией периферической вены, а СМЖ – люмбальной пункцией. Забор образцов производился в вакуумные пробирки с K₃ЭДТА. Анализ проводился в тот же день. При подготовке образцов учитывали рекомендации производителей реагентов. Окраска образцов производилась моноклональными антителами, конъюгированными с флуорохромами, производства Beckman Coulter, США. Для образцов крови использовали следующую комбинацию: CD62L-ECD (cat. N IM2713U), CD3-АРС (cat. N IM2467), CD8-АРС-AF700 (cat. N A66332), CD45RA-АРС-AF750 (cat. N A86050), CD4-PacBlue (cat. N A82789) и CD45-Krome Orange (cat. N A96416). Для лизиса эритроцитов применяли безотмывочную технологию на базе раствора VersaLyse (cat. N A09777, Beckman Coulter, США) с добавлением IOTest 3 Fixative Solution (cat. N A07800, Beckman Coulter, США) в соотношении 975:25 мкл. Комбинация антител для образцов СМЖ: CD45RА-FITC (cat. N 6603117), CD56-РЕ (cat. N A07788), CD62L-ECD (cat. N IM2713U), CD8-PC5.5 (cat. N B21205), CD4-РС7 (cat. N 737660), CD3-АРС (cat. N IM2467), CD45-KrO (cat. N A96416).

Пробоподготовка СМЖ включала в себя отмывку избытком забуференного фосфатами физиологического раствора (ЗФР) с рН 7,2-7,4 (центрифугирование при 330 g 7 минут) непосредственно после забора образца, с последующей окраской антителами в течении 15 минут. После окраски к суспензии клеток добавляли 200 мкл 2%-ного раствора нейтрального параформальдегида (cat. N HT5011, Sigma-Aldrich, США) в ЗФР и сразу же проводили анализ на проточном цитофлюориметре Navios™ (Beckman Coulter, США).

Алгоритм выделения основных популяций CD8⁺Т-лимфоцитов периферической крови был подробно описан в 2015 году в работе [2], а анализ образцов СМЖ проводили с использованием тактики «гейтирования», приведенной на рисунке 1. Стадии дифференцировки Тцит и соответствующие им субпопуляции выделялись на основании уровня экспрессии CD45RA и CD62L. Доля каждой субпопуляции определялась в рамках общей популяции CD3⁺Т-лимфоцитов.

 

Рисунок 1. Алгоритмы выявления основных субпопуляций цитотоксических Т-лимфоцитов периферической крови (верхний ряд гистограмм) и спинно-мозговой жидкости (нижний ряд гистограмм) при помощи многоцветной проточной цитометрии

Примечание. Слева направо: гистограммы а: по оси абсцисс – интегральный сигнал прямого светорассеяния; по оси ординат – пиковый сигнал прямого светорассеяния; в области «sgl cells» находятся не слипшиеся лимфоциты, на гистограмме отображены все проанализированные клетки. Гистограммы б: по оси абсцисс – уровень экспрессии CD45; по оси ординат – боковое светорассеяние (SS), характеризующее структуру цитоплазмы клеток; в области «CD45⁺⁺⁺» находятся клетки с высокой экспрессией CD45 и низкими значениями бокового светорассеяния, показаны только одиночные клетки из гистограммы а. Гистограммы в: по оси абсцисс – боковое светорассеяние (SS); по оси ординат – прямое светорассеяние (FS), характеризующее размер клеток; в области «LY» находятся клетки соответствующие по своим размерам и структуре популяции лимфоцитов периферической крови. Гистограммы г: по оси абсцисс – уровень экспрессии CD3, по оси ординат – количество проанализированных клеток; а области «CD3⁺» находятся Т-лимфоциты. Гистограммы д: по оси абсцисс – уровень экспрессии CD8, по оси ординат – уровень экспрессии CD4; в области «Tcyt» располагаются цитотоксчиеских Т-лимфоциты с фенотипом CD3⁺CD8⁺. Гистограммы е: по оси абсцисс – уровень экспрессии CD62L, по оси ординат – уровень экспрессии CD45RA; в областях «naïve», «СМ», «ЕМ» и «TEMRA» располагаются «наивные», клетки центральной и эффекторной памяти, а также «терминально-дифференцированные» CD45RA-позитивные цитотоксические Т-лимфоциты соответственно.

