Mechanisms of RORα-dependent effects of melatonin

Full Text

Введение

RORα – ядерный орфанный рецептор, родственный рецепторам ретиноевой кислоты, член суперсемейства стероид/тиреоидных рецепторов. Это лиганд-зависимый транскрипционный фактор: в ответ на связывание эндогенного или экзогенного лиганда он изменяет конформацию, ассоциирует с коактиватором или корепрессором и, соответственно, стимулирует или подавляет транскрипцию генов-мишеней. RORα широко экспрессирован в тканях организма, включая скелетные мышцы, яички, клетки Пуркинье в мозжечке, сетчатку. В иммунной системе экспрессия этого фактора ограничивается преимущественно Т-хелперной популяцией Th17, для которой RORα является одним из двух ключевых факторов дифференцировки, наряду с RORγt [14]. Функции RORα и RORγt в развитии Th17 частично перекрываются: оба фактора индуцируют транскрипцию ключевых Th17-ассоциированных факторов, включая IL-17A, IL-23R, CCL20 and CCR6, что подтверждается и наличием Th17-зависимого ответа у животных с дефицитными по RORα Т-лимфоцитами, хотя этот ответ и снижен [14]. Поэтому экспрессию RORα в клетках Th17 традиционно считали необязательной, «дополнительной». Однако недавними исследованиями показано, что RORα играет принципиальную роль этом процессе: он необходим для развития патогенного варианта клеток Th17 – так называемых Th1-поляризованных Th17 (Th17.1), коэкспрессирующих Th1-ассоциированный транскрипционный фактор T-bet и копродуцирующих наряду с IL-17 Th1-зависимый IFNγ, а также GM-CSF [5]. Учитывая, что транскрипционная активность RORα зависит от связывания лиганда, высокую актуальность приобретает вопрос о регуляции данного фактора, и в этой связи особый интерес представляет мелатонин – вопрос о способности RORα напрямую связывать мелатонин на сегодняшний день остается открытым, данные по этой проблеме крайне противоречивы. Между тем, внимательный анализ этих данных позволяет разрешить эти противоречия, что и является задачей данной работы.

Материалы и методы

Поиск литературы о RORα-зависимых эффектах мелатонина в Т-лимфоцитах и нелимфоидных клетках проводился в базе данных PubMed с использованием соответствующих ключевых слов, без ограничения по языку и дате публикаций.

Результаты и обсуждение

Способность мелатонина проникать сквозь клеточную мембрану и неоднократная демонстрация его присутствия в ядре, в частности, в ядерных фракциях тимоцитов и спленоцитов крысы, еще тридцать лет назад инициировали поиск ядерных рецепторов для гормона. В 1995 г. I. Wiesenberg с коллегами идентифицировали RORα как ядерный рецептор для мелатонина [13], продемонстрировав способность гормона усиливать связывание данного фактора с ДНК и определив с помощью классического скэтчардовского анализа константу диссоциации для взаимодействия RORα с мелатонином (Kd = 1,71 nM). Строго говоря, данный эффект был показан для сплайсинг-варианта RORα1, но, согласно сиквенс-анализу, лиганд-связывающие домены всех вариантов рецептора идентичны. Поэтому данные, полученные для RORα1, можно отнести и к другим вариантам RORα – RORα2, RORα3 и RORα4 [13]. В 2011 г. P.J. Lardone с коллегами «переоткрыли» RORα как рецептор для мелатонина [9], показав на Т-лимфоцитарной линии Jurkat, что мелатонин копреципитируется (иммуноблоттинг) и колокализуется с RORα (иммунофлуоресцентный анализ), а также в наномолярных концентрациях вызывает перераспределение RORα внутри клетки, регистрируемое с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии [9], что, хоть и косвенно, но убедительно указывает на взаимодействие гормона с RORα.

