The expression patterns of the inhibitory receptors PD-1 and TIGIT on CD4+ and CD8+T lymphocytes at different stages of differentiation

Full Text

Введение

Центральная роль в адаптивном иммунном ответе принадлежит Т-лимфоцитам. Эти клетки представляют собой гетерогенную популяцию, включающую CD4⁺Т-хелперы и цитотоксические CD8⁺Т-лимфоциты. И те, и другие содержат клетки различной степени зрелости: наивные лимфоциты, клетки центральной и эффекторной памяти, терминально-дифференцированные эффекторы. Субпопуляции Т-клеток обладают разным спектром эффекторных функций – от продукции цитокинов до уничтожения инфицированных клеток, – что позволяет им обеспечивать защиту организма от внутриклеточных и внеклеточных патогенов [8].

Эффекторные действия Т-лимфоцитов могут быть разрушительны для здоровых тканей организма, поэтому функции Т-клеток, как правило, строго регулируются. Одним из механизмов контроля выступают ингибиторные рецепторы – группа молекул (PD-1, TIGIT, Lag-3, Tim- 3, CTLA-4, CD160, LAIR1 и др.), способных подавлять или замедлять биохимические реакции и сигнальные пути, связанные с активацией, пролиферацией и эффекторными функциями Т-клеток [10, 11]. Среди супрессорных молекул наиболее изучен рецептор программируемой клеточной гибели 1 (англ. Programmed death-1 – PD-1). Сигнал, поступающий от PD-1 при его взаимодействии с лигандами (PD-L1 или PD-L2), подавляет пролиферацию, продукцию цитокинов и цитолитическую функцию Т-лимфоцитов, а также повышает их чувствительность к апоптозу [5]. Механизм действия ингибиторного рецептора TIGIT (англ. T cell immunoglobulin and ITIM domain – Т-клеточный иммуноглобулин и тирозинсодержащий ингибиторный мотив иммунорецепторов) также активно изучается. Этот рецептор реализует свои эффекты через подавление экспрессии молекул, входящих в состав Т-клеточного рецептора, и препятствие прохождению ко-стимулирующего сигнала от CD226 [3]. Какой бы механизм ни был задействован, ключевая функция ингибиторных рецепторов заключается в поддержании гомеостаза и иммунологической толерантности [12].

Вместе с тем экспрессию ингибиторных рецепторов на клетках связывают с феноменом истощения Т-лимфоцитов. Под иммунным истощением понимают процесс постепенной утраты Т-клетками способности производить цитокины и делиться [14]. Самым распространенным маркером, используемым для определения истощенных Т-клеток, является PD-1. Возможность применения других супрессорных молекул, например TIGIT, для идентификации истощенных Т-клеток находится в стадии апробации. Предварительные исследования показали, что число Т-клеток, экспрессирующих рецепторы PD-1 и TIGIT, повышается при онкологических и аутоиммунных заболеваниях, а также хронических инфекциях [11, 15]. Тем не менее мало известно о том, как эти ингибиторные рецепторы экспрессируются в норме. В частности, отсутствуют данные о том, как данные молекулы экспрессируются на CD4⁺ и CD8⁺Т-лимфоцитах, принадлежащих к различным субпопуляциям. Кроме того, открытым остается вопрос о том, как соотносятся профили экспрессии TIGIT и наиболее распространенного маркера – PD-1 – в Т-клетках здоровых людей.

Целью настоящей работы была оценка экспрессии ингибиторных рецепторов PD-1 и TIGIT на CD4⁺ и CD8⁺Т-лимфоцитах, относящихся к различным субпопуляциям.

Материалы и методы

План исследования был утвержден этическим комитетом (рег. № IRB00008964). Каждый обследованный подписал форму информированного согласия. В исследование были включены 10 относительно здоровых добровольцев средним возрастом 43 года (37,0-45,8 лет), половина обследуемых были женщинами.