Figure 1. Gating strategy of flow cytometric analysis of main peripheral blood (upper row of histograms) and liquor (lower row of histograms) CD8⁺ T cell subsets

Note. From left to right: Histograms a: along the х-axis – the integral signal of forward light scattering; along the y-axis, the peak forward scatter signal; in the “sgl cells” area there are non-agglutinated lymphocytes, the histogram shows all the analyzed cells. Histograms б: x-axis – CD45 expression level; along the y-axis – side scattering (SS), which characterizes the structure of the cell cytoplasm; in the “CD45⁺⁺⁺” region there are cells with high expression of CD45 and low values of side scatter, only single cells from histogram a are shown. Histograms в: along the abscissa axis – side light scattering (SS); along the y-axis – forward scattering (FS), which characterizes the cell size; in the “LY” area there are cells corresponding in size and structure to the population of peripheral blood lymphocytes. Histograms г: on the x-axis there is CD3 expression level; on the y-axis – number of analyzed cells; and “CD3⁺” areas are T lymphocytes. Histograms д: x-axis – CD8 expression level; y-axis – CD4 expression level; in the area of “Tcyt” are cytotoxic T lymphocytes with the phenotype CD3⁺CD8⁺. Histograms e: abscissa – CD62L expression level; ordinate – CD45RA expression level; the naïve, CM, EM, and TEMRA regions contain naïve, central and effector memory cells, as well as terminally differentiated CD45RA-positive cytotoxic T lymphocytes, respectively.

 

Полученные с цитофлуориметра данные обрабатывали при помощи программного обеспечения Navios Software v.1.2 и Kaluza™ v.1.2 (Beckman Coulter, США). Статистическую обработку осуществляли с использованием ПО Statistica 8.0 (StatSoft, США) и GraphPad Prism 4.00 for Windows (GraphPad Prism Software Inc., США). Результаты приводили в виде медианы (Ме) и интерквартильного размаха (Q_0,25-Q_0,75). Сравнение относительного содержания субпопуляций проводили при помощи критерия Вилкоксона для парных выборок, а корреляционный анализ – с использованием коэффициента ранговой корреляции r Спирмена.

Результаты

Популяционный состав лимфоцитов периферической крови оценивался нами ранее, результаты приведены в работе [3]. Наблюдается достоверное уменьшение концентрации и доли Т-лимфоцитов у пациентов в период обострения. На стадии ремиссии абсолютное и относительное число Тцит ниже, чем в контроле.

Популяционный состав лимфоцитов спинномозговой жидкости

Лимфоциты, выявлявшиеся в составе СМЖ больных РС, были представлены в основном Т-клетками с фенотипом CD3⁺, относительное содержание которых в период ремиссии находилось в пределах 94,56% (91,89-95,70), тогда как на фоне обострения составляло 93,71% (91,64-95,32). В период обострения отмечена обратная зависимость между уровнем этих клеток в СМЖ и баллом по шкале EDSS (r = -0,504 при р < 0,001). Анализ основных популяций CD3⁺ лимфоцитов СМЖ показал, что при обострении РС наблюдается снижение относительного содержания CD3⁺CD4⁺ лимфоцитов до 64,16% (55,41-68,91) при сравнении с образцами от пациентов в период ремиссии (70,67% (63,82-72,41) при р = 0,016). Уровень цитотоксических Т-клеток при обострении незначительно увеличивался (23,81% (19,33-28,43) против 19,09% (16,77-23,06) при р = 0,100).

