Особенности экспрессии ингибиторных рецепторов PD-1 и TIGIT на CD4+ и CD8+Т-лимфоцитах различной степени зрелости

Полный текст

Введение

Центральная роль в адаптивном иммунном ответе принадлежит Т-лимфоцитам. Эти клетки представляют собой гетерогенную популяцию, включающую CD4⁺Т-хелперы и цитотоксические CD8⁺Т-лимфоциты. И те, и другие содержат клетки различной степени зрелости: наивные лимфоциты, клетки центральной и эффекторной памяти, терминально-дифференцированные эффекторы. Субпопуляции Т-клеток обладают разным спектром эффекторных функций – от продукции цитокинов до уничтожения инфицированных клеток, – что позволяет им обеспечивать защиту организма от внутриклеточных и внеклеточных патогенов [8].

Эффекторные действия Т-лимфоцитов могут быть разрушительны для здоровых тканей организма, поэтому функции Т-клеток, как правило, строго регулируются. Одним из механизмов контроля выступают ингибиторные рецепторы – группа молекул (PD-1, TIGIT, Lag-3, Tim- 3, CTLA-4, CD160, LAIR1 и др.), способных подавлять или замедлять биохимические реакции и сигнальные пути, связанные с активацией, пролиферацией и эффекторными функциями Т-клеток [10, 11]. Среди супрессорных молекул наиболее изучен рецептор программируемой клеточной гибели 1 (англ. Programmed death-1 – PD-1). Сигнал, поступающий от PD-1 при его взаимодействии с лигандами (PD-L1 или PD-L2), подавляет пролиферацию, продукцию цитокинов и цитолитическую функцию Т-лимфоцитов, а также повышает их чувствительность к апоптозу [5]. Механизм действия ингибиторного рецептора TIGIT (англ. T cell immunoglobulin and ITIM domain – Т-клеточный иммуноглобулин и тирозинсодержащий ингибиторный мотив иммунорецепторов) также активно изучается. Этот рецептор реализует свои эффекты через подавление экспрессии молекул, входящих в состав Т-клеточного рецептора, и препятствие прохождению ко-стимулирующего сигнала от CD226 [3]. Какой бы механизм ни был задействован, ключевая функция ингибиторных рецепторов заключается в поддержании гомеостаза и иммунологической толерантности [12].

Вместе с тем экспрессию ингибиторных рецепторов на клетках связывают с феноменом истощения Т-лимфоцитов. Под иммунным истощением понимают процесс постепенной утраты Т-клетками способности производить цитокины и делиться [14]. Самым распространенным маркером, используемым для определения истощенных Т-клеток, является PD-1. Возможность применения других супрессорных молекул, например TIGIT, для идентификации истощенных Т-клеток находится в стадии апробации. Предварительные исследования показали, что число Т-клеток, экспрессирующих рецепторы PD-1 и TIGIT, повышается при онкологических и аутоиммунных заболеваниях, а также хронических инфекциях [11, 15]. Тем не менее мало известно о том, как эти ингибиторные рецепторы экспрессируются в норме. В частности, отсутствуют данные о том, как данные молекулы экспрессируются на CD4⁺ и CD8⁺Т-лимфоцитах, принадлежащих к различным субпопуляциям. Кроме того, открытым остается вопрос о том, как соотносятся профили экспрессии TIGIT и наиболее распространенного маркера – PD-1 – в Т-клетках здоровых людей.

Целью настоящей работы была оценка экспрессии ингибиторных рецепторов PD-1 и TIGIT на CD4⁺ и CD8⁺Т-лимфоцитах, относящихся к различным субпопуляциям.

Материалы и методы

План исследования был утвержден этическим комитетом (рег. № IRB00008964). Каждый обследованный подписал форму информированного согласия. В исследование были включены 10 относительно здоровых добровольцев средним возрастом 43 года (37,0-45,8 лет), половина обследуемых были женщинами.