Забор крови осуществляли натощак из локтевой вены в пробирки типа Vacutainer, содержащие этилендиаминтетрауксусную кислоту (Weihai Hongyu Medical Devices Co Ltd, Китай). Мононуклеарные клетки выделяли путем центрифугирования двукратно разведенной раствором фосфатно-солевого буфера Дульбекко (DPBS, Gibco, США) периферической крови в градиенте плотности Диаколла (1,077 г/мл, ООО «Диаэм», Россия). Изолированные мононуклеарные лейкоциты отмывали в растворе DPBS и подвергали контролируемому замораживанию в среде, содержащей 90% эмбриональной телячьей сыворотки (Biowest, Франция) и 10% диметилсульфоксида (AppliChem, Германия). Затем пробы помещали в жидкий азот для длительного хранения. Перед проведением исследования клетки размораживали.

Идентификацию Т-лимфоцитов проводили на проточном цитофлюориметре CytoFLEX S (Beckman Coulter, США) с использованием моноклональных анти-CD3-BV605, анти-CD4-PE, анти-CD8-BV510, анти-CCR7-PE/Cy7 (BioLegend, США), анти-CD45R0-APC-eFluor™780 (Thermo Fisher Scientific, США) антител и витального красителя Zombie UV Fixable Viability Kit (BioLegend, США). В пулах CD4⁺ и CD8⁺Т-лимфоцитов выделяли наивные (CD45R0^-CCR7⁺) элементы, клетки центральной (CD45R0⁺CCR7⁺) и эффекторной (CD45R0⁺CCR7^-) памяти, терминально-дифференцированные эффекторы (CD45R0^-CCR7^-). Экспрессию ингибиторных рецепторов PD-1 и TIGIT оценивали с использованием анти-PD-1-PB (BioLegend, США) и анти-TIGIT-AF488 (Thermo Fisher Scientific, США) антител соответственно.

Проведение статистических расчетов и построение графиков осуществляли с использованием программного обеспечения Statistica 6. Данные представлены в виде медиан, интерквартильных размахов (25-75 перцентиль) и 10- 90 %-ных интервалов. Достоверность различий между группами устанавливали на основе U-критерия Манна–Уитни.

Результаты и обсуждение

Анализ субпопуляционного состава CD4⁺ и CD8⁺Т-лимфоцитов здоровых субъектов показал следующее. Среди CD4⁺Т-клеток 56,3% (37,0-61,7%) относились к наивным лимфоцитам; 1,0% (0,5-4,2%) к терминально-дифференцированным Т-клеткам; 36,5% (28,0-47,8%) и 9,1% (6,6-12,5%) к клеткам центральной и эффекторной памяти соответственно. Популяция CD8⁺Т- лимфоцитов на 24,8% (20,8-45,9%) состояла из наивных клеток, на 31,9% (24,6-45,9%) из терминально-дифференцированных лимфоцитов, на 11,3% (7,6-17,5%) и 20,1% (15,3-27,4%) из клеток центральной и эффекторной памяти. Полученные данные согласуются со сведениями, представленными в литературе [7].

Доля клеток, экспрессирующих PD-1, в двух популяциях Т-лимфоцитов была примерно одинаковой (p > 0,05) и составила 9,0% (6,7-14,3%) для CD4⁺Т-клеток и 12,6% (6,0-19,8%) для CD8⁺Т-лимфоцитов. Относительное количество TIGIT-позитивных клеток, напротив, существенно различалось: среди CD8⁺Т-лимфоцитов оно составило 56,1% (34,4-66,6%), а среди CD4⁺Т-клеток – 18,1% (15,6-22,5%; p < 0,01). В обеих популяциях Т-лимфоцитов доля клеток, экспрессирующих TIGIT, превышала относительное число PD-1-позитивных элементов (p < 0,01).

Уровень экспрессии ингибиторных рецепторов на CD4⁺ и CD8⁺Т-лимфоцитах различной степени зрелости существенно отличался. При этом в обеих субпопуляциях наблюдались схожие паттерны. Так, минимальное содержание PD-1-позитивных элементов было отмечено в наивных лимфоцитах (рис. 1). Среди Т-клеток памяти доля PD-1⁺ элементов была повышена относительно наивных и терминально-дифференцированных эффекторов и достигала максимума в пуле Т-лимфоцитов эффекторной памяти. Клетки центральной памяти содержали меньше PD-1⁺ элементов, чем Т-лимфоциты эффекторной памяти. В пуле CD4⁺Т-клеток, в отличие от CD8⁺Т-лимфоцитов, эти различия достигли уровня статистической значимости. Терминально-дифференцированные Т-клетки, при их сравнении с клетками эффекторной памяти, содержали меньше PD-1-позитивных элементов. В популяции CD4⁺Т- лимфоцитов терминально-дифференцированные Т-клетки не отличались от клеток центральной памяти долей PD-1⁺ элементов. Напротив, в пуле CD8⁺Т-лимфоцитов содержание PD-1⁺ клеток среди терминально-дифференцированных эффекторов было ниже, чем среди лимфоцитов центральной памяти.