Субпопуляционный состав цитотоксических Т-лимфоцитов периферической крови

При сравнении разных субпопуляций Тцит в периферической крови больных РС с группой контроля основные изменения касались исключительно популяции ЕМ. Так, при ремиссии РС относительное содержание ЕМ Тцит снижалось до 8,70% (6,51-11,63), что было достоверно (р = 0,005) ниже значений контрольной группы – 12,18% (10,38-15,24), хотя и не отличалось (р = 0,114) от больных в период обострения – 11,31% (8,28-13,90). Исследование содержания Тцит с фенотипом CD45RA^-CD62L^- периферической крови показало, что абсолютное число таких клеток как при обострении (118 (80-184) кл/ мкл), так и на фоне ремиссии (104 (85-142) кл/ мкл), значительно ниже (р = 0,017 и р = 0,003, соответственно) контрольных значений (166 (124-213) кл/мкл).

Субпопуляционный состав цитотоксических Т-лимфоцитов СМЖ

Анализ образцов СМЖ выявил, что при рецидиве РС имеет место увеличение (р = 0,027) уровня ЕМ Тцит до 8,16% (6,40-11,40), тогда как в период ремиссии лимфоциты данной популяции составляли 6,49% (4,51-8,39) от общего числа CD3⁺ клеток СМЖ. Кроме того, именно у больных с обострением РС наблюдалась положительная корреляционная связь между увеличением доли этих клеток в СМЖ и баллом EDSS (r = 0,366 при р = 0,047), чего не было отмечено для больных в период ремиссии (r = 0,018 при р = 0,945). Таким образом, при рецидиве РС наблюдается увеличение уровня ЕМ Тцит в СМЖ при сравнении с показателями периферической крови, а также СМЖ больных в период ремиссии.

Взаимосвязь между разными субпопуляциями Тцит различной локализации

Как видно из рисунка 2, снижение уровня «наивных» Тцит в периферической крови сопровождалось уменьшением данной популяции клеток в составе СМЖ больных РС как в период обострения, так и в период ремиссии. Вне зависимости от стадии заболевания в периферической крови содержание «наивных» клеток всегда превосходило показатели СМЖ. Более того, при анализе образцов периферической крови, полученных от больных РС в период обострения, были выявлены обратные зависимости между баллами шкалы EDSS и абсолютным (r = -0,430 при р = 0,014) и относительным (r = -0,502 при р = 0,003) содержанием CD45RA⁺CD62L⁺Тцит. Клетки центральной памяти в образцах СМЖ превосходили значения, полученные для периферической крови. Увеличение относительного содержания CD45RA^-CD62L^-Тцит в периферической крови сопровождалось их изменением в СМЖ (р = 0,014), тогда как на стадии ремиссии подобной динамики не отмечалось.

 

Рисунок 2. Анализ относительного содержания различных популяций цитотоксических Т-лимфоцитов в периферической крови и спинно-мозговой жидкости больных рассеянным склерозом в период ремиссии (верхний ряд) и обострения (нижний ряд)

Примечание. ПК – относительное содержание клеток в периферической крови; СМЖ – относительное содержание клеток в спинно-мозговой жидкости. Результаты приведены в виде % клеток каждой из популяций Тцит в рамках общей популяции CD3⁺ клеток. Статистическая значимость зависимости между выборками оценивали при помощи парного теста Вилкоксона.

Figure 2. Frequencies of main maturation CD8⁺T cell subsets in peripheral blood and liquor from patients with multiply sclerosis during relapse (n = 32, upper row) and remission (n = 20, lower row) periods of disease

Note. PB and CSF represents the relative numbers (% of CD8⁺T cell subsets within total CD3⁺T cell population) of main maturation subsets of CD8⁺T cell in peripheral blood and liquor, respectively. Significant differences were determined by the Wilcoxon matched pairs test.

