Механизмы RORα-зависимых эффектов мелатонина

Полный текст

Введение

RORα – ядерный орфанный рецептор, родственный рецепторам ретиноевой кислоты, член суперсемейства стероид/тиреоидных рецепторов. Это лиганд-зависимый транскрипционный фактор: в ответ на связывание эндогенного или экзогенного лиганда он изменяет конформацию, ассоциирует с коактиватором или корепрессором и, соответственно, стимулирует или подавляет транскрипцию генов-мишеней. RORα широко экспрессирован в тканях организма, включая скелетные мышцы, яички, клетки Пуркинье в мозжечке, сетчатку. В иммунной системе экспрессия этого фактора ограничивается преимущественно Т-хелперной популяцией Th17, для которой RORα является одним из двух ключевых факторов дифференцировки, наряду с RORγt [14]. Функции RORα и RORγt в развитии Th17 частично перекрываются: оба фактора индуцируют транскрипцию ключевых Th17-ассоциированных факторов, включая IL-17A, IL-23R, CCL20 and CCR6, что подтверждается и наличием Th17-зависимого ответа у животных с дефицитными по RORα Т-лимфоцитами, хотя этот ответ и снижен [14]. Поэтому экспрессию RORα в клетках Th17 традиционно считали необязательной, «дополнительной». Однако недавними исследованиями показано, что RORα играет принципиальную роль этом процессе: он необходим для развития патогенного варианта клеток Th17 – так называемых Th1-поляризованных Th17 (Th17.1), коэкспрессирующих Th1-ассоциированный транскрипционный фактор T-bet и копродуцирующих наряду с IL-17 Th1-зависимый IFNγ, а также GM-CSF [5]. Учитывая, что транскрипционная активность RORα зависит от связывания лиганда, высокую актуальность приобретает вопрос о регуляции данного фактора, и в этой связи особый интерес представляет мелатонин – вопрос о способности RORα напрямую связывать мелатонин на сегодняшний день остается открытым, данные по этой проблеме крайне противоречивы. Между тем, внимательный анализ этих данных позволяет разрешить эти противоречия, что и является задачей данной работы.

Материалы и методы

Поиск литературы о RORα-зависимых эффектах мелатонина в Т-лимфоцитах и нелимфоидных клетках проводился в базе данных PubMed с использованием соответствующих ключевых слов, без ограничения по языку и дате публикаций.

Результаты и обсуждение

Способность мелатонина проникать сквозь клеточную мембрану и неоднократная демонстрация его присутствия в ядре, в частности, в ядерных фракциях тимоцитов и спленоцитов крысы, еще тридцать лет назад инициировали поиск ядерных рецепторов для гормона. В 1995 г. I. Wiesenberg с коллегами идентифицировали RORα как ядерный рецептор для мелатонина [13], продемонстрировав способность гормона усиливать связывание данного фактора с ДНК и определив с помощью классического скэтчардовского анализа константу диссоциации для взаимодействия RORα с мелатонином (Kd = 1,71 nM). Строго говоря, данный эффект был показан для сплайсинг-варианта RORα1, но, согласно сиквенс-анализу, лиганд-связывающие домены всех вариантов рецептора идентичны. Поэтому данные, полученные для RORα1, можно отнести и к другим вариантам RORα – RORα2, RORα3 и RORα4 [13]. В 2011 г. P.J. Lardone с коллегами «переоткрыли» RORα как рецептор для мелатонина [9], показав на Т-лимфоцитарной линии Jurkat, что мелатонин копреципитируется (иммуноблоттинг) и колокализуется с RORα (иммунофлуоресцентный анализ), а также в наномолярных концентрациях вызывает перераспределение RORα внутри клетки, регистрируемое с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии [9], что, хоть и косвенно, но убедительно указывает на взаимодействие гормона с RORα.