 

Рисунок 1. Особенности экспрессии ингибиторного рецептора PD-1 в популяциях CD4+ и CD8+Т-лимфоцитов относительно здоровых доноров

Примечание. Представлены медианы (горизонтальные линии внутри прямоугольников), интерквартильные размахи (прямоугольники) и 10-90%-ые перцентили (вертикальные отрезки); * – p < 0,05; ** – p < 0,01; *** – p < 0,001 (U-критерий Манна–Уитни).

Figure 1. The expression of the inhibitory receptor PD-1 in CD4⁺ and CD8⁺T lymphocyte populations from healthy donors

Note. The medians are represented by horizontal lines inside the rectangles, the interquartile ranges by the rectangles, and the 10-90% percentiles by vertical lines; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001 (Mann–Whitney U test).

 

Относительное количество Т-клеток, экспрессирующих TIGIT, существенно зависело не только от стадии их дифференцировки, но и от принадлежности к CD4⁺ или CD8⁺ субпопуляции (рис. 2). Наивные лимфоциты всегда характеризовались наименьшим содержанием TIGIT-позитивных элементов. В более высокодифференцированных субпопуляциях их количество возрастало. Наибольшее содержание TIGIT-позитивных CD4⁺Т-клеток было отмечено среди лимфоцитов центральной и эффекторной памяти. В субпопуляции терминально-дифференцированных CD4⁺Т-лимфоцитов относительное количество TIGIT⁺ клеток существенно снижалось, приближаясь к значениям, характерным для наивных CD4⁺Т-лимфоцитов. Напротив, среди CD8⁺Т-лимфоцитов экспрессия молекул TIGIT в субпопуляциях клеток памяти и терминально-дифференцированных элементах была одинаково высока, достигая максимума в пуле последних. В среднем более 60% клеток в каждой из субпопуляций клеток памяти и терминально-дифференцированных эффекторов экспрессировали TIGIT.

 

Рисунок 2. Особенности экспрессии ингибиторного рецептора TIGIT в популяциях CD4+ и CD8+Т-лимфоцитов относительно здоровых доноров

Примечание. Представлены медианы (горизонтальные линии внутри прямоугольников), интерквартильные размахи (прямоугольники) и 10-90%-ные перцентили (вертикальные отрезки); ** – p < 0,01; *** – p < 0,001 (U-критерий Манна–Уитни).

Figure 2. The expression of the inhibitory receptor TIGIT in CD4⁺ and CD8⁺T lymphocyte populations from healthy donors

Note. The medians are represented by horizontal lines inside the rectangles, the interquartile ranges by the rectangles, and the 10-90% percentiles by vertical lines; **, p < 0.01; ***, p < 0.001 (Mann–Whitney U test).

 

Полученные данные демонстрируют, что у здоровых субъектов экспрессия ингибиторных рецепторов PD-1 и TIGIT на CD4⁺ и CD8⁺Т-лимфоцитах существенно зависит от стадии дифференцировки клеток. Этот факт необходимо учитывать при анализе данных, особенно в контексте истощения Т-лимфоцитов. Вероятнее всего, что у здоровых лиц наличие большой доли Т-лимфоцитов памяти, несущих на своей мембране ингибиторные рецепторы, служит для регуляции иммунных реакций и поддержания гомеостаза и не свидетельствует о развитии истощения. Данные о том, что у здоровых людей Т-клетки, экспрессирующие супрессорные молекулы, способны активно функционировать, были представлены ранее. Так, было показано, что цитотоксическая активность CD8⁺Т-лимфоцитов прямо коррелирует с относительным количеством TIGIT⁺ клеток в популяции [1].