 

Результаты корреляционного анализа субпопуляционного состава Тцит периферической крови и СМЖ приведенны для больных в период обострения в таблице 1, а для больных в период ремиссии – в таблице 2.

 

ТАБЛИЦА 1. ВЗАИМОСВЯЗЬ МЕЖДУ ОТНОСИТЕЛЬНЫМ (% ОТ CD3⁺ КЛЕТОК) И АБСОЛЮТНЫМ (#, КОЛ-ВО КЛЕТОК В 1 мкл) СОДЕРЖАНИЕМ СУБПОПУЛЯЦИЙ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ T-ЛИМФОЦИТОВ ПЕPИФЕPИЧЕСКОЙ КPОВИ И АНАЛОГИЧНЫМИ ПОПУЛЯЦИЯМИ CD3⁺CD8⁺ КЛЕТОК СПИННО-МОЗГОВОЙ ЖИДКОСТИ У БОЛЬНЫХ РС В ПЕРИОД ОБОСТРЕНИЯ (n = 32)

TABLE 1. CORRELATION BETWEEN RELATIVE (% OF CD3⁺ CELLS) AND ABSOLUTE (#, NUMBER OF CELLS PER 1 µL) CONTENT OF SUBPOPULATIONS OF CYTOTOXIC T LYMPHOCYTES IN PERIPHERAL BLOOD AND SIMILAR POPULATIONS OF CD3⁺CD8⁺ CELLS IN CEREBROSPINAL FLUID IN MS PATIENTS DURING EXACERBATION (n = 32)

		«Наивные» Тцит Naïve Tcyt		CM Тцит CM Tcyt		EM Тцит EM Tcyt		TEMRA Тцит TEMRA Tcyt
		%	#	%	#	%	#	%	#
«Наивные» Тцит, % Naïve Tcyt, %	r	0,456	0,554	0,370	0,441	-0,078	0,237	0,361	0,417
	p	0,011	0,001	0,044	0,015	0,683	0,207	0,050	0,022
CM Тцит, % CM Tcyt, %	r	0,248	0,375	0,627	0,645	0,315	0,551	-0,184	0,000
	p	0,187	0,041	< 0,001	< 0,001	0,090	0,002	0,330	1,000
EM Тцит, % EM Tcyt, %	r	-0,498	-0,524	0,033	-0,095	0,566	0,261	-0,226	-0,283
	p	0,005	0,003	0,864	0,618	0,001	0,164	0,229	0,129
TEMRA Тцит, % TEMRA Tcyt,%	r	-0,071	0,045	-0,027	0,081	0,030	0,265	0,671	0,664
	p	0,711	0,813	0,886	0,670	0,875	0,158	< 0,001	< 0,001

Примечание. По горизонтали указаны популяции Тцит, содержащиеся в периферической крови, по вертикали – популяции Тцит, содержащиеся в СМЖ; жирным шрифтом выделены доcтовеpные корpеляционные зависимости в соответствии с коэффициентом pанговой корpеляции r Cпирмена.

Note. Horizontally indicates populations of Tcyt contained in peripheral blood, vertically – populations of Tcyt contained in CSF; bold type indicates reliable correlation dependences in accordance with the Spearman’s rank correlation coefficient r.

 

ТАБЛИЦА 2. ВЗАИМОСВЯЗЬ МЕЖДУ ОТНОСИТЕЛЬНЫМ (% ОТ CD3⁺ КЛЕТОК) И АБСОЛЮТНЫМ (#, КОЛ-ВО КЛЕТОК В 1 мкл) СОДЕРЖАНИЕМ СУБПОПУЛЯЦИЙ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ T-ЛИМФОЦИТОВ ПЕPИФЕPИЧЕСКОЙ КPОВИ И АНАЛОГИЧНЫМИ ПОПУЛЯЦИЯМИ CD3⁺CD8⁺ КЛЕТОК СПИННО-МОЗГОВОЙ ЖИДКОСТИ У БОЛЬНЫХ РС В ПЕРИОД РЕМИССИИ (n = 20)