В 2016 г. вышла статья A.J. Slominski и соавт. под названием “RORα is not a receptor for melatonin”. Фактически, это комментарий, в котором автор обращает внимание на свою недавнюю работу [12], не выявившую взаимодействия мелатонина с RORα с помощь молекулярного моделирования лиганд-рецепторных взаимодействий, а также функционального анализа способности мелатонина напрямую регулировать RORα [12]. Однако внимательный анализ представленных в работе данных указывает на неоднозначность такого вывода, и прежде всего это относится к результатам молекулярного докинга, в котором на основе данных о кристалличнеской структуре лиганд-связывающего домена RORα определялась конформация его связывания с лигандами (в том числе с мелатонином) и оценивалась потенциальная энергия такого взаимодействия. Во-первых, молекулярный докинг – это виртуальный анализ, и несмотря на довольно высокую точность, он рассматривается исключительно как инструмент предварительного скрининга, результаты которого требуют последующего экспериментального подтверждения. Во-вторых, по результатам молекулярного докинга, потенциальная энергия взаимодействия мелатонина с лиганд-связывающим доменом RORα составляет –6,67 ккал/М [12], что позволяет говорить о среднем или низком сродстве мелатонина к RORα, но не о его отсутствии. И этот результат не противоречит полученным ранее экспериментальным данным, согласно которым аффинность связывания мелатонина с RORα в 5-20 раз ниже таковой для его взаимодействия с классическими мембранными рецепторами, МТ1 (Kd = 80,7 рM) и МТ2 (Kd = 383 pM) [8]. Что касается функционального теста, использованного в работе, он был сконструирован специально для оценки активности антагонистов ROR: это вариант люциферазного репортерного анализа в клеточной системе с доксициклин-индуцируемой стабильной экспрессией RORα – последнюю фиксировали по активности репортера, работающего под контролем RORЕ, в присутствии потенциальных антагонистов. Мелатонин в такой системе не оказывал значимого влияния на активность RORα. Однако важно отметить, что в большинстве исследований мелатонин выступает в роли не антагониста, а агониста: он усиливает транскрипционную активность RORα [7, 9, 13]. А оценка действия потенциального активатора RORα в условиях изначальной интенсивной активации этого фактора малоинформативна. По крайней мере отсутствие эффектов мелатонина в данной системе не исключает способности гормона самостоятельно индуцировать или усиливать транскрипционную активность RORα. Кроме того, мелатонин в функциональных тестах использован в микромолярных концентрациях, в которых он неспецифически взаимодействует со многими внутриклеточными мишенями, такими как кальмодулин или глутатион трансфераза, и действие гормона, опосредуемое этими мишенями, может просто перекрывать его RORα-зависимые эффекты. В связи с вышесказанным, на сегодняшний день нет веских оснований исключать RORα из состава мелатониновых рецепторов.

В пользу этого заключения говорит и тот факт, что RORα опосредует многие важные эффекты мелатонина – как физиологические, так и фармакологические, включая регуляцию циркадных ритмов [10] и окислительного метаболизма [2, 6], нейро- и кардиопротекцию [6, 15], стимуляцию дифференцировки одонтобластов [7], а также контроль иммунного ответа [3, 4]. Эффекты мелатонина в этих исследованиях отменялись полностью или частично на фоне блокады RORα in vitro [2, 4, 7] и in vivo [3, 10], тогда как блокада мембранных мелатониновых рецепторов (МТ1/МТ2) в аналогичных условиях не изменяла действия мелатонина. Следует, однако, отметить, что описанные выше эффекты, теоретически, могут быть результатом не прямого связывания мелатонина с RORα, а опосредованного – в качестве такого посредника может выступать, например, сиртуин 1 (SIRT1), что показано в целом ряде работ [11]. Кроме того, имеется немало данных о посттрансляционных модификациях, модулирующих активность RORα – так, он может фосфорилироваться протеинкиназой А (PKA) по Ser99 или протеинкиназой ERK2 по Thr128, что существенно усиливает транскрипционную активность данного фактора. Сумоилирование RORα, т. е. ковалентное присоединение к остаткам лизинов малых убиквитин-подобных модифицирующих белков (SUMO), также приводит к его активации.

В целом имеющиеся на сегодняшний день данные позволяют рассматривать транскрипционный фактор RORα как рецептор для мелатонина со средней аффинностью, хотя не исключена и непрямая регуляция этого фактора гормоном, и RORα-зависимые механизмы должны вносить вклад в ответ клеток на мелатонин как в физиологических условиях, так и в случае фармакологического применения гормона.

Заключение

В заключении следует отметить недавнюю работу N. Fang и соавт., демонстртрующую способность мелатонина напрямую взаимодействовать с лиганд-связывающим доменом рецептора витамина D (VDR), также ядерного рецептора [1]. И хотя константа диссоциации для такого связывания (Kd 21,2±1,9 мкМ) указывает на его низкую аффинность, авторы отмечают, что эти данные вновь открывают дискуссию о возможном существовании ядерных мишеней для мелатонина.

Об авторах

Е. М. Куклина

Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук – филиал ФГБУН «Пермский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук»

Автор, ответственный за переписку.
Email: ibis_07@mail.ru

д.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории иммунорегуляции

Россия, Пермь

Список литературы

Дополнительные файлы