Экспрессии ингибиторного рецептора TIGIT на CD8⁺Т-клетках следует уделить пристальное внимание. Наши исследования показали, что данная супрессорная молекула представлена на более чем 60٪ CD8⁺Т-лимфоцитов памяти здоровых доноров. Участники исследования не сообщали об онкологических или хронических инфекционных заболеваниях. Поэтому данную особенность едва ли можно связать с истощением. Более того, характер экспрессии TIGIT на CD8⁺Т-лимфоцитах существенно отличался от такового PD-1. Можно предположить, что экспрессия TIGIT прямо связана с фенотипом CD8⁺Т-лимфоцитов памяти. Ранее было показано, что для формирования и поддержания CD8⁺Т-клеток памяти необходима экспрессия транскрипционного фактора эомезодермина (EOMES) [9]. В популяциях CD8⁺Т-лимфоцитов памяти доля клеток, экспрессирующих EOMES, превышает 40% и возрастает в направлении клетки центральной памяти → клетки эффекторной памяти → терминально-дифференцированные эффекторы [6]. EOMES, связываясь с промотором гена, кодирующего TIGIT, способен усиливать его экспрессию [4]. В популяции CD4⁺Т-лимфоцитов EOMES экспрессируют меньшинство клеток. Из вышесказанного следует, что отличия в экспрессии молекулы TIGIT CD4⁺ и CD8⁺Т-клетками памяти могут быть обусловлены различными транскрипционными программами.

Среди CD8⁺Т-клеток максимальное содержание TIGIT-позитивных элементов было отмечено в субпопуляции терминально-дифференцированных лимфоцитов. При этом доля TIGIT⁺ клеток в пуле терминально-дифференцированных CD8⁺Т-лимфоцитов во много раз превышала показатели терминально-дифференцированных CD4⁺Т-клеток. Различия в экспрессии этой супрессорной молекулы могут быть связаны с разными эффекторными потенциалами двух субпопуляций. Доля терминально-дифференцированных клеток в популяции CD8⁺Т-лимфоцитов составила почти 32%. Такие лимфоциты продуцируют цитотоксические факторы, такие как перфорин и гранзимы, а также провоспалительные цитокины, в том числе IFNã, TNFá, IL-1â и IL-6 [2]. Высокий эффекторный потенциал этих клеток, вероятно, обусловливает необходимость строгого контроля со стороны ингибиторных рецепторов. В популяции CD4⁺Т-лимфоцитов здоровых субъектов содержание терминально-дифференцированных клеток, согласно полученным нами данным, низкое и в среднем составляет 1%. При этом о функциях терминально-дифференцированных CD4⁺Т-клеток известно немногое. К настоящему моменту известно, что часть терминально-дифференцированных CD4⁺Т-лимфоцитов, выделяемая по экспрессии GPR56, продуцирует цитотоксические молекулы и IFNã [13]. Однако вклад этой субпопуляции в реализацию иммунного ответа до конца не определен.

Заключение

Таким образом, экспрессия ингибиторных рецепторов PD-1 и TIGIT на Т-клетках здоровых людей во многом определяется стадией их дифференцировки и принадлежностью к CD4⁺ или CD8⁺Т-лимфоцитам. Можно выделить две основные закономерности. Во-первых, наивные Т-клетки в среднем экспрессируют супрессорные молекулы значительно слабее, чем более зрелые субпопуляции. Во-вторых, для CD8⁺Т-лимфоцитов характерен уникальный профиль экспрессии ингибиторного рецептора TIGIT. По-видимому, экспрессия этой молекулы на CD8⁺Т-клетках памяти не является признаком сниженной функциональности, но отражает высокую степень зрелости цитотоксических лимфоцитов. Полученные сведения расширяют представление о роли ингибиторных рецепторов в регуляции функций Т-клеток и подчеркивают необходимость пересмотра подходов к интерпретации данных об экспрессии супрессорных молекул в контексте функционального истощения.

About the authors

V. V. Vlasova

Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Perm Federal Research Center, Ural Branch, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: violetbaudelaire73@gmail.com

Junior Research Associate, Laboratory of Molecular Immunology

Russian Federation, Perm

E. V. Saidakova

Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Perm Federal Research Center, Ural Branch, Russian Academy of Sciences

Email: violetbaudelaire73@gmail.com

PhD, MD (Biology), Head, Laboratory of Molecular Immunology

Russian Federation, Perm

References

Supplementary files