TABLE 2. CORRELATION BETWEEN RELATIVE (% OF CD3⁺ CELLS) AND ABSOLUTE (#, NUMBER OF CELLS PER 1 µL) NUMBER OF SUBPOPULATIONS OF CYTOTOXIC T LYMPHOCYTES IN PERIPHERAL BLOOD AND SIMILAR POPULATIONS OF CD3⁺CD8⁺ CELLS IN CEREBROSPINAL FLUID IN MS PATIENTS DURING REMISSION (n = 20)

		«Наивные» Тцит Naïve Tcyt		CM Тцит CM Tcyt		EM Тцит EM Tcyt		TEMRA Тцит TEMRA Tcyt
		%	#	%	#	%	#	%	#
«Наивные» Тцит, % Naïve Tcyt, %	r	0,380	0,463	-0,078	0,120	-0,126	-0,071	0,244	0,349
	p	0,098	0,040	0,743	0,613	0,596	0,767	0,301	0,132
CM Тцит, % CM Tcyt, %	r	-0,056	0,053	0,529	0,477	0,039	0,119	0,212	0,153
	p	0,816	0,826	0,016	0,034	0,870	0,618	0,369	0,519
EM Тцит, % EM Tcyt, %	r	-0,140	-0,250	-0,194	-0,328	0,110	-0,107	0,340	0,155
	p	0,556	0,289	0,413	0,158	0,645	0,654	0,143	0,514
TEMRA Тцит, % TEMRA Tcyt,%	r	0,206	0,053	0,051	-0,232	-0,235	-0,515	0,662	0,350
	p	0,383	0,823	0,830	0,324	0,319	0,020	0,001	0,131

Примечание. См. примечание к таблице 1.

Note. As for table 1.

 

Обсуждение

Ранее мы уже публиковали данные о том, что при обострении РС в периферической крови снижается общее количество и доля CD3⁺ лимфоцитов по сравнению со здоровыми добровольцами и пациентами в ремиссии. В то время как в стадии ремиссии наблюдается достоверное уменьшение абсолютного и относительного числа цитотоксических Т-лимфоцитов по сравнению с контролем [3]. Кроме того наблюдалась обратная взаимосвязь доли Тцит в популяции лимфоцитов и балла EDSS. Сходные изменения были отмечены и другими группами исследователей. Так, у больных РС в периферической крови повышалось соотношение CD4/CD8 лимфоцитов, главным образом, за счет снижения относительного содержание цитотоксических Т-лимфоцитов [9]. Данное обстоятельство было связано с уменьшением в циркуляции уровня CD28^-CD8⁺ лимфоцитов, тогда как относительное содержание CD28⁺CD8⁺ клеток достоверно не различалось между сравниваемыми группами. В рамках другого исследования также отмечено снижение общего пула циркулирующих CD3⁺CD8⁺ лимфоцитов за счет уменьшения уровней клеток эффекторной памяти (ЕМ) и эффекторных клеток (TEMRA) в периферической крови [23].

В СМЖ больных РС большая часть лимфоцитов была представлена Т-клетками. При этом наблюдалось незначительное увеличение Тцит при обострении, что в сочетании с достоверным снижением процента CD4⁺Т-лимфоцитов приводило к отмеченному нами ранее значимому уменьшению соотношения CD4/CD8-лимфоцитов [4]. Данные литературы также указывают на то, что основным типом циркулирующих лимфоцитов в СМЖ являются Т-клетки, составляющие по некоторым оценкам около 97% [27] или 95% [13] от общего числа лимфоцитов. Причем подавляющее большинство клеток являются Т-хелперами, на которых приходится около 70% [10] или 67% [13] лимфоцитов. При РС ранее отмечалось увеличение относительного содержания Т-хелперов в СМЖ при сравнении с условно здоровыми добровольцами [25]. Более того, сравнение различных нейровоспалительных заболеваний выявило, что увеличение соотношения CD4⁺/CD8⁺ характерно именно для РС [20], тогда как результаты собственных исследований указывают на то, что данный показатель значимо изменяется в периоды ремиссии и обострения РС.