Забор крови осуществляли натощак из локтевой вены в пробирки типа Vacutainer, содержащие этилендиаминтетрауксусную кислоту (Weihai Hongyu Medical Devices Co Ltd, Китай). Мононуклеарные клетки выделяли путем центрифугирования двукратно разведенной раствором фосфатно-солевого буфера Дульбекко (DPBS, Gibco, США) периферической крови в градиенте плотности Диаколла (1,077 г/мл, ООО «Диаэм», Россия). Изолированные мононуклеарные лейкоциты отмывали в растворе DPBS и подвергали контролируемому замораживанию в среде, содержащей 90% эмбриональной телячьей сыворотки (Biowest, Франция) и 10% диметилсульфоксида (AppliChem, Германия). Затем пробы помещали в жидкий азот для длительного хранения. Перед проведением исследования клетки размораживали.

Идентификацию Т-лимфоцитов проводили на проточном цитофлюориметре CytoFLEX S (Beckman Coulter, США) с использованием моноклональных анти-CD3-BV605, анти-CD4-PE, анти-CD8-BV510, анти-CCR7-PE/Cy7 (BioLegend, США), анти-CD45R0-APC-eFluor™780 (Thermo Fisher Scientific, США) антител и витального красителя Zombie UV Fixable Viability Kit (BioLegend, США). В пулах CD4⁺ и CD8⁺Т-лимфоцитов выделяли наивные (CD45R0^-CCR7⁺) элементы, клетки центральной (CD45R0⁺CCR7⁺) и эффекторной (CD45R0⁺CCR7^-) памяти, терминально-дифференцированные эффекторы (CD45R0^-CCR7^-). Экспрессию ингибиторных рецепторов PD-1 и TIGIT оценивали с использованием анти-PD-1-PB (BioLegend, США) и анти-TIGIT-AF488 (Thermo Fisher Scientific, США) антител соответственно.

Проведение статистических расчетов и построение графиков осуществляли с использованием программного обеспечения Statistica 6. Данные представлены в виде медиан, интерквартильных размахов (25-75 перцентиль) и 10- 90 %-ных интервалов. Достоверность различий между группами устанавливали на основе U-критерия Манна–Уитни.

Результаты и обсуждение

Анализ субпопуляционного состава CD4⁺ и CD8⁺Т-лимфоцитов здоровых субъектов показал следующее. Среди CD4⁺Т-клеток 56,3% (37,0-61,7%) относились к наивным лимфоцитам; 1,0% (0,5-4,2%) к терминально-дифференцированным Т-клеткам; 36,5% (28,0-47,8%) и 9,1% (6,6-12,5%) к клеткам центральной и эффекторной памяти соответственно. Популяция CD8⁺Т- лимфоцитов на 24,8% (20,8-45,9%) состояла из наивных клеток, на 31,9% (24,6-45,9%) из терминально-дифференцированных лимфоцитов, на 11,3% (7,6-17,5%) и 20,1% (15,3-27,4%) из клеток центральной и эффекторной памяти. Полученные данные согласуются со сведениями, представленными в литературе [7].

Доля клеток, экспрессирующих PD-1, в двух популяциях Т-лимфоцитов была примерно одинаковой (p > 0,05) и составила 9,0% (6,7-14,3%) для CD4⁺Т-клеток и 12,6% (6,0-19,8%) для CD8⁺Т-лимфоцитов. Относительное количество TIGIT-позитивных клеток, напротив, существенно различалось: среди CD8⁺Т-лимфоцитов оно составило 56,1% (34,4-66,6%), а среди CD4⁺Т-клеток – 18,1% (15,6-22,5%; p < 0,01). В обеих популяциях Т-лимфоцитов доля клеток, экспрессирующих TIGIT, превышала относительное число PD-1-позитивных элементов (p < 0,01).

Уровень экспрессии ингибиторных рецепторов на CD4⁺ и CD8⁺Т-лимфоцитах различной степени зрелости существенно отличался. При этом в обеих субпопуляциях наблюдались схожие паттерны. Так, минимальное содержание PD-1-позитивных элементов было отмечено в наивных лимфоцитах (рис. 1). Среди Т-клеток памяти доля PD-1⁺ элементов была повышена относительно наивных и терминально-дифференцированных эффекторов и достигала максимума в пуле Т-лимфоцитов эффекторной памяти. Клетки центральной памяти содержали меньше PD-1⁺ элементов, чем Т-лимфоциты эффекторной памяти. В пуле CD4⁺Т-клеток, в отличие от CD8⁺Т-лимфоцитов, эти различия достигли уровня статистической значимости. Терминально-дифференцированные Т-клетки, при их сравнении с клетками эффекторной памяти, содержали меньше PD-1-позитивных элементов. В популяции CD4⁺Т- лимфоцитов терминально-дифференцированные Т-клетки не отличались от клеток центральной памяти долей PD-1⁺ элементов. Напротив, в пуле CD8⁺Т-лимфоцитов содержание PD-1⁺ клеток среди терминально-дифференцированных эффекторов было ниже, чем среди лимфоцитов центральной памяти.