В 2016 г. вышла статья A.J. Slominski и соавт. под названием “RORα is not a receptor for melatonin”. Фактически, это комментарий, в котором автор обращает внимание на свою недавнюю работу [12], не выявившую взаимодействия мелатонина с RORα с помощь молекулярного моделирования лиганд-рецепторных взаимодействий, а также функционального анализа способности мелатонина напрямую регулировать RORα [12]. Однако внимательный анализ представленных в работе данных указывает на неоднозначность такого вывода, и прежде всего это относится к результатам молекулярного докинга, в котором на основе данных о кристалличнеской структуре лиганд-связывающего домена RORα определялась конформация его связывания с лигандами (в том числе с мелатонином) и оценивалась потенциальная энергия такого взаимодействия. Во-первых, молекулярный докинг – это виртуальный анализ, и несмотря на довольно высокую точность, он рассматривается исключительно как инструмент предварительного скрининга, результаты которого требуют последующего экспериментального подтверждения. Во-вторых, по результатам молекулярного докинга, потенциальная энергия взаимодействия мелатонина с лиганд-связывающим доменом RORα составляет –6,67 ккал/М [12], что позволяет говорить о среднем или низком сродстве мелатонина к RORα, но не о его отсутствии. И этот результат не противоречит полученным ранее экспериментальным данным, согласно которым аффинность связывания мелатонина с RORα в 5-20 раз ниже таковой для его взаимодействия с классическими мембранными рецепторами, МТ1 (Kd = 80,7 рM) и МТ2 (Kd = 383 pM) [8]. Что касается функционального теста, использованного в работе, он был сконструирован специально для оценки активности антагонистов ROR: это вариант люциферазного репортерного анализа в клеточной системе с доксициклин-индуцируемой стабильной экспрессией RORα – последнюю фиксировали по активности репортера, работающего под контролем RORЕ, в присутствии потенциальных антагонистов. Мелатонин в такой системе не оказывал значимого влияния на активность RORα. Однако важно отметить, что в большинстве исследований мелатонин выступает в роли не антагониста, а агониста: он усиливает транскрипционную активность RORα [7, 9, 13]. А оценка действия потенциального активатора RORα в условиях изначальной интенсивной активации этого фактора малоинформативна. По крайней мере отсутствие эффектов мелатонина в данной системе не исключает способности гормона самостоятельно индуцировать или усиливать транскрипционную активность RORα. Кроме того, мелатонин в функциональных тестах использован в микромолярных концентрациях, в которых он неспецифически взаимодействует со многими внутриклеточными мишенями, такими как кальмодулин или глутатион трансфераза, и действие гормона, опосредуемое этими мишенями, может просто перекрывать его RORα-зависимые эффекты. В связи с вышесказанным, на сегодняшний день нет веских оснований исключать RORα из состава мелатониновых рецепторов.

В пользу этого заключения говорит и тот факт, что RORα опосредует многие важные эффекты мелатонина – как физиологические, так и фармакологические, включая регуляцию циркадных ритмов [10] и окислительного метаболизма [2, 6], нейро- и кардиопротекцию [6, 15], стимуляцию дифференцировки одонтобластов [7], а также контроль иммунного ответа [3, 4]. Эффекты мелатонина в этих исследованиях отменялись полностью или частично на фоне блокады RORα in vitro [2, 4, 7] и in vivo [3, 10], тогда как блокада мембранных мелатониновых рецепторов (МТ1/МТ2) в аналогичных условиях не изменяла действия мелатонина. Следует, однако, отметить, что описанные выше эффекты, теоретически, могут быть результатом не прямого связывания мелатонина с RORα, а опосредованного – в качестве такого посредника может выступать, например, сиртуин 1 (SIRT1), что показано в целом ряде работ [11]. Кроме того, имеется немало данных о посттрансляционных модификациях, модулирующих активность RORα – так, он может фосфорилироваться протеинкиназой А (PKA) по Ser99 или протеинкиназой ERK2 по Thr128, что существенно усиливает транскрипционную активность данного фактора. Сумоилирование RORα, т. е. ковалентное присоединение к остаткам лизинов малых убиквитин-подобных модифицирующих белков (SUMO), также приводит к его активации.

В целом имеющиеся на сегодняшний день данные позволяют рассматривать транскрипционный фактор RORα как рецептор для мелатонина со средней аффинностью, хотя не исключена и непрямая регуляция этого фактора гормоном, и RORα-зависимые механизмы должны вносить вклад в ответ клеток на мелатонин как в физиологических условиях, так и в случае фармакологического применения гормона.

Заключение

В заключении следует отметить недавнюю работу N. Fang и соавт., демонстртрующую способность мелатонина напрямую взаимодействовать с лиганд-связывающим доменом рецептора витамина D (VDR), также ядерного рецептора [1]. И хотя константа диссоциации для такого связывания (Kd 21,2±1,9 мкМ) указывает на его низкую аффинность, авторы отмечают, что эти данные вновь открывают дискуссию о возможном существовании ядерных мишеней для мелатонина.

About the authors

E. M. Kuklina

Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Perm Federal Research Center, Ural Branch, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: ibis_07@mail.ru

PhD, MD (Biology), Leading Research Associate, Laboratory of Immunoregulation

Russian Federation, Perm

References

Supplementary files