Клетки центральной памяти в образцах СМЖ превосходили значения, полученные для периферической крови, что подтверждается данными других исследователей [19]. Считается, что именно на этой стадии дифференцировки Т-лимфоциты способны направленно мигрировать в нервную ткань за счет взаимодействия поверхностного Р-селектина с ICAM-1 венул хориоидального сплетения и субарахноидального пространства [15]. В рамках другого исследования было показано, что именно цитотоксические Т-лимфоциты больных с активным рецидивирующим РС несли на своей поверхности высокий уровень PSGL-1 при сравнении с аналогичной популяцией Т-лимфоцитов периферической крови условно здоровых доноров. Более того, именно CD3⁺CD8⁺ клетки обладали повышенной по сравнению с Т-хелперами способностью к миграции через активированные венулы мозговых оболочек в условиях in vitro [5].

Следует также отметить, что при сравнении разных субпопуляций Тцит в периферической крови больных РС с группой контроля основные изменения касались исключительно популяции ЕМ. Принципиальным отличием ЕМ клеток от центральной памяти (СМ) является выраженная способность к продукции эффекторных цитокинов и проявлению цитолитической активности в отношении клеток-мишеней [1]. Более того, именно на этой популяции клеток возрастает экспрессия молекул «хоуминга» в воспаленные ткани. Так, значительная часть цитотоксических Т-лимфоцитов, обнаруживаемых в составе нервной ткани, не экспрессировали CCR7 и CD62L, но несли на своей поверхности á4-интегрин [14]. Ключевую роль в селективном проникновение клеток эффекторной памяти в пределы ЦНС играли эндотелиальные клетки сосудов гематоэнцефалического барьера, причем привлекались именно CD3⁺CD8⁺ лимфоциты, способные к синтезу и секреции IFNã и IL-17. Другой важнейшей молекулой, определяющей миграцию CD3⁺CD8⁺ лимфоцитов периферической крови в пределы нервной ткани, является MCAM [17]. Уровень MCAM⁺ цитотоксических Т-лимфоцитов, способных синтезировать провоспалительные цитокины: IL-17, IFNã, GM-CSF и TNF, а также индуцировать апоптоз олигодендроцитов в условиях in vitro, у больных РС повышался во время рецидива заболевания.

Отдельно следует остановиться на результатах корреляционного анализа субпопуляционного состава Тцит периферической крови и СМЖ. Как видно из приведенных результатов, при обострении РС, как правило, наблюдается положительная взаимосвязь между относительным содержанием отдельных субпопуляций Тцит в СМЖ и процентным содержанием, а также концентрацией аналогичных популяций Т-лимфоцитов в периферической крови. Обратная зависимость между уровнем ЕМ Тцит, циркулирующими в СМЖ, и «наивными» клетками периферической крови может объясняться тесной связью между этими двумя популяциями Тцит и клиническими проявлениями РС (в баллах по шкале EDSS), как это было обнаружено нами.