 

Рисунок 1. Особенности экспрессии ингибиторного рецептора PD-1 в популяциях CD4+ и CD8+Т-лимфоцитов относительно здоровых доноров

Примечание. Представлены медианы (горизонтальные линии внутри прямоугольников), интерквартильные размахи (прямоугольники) и 10-90%-ые перцентили (вертикальные отрезки); * – p < 0,05; ** – p < 0,01; *** – p < 0,001 (U-критерий Манна–Уитни).

Figure 1. The expression of the inhibitory receptor PD-1 in CD4⁺ and CD8⁺T lymphocyte populations from healthy donors

Note. The medians are represented by horizontal lines inside the rectangles, the interquartile ranges by the rectangles, and the 10-90% percentiles by vertical lines; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001 (Mann–Whitney U test).

 

Относительное количество Т-клеток, экспрессирующих TIGIT, существенно зависело не только от стадии их дифференцировки, но и от принадлежности к CD4⁺ или CD8⁺ субпопуляции (рис. 2). Наивные лимфоциты всегда характеризовались наименьшим содержанием TIGIT-позитивных элементов. В более высокодифференцированных субпопуляциях их количество возрастало. Наибольшее содержание TIGIT-позитивных CD4⁺Т-клеток было отмечено среди лимфоцитов центральной и эффекторной памяти. В субпопуляции терминально-дифференцированных CD4⁺Т-лимфоцитов относительное количество TIGIT⁺ клеток существенно снижалось, приближаясь к значениям, характерным для наивных CD4⁺Т-лимфоцитов. Напротив, среди CD8⁺Т-лимфоцитов экспрессия молекул TIGIT в субпопуляциях клеток памяти и терминально-дифференцированных элементах была одинаково высока, достигая максимума в пуле последних. В среднем более 60% клеток в каждой из субпопуляций клеток памяти и терминально-дифференцированных эффекторов экспрессировали TIGIT.

 

Рисунок 2. Особенности экспрессии ингибиторного рецептора TIGIT в популяциях CD4+ и CD8+Т-лимфоцитов относительно здоровых доноров

Примечание. Представлены медианы (горизонтальные линии внутри прямоугольников), интерквартильные размахи (прямоугольники) и 10-90%-ные перцентили (вертикальные отрезки); ** – p < 0,01; *** – p < 0,001 (U-критерий Манна–Уитни).

Figure 2. The expression of the inhibitory receptor TIGIT in CD4⁺ and CD8⁺T lymphocyte populations from healthy donors

Note. The medians are represented by horizontal lines inside the rectangles, the interquartile ranges by the rectangles, and the 10-90% percentiles by vertical lines; **, p < 0.01; ***, p < 0.001 (Mann–Whitney U test).

 

Полученные данные демонстрируют, что у здоровых субъектов экспрессия ингибиторных рецепторов PD-1 и TIGIT на CD4⁺ и CD8⁺Т-лимфоцитах существенно зависит от стадии дифференцировки клеток. Этот факт необходимо учитывать при анализе данных, особенно в контексте истощения Т-лимфоцитов. Вероятнее всего, что у здоровых лиц наличие большой доли Т-лимфоцитов памяти, несущих на своей мембране ингибиторные рецепторы, служит для регуляции иммунных реакций и поддержания гомеостаза и не свидетельствует о развитии истощения. Данные о том, что у здоровых людей Т-клетки, экспрессирующие супрессорные молекулы, способны активно функционировать, были представлены ранее. Так, было показано, что цитотоксическая активность CD8⁺Т-лимфоцитов прямо коррелирует с относительным количеством TIGIT⁺ клеток в популяции [1].

Экспрессии ингибиторного рецептора TIGIT на CD8⁺Т-клетках следует уделить пристальное внимание. Наши исследования показали, что данная супрессорная молекула представлена на более чем 60٪ CD8⁺Т-лимфоцитов памяти здоровых доноров. Участники исследования не сообщали об онкологических или хронических инфекционных заболеваниях. Поэтому данную особенность едва ли можно связать с истощением. Более того, характер экспрессии TIGIT на CD8⁺Т-лимфоцитах существенно отличался от такового PD-1. Можно предположить, что экспрессия TIGIT прямо связана с фенотипом CD8⁺Т-лимфоцитов памяти. Ранее было показано, что для формирования и поддержания CD8⁺Т-клеток памяти необходима экспрессия транскрипционного фактора эомезодермина (EOMES) [9]. В популяциях CD8⁺Т-лимфоцитов памяти доля клеток, экспрессирующих EOMES, превышает 40% и возрастает в направлении клетки центральной памяти → клетки эффекторной памяти → терминально-дифференцированные эффекторы [6]. EOMES, связываясь с промотором гена, кодирующего TIGIT, способен усиливать его экспрессию [4]. В популяции CD4⁺Т-лимфоцитов EOMES экспрессируют меньшинство клеток. Из вышесказанного следует, что отличия в экспрессии молекулы TIGIT CD4⁺ и CD8⁺Т-клетками памяти могут быть обусловлены различными транскрипционными программами.

Среди CD8⁺Т-клеток максимальное содержание TIGIT-позитивных элементов было отмечено в субпопуляции терминально-дифференцированных лимфоцитов. При этом доля TIGIT⁺ клеток в пуле терминально-дифференцированных CD8⁺Т-лимфоцитов во много раз превышала показатели терминально-дифференцированных CD4⁺Т-клеток. Различия в экспрессии этой супрессорной молекулы могут быть связаны с разными эффекторными потенциалами двух субпопуляций. Доля терминально-дифференцированных клеток в популяции CD8⁺Т-лимфоцитов составила почти 32%. Такие лимфоциты продуцируют цитотоксические факторы, такие как перфорин и гранзимы, а также провоспалительные цитокины, в том числе IFNã, TNFá, IL-1â и IL-6 [2]. Высокий эффекторный потенциал этих клеток, вероятно, обусловливает необходимость строгого контроля со стороны ингибиторных рецепторов. В популяции CD4⁺Т-лимфоцитов здоровых субъектов содержание терминально-дифференцированных клеток, согласно полученным нами данным, низкое и в среднем составляет 1%. При этом о функциях терминально-дифференцированных CD4⁺Т-клеток известно немногое. К настоящему моменту известно, что часть терминально-дифференцированных CD4⁺Т-лимфоцитов, выделяемая по экспрессии GPR56, продуцирует цитотоксические молекулы и IFNã [13]. Однако вклад этой субпопуляции в реализацию иммунного ответа до конца не определен.

Заключение

Таким образом, экспрессия ингибиторных рецепторов PD-1 и TIGIT на Т-клетках здоровых людей во многом определяется стадией их дифференцировки и принадлежностью к CD4⁺ или CD8⁺Т-лимфоцитам. Можно выделить две основные закономерности. Во-первых, наивные Т-клетки в среднем экспрессируют супрессорные молекулы значительно слабее, чем более зрелые субпопуляции. Во-вторых, для CD8⁺Т-лимфоцитов характерен уникальный профиль экспрессии ингибиторного рецептора TIGIT. По-видимому, экспрессия этой молекулы на CD8⁺Т-клетках памяти не является признаком сниженной функциональности, но отражает высокую степень зрелости цитотоксических лимфоцитов. Полученные сведения расширяют представление о роли ингибиторных рецепторов в регуляции функций Т-клеток и подчеркивают необходимость пересмотра подходов к интерпретации данных об экспрессии супрессорных молекул в контексте функционального истощения.

Об авторах

В. В. Власова

Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук – филиал ФГБУН «Пермский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук»

Автор, ответственный за переписку.
Email: violetbaudelaire73@gmail.com

младший научный сотрудник лаборатории молекулярной иммунологии

Россия, Пермь

Е. В. Сайдакова

Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук – филиал ФГБУН «Пермский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук»

Email: violetbaudelaire73@gmail.com

д.б.н., заведующая лабораторией молекулярной иммунологии

Россия, Пермь

Список литературы

Дополнительные файлы