По-видимому, обострение РС, ассоциированное с нарушением целостности гемато-энцефалического барьера и сопровождающееся направленной миграцией Т-клеток из периферических лимфоидных органов в нервную ткань, сопровождается сонаправленными изменениями субпопуляционного состава Тцит периферической крови и СМЖ (табл. 1). Последнее обстоятельство требует дальнейших детальных исследований, так как поможет определить роль цитотоксических Т-клеток в патогенезе РС. С одной стороны, Тцит за счет продукции провоспалительных цитокинов (в первую очередь, IL-17) и запуска апоптоза в клетках нервной ткани способствуют развитию данной патологии. Увеличение относительного содержания IL-17-продуцирующих Тцит обнаружено как в составе очагов воспаления, так и в периферической крови больных РС [24, 29]. Эти клетки также обнаруживаются в составе активных очагов поражения нервной ткани при помощи гистологических методов исследования [28]. С другой стороны, некоторыми исследователями отмечается способность Тцит ограничивать воспалительные реакции, протекающие в нервной ткани за счет индукции апоптоза в активированных Т-хелперах, распознающих эпитопы основного белка миелина (MBP, от англ. myelin basic protein) и гликопротеина олигодендроцитов миелина (MOG, от англ. myelin oligodendrocyte glycoprotein) при совместном культивировании [8]. Более того, в ходе экспериментов in vitro выявлена способность MOG1-специфических Тцит ингибировать пролиферацию MOG1-специфических Т-хелперов в условиях in vitro [6].

Заключение

Основываясь на приведенных выше результатах и данных литературы, можно утверждать, что у больных рассеянным склерозом цитотоксические Т-лимфоциты могут мигрировать из кровотока в ЦНС. Данное обстоятельство позволяет рассматривать эти клетки как возможные маркеры развития заболевания, а их дальнейшее исследование даст возможность лучше понять механизмы патогенеза рассеянного склероза.

Об авторах

Мария Константиновна Серебрякова

ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»

Автор, ответственный за переписку.
Email: m-serebryakova@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2596-4220

научный сотрудник лаборатории клеточной иммунологии, отдел иммунологии ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург, Россия

Россия, Санкт-Петербург

Александр Геннадьевич Ильвес

ФГБУН «Институт мозга человека имени Н.П. Бехтеревой» Российской академии наук

Email: ailves@hotmail.com

к.м.н., старший научный сотрудник лаборатории направленной внутримозговой доставки препаратов ФГБУН «Институт мозга человека имени Н.П. Бехтеревой» Российской академии наук, Санкт-Петербург, Россия

Россия, Санкт-Петербург

Валерий Михайлович Лебедев

ФГБУН «Институт мозга человека имени Н.П. Бехтеревой» Российской академии наук

Email: lebedevvaleriy@bk.ru

младший научный сотрудник лаборатории направленной внутримозговой доставки препаратов ФГБУН «Институт мозга человека имени Н.П. Бехтеревой» Российской академии наук, Санкт-Петербург, Россия

Россия, Санкт-Петербург

Ольга Михайловна Новоселова

ФГБУН «Институт мозга человека имени Н.П. Бехтеревой» Российской академии наук

Email: dr.novoselova@gmail.com

младший научный сотрудник лаборатории направленной внутримозговой доставки препаратов ФГБУН «Институт мозга человека имени Н.П. Бехтеревой» Российской академии наук, Санкт-Петербург, Россия

Россия, Санкт-Петербург

Лидия Николаевна Прахова

ФГБУН «Институт мозга человека имени Н.П. Бехтеревой» Российской академии наук

Email: l.n.prakhova@hotmail.com

д.м.н., заведующая лабораторией направленной внутримозговой доставки препаратов ФГБУН «Институт мозга человека имени Н.П. Бехтеревой» Российской академии наук, Санкт-Петербург, Россия

Россия, Санкт-Петербург

Игорь Владимирович Кудрявцев

ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»; ФГАОУ ВО «Дальневосточный федеральный университет»; ФГБОУ ВО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения РФ

Email: igorek1981@yandex.ru

к.б.н., заведующий лабораторией клеточной иммунологии, отдел иммунологии ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург; старший научный сотрудник ФГАОУ ВО «Дальневосточный федеральный университет», г. Владивосток; доцент кафедры иммунологии ФГБОУ ВО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения РФ, Санкт-Петербург, Россия

Россия, Санкт-Петербург; г. Владивосток; Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы