Особенности провоспалительной активации макрофагов у пациентов с аутоиммунными ревматическими заболеваниями

Полный текст

Работа выполнена при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (НИОКТР № 123030700026-8).

Введение

Аутоиммунные ревматические заболевания (АРЗ) – это хронические состояния, при которых происходит аномальная активация иммунной системы, что приводит к поражению кожи и внутренних органов, инвалидности и преждевременной смертности. Эпидемиологические исследования демонстрируют, что данные патологии охватывают от 3% до 5% населения [10]. Одними из наиболее распространенных АРЗ являются ревматоидный артрит (РА), системная красная волчанка (СКВ) и системный склероз (СС). Несмотря на то, что точный патогенез АРЗ остается неизвестным, важно отметить, что сочетание генетических, иммунологических, гормональных и экологических факторов приводит к возникновению АРЗ [15]. Установлено, что компонентами врожденного иммунитета, моноциты и макрофаги, играют решающую роль в развитии, прогрессировании и разрешении АРЗ за счет миграции в очаг воспаления, удаления аутоантигенов, секреции провоспалительных цитокинов и хемокинов. Эти события приводят к активации Т- и В-клеток, которые атакуют здоровые ткани и вызывают хроническое воспаление [9].

РА характеризуется хроническим воспалением, которое приводит к разрушению суставов и хрящей. Было обнаружено, что число макрофагов синовиальной оболочки положительно коррелирует со степенью эрозии суставов и служит ранним признаком развития РА [15]. Кроме того, за счет продукции фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) макрофаги опосредуют хемотаксис и пролиферацию эндотелиальных клеток в синовиальной оболочке, что способствует образованию паннуса и дополнительной инфильтрации воспалительных клеток в суставе [12].

СКВ – это хроническое системное аутоиммунное заболевание, при котором происходит накопление иммунных комплексов и поражение внутренних органов и кожи. Нарушение активации циркулирующих и тканевых макрофагов является важным фактором для возникновения и прогрессирования СКВ. При этом механизм активации макрофагов в настоящее время неясен [1].

Для СС характерно развитие фиброза кожи и внутренних органов, а также васкулопатия. При СС макрофаги могут участвовать в образовании фиброза за счет выработки провоспалительных цитокинов [2].

Аномальная активация макрофагов приводит к повышенной секреции провоспалительных цитокинов и хемокинов, в том числе IL-1β, TNFα и IL-8. IL-8, продуцируемый моноцитами, макрофагами, нейтрофилами, эндотелиальными клетками и фибробластами, является одним из основных провоспалительных цитокинов, который способен привлекать полиморфноядерные нейтрофилы и другие иммунные клетки в очаг воспаления, что приводит к развитию системного воспаления. При этом секреция IL-8 часто стимулируется IL-1β и TNFα, что приводит к хронизации процесса воспаления [6]. Отмечено увеличение экспрессии IL-8 при АРЗ, которое коррелирует с тяжестью заболевания [13]. Целью настоящего исследования была оценка воспалительного ответа макрофагов в отношении секреции IL-8 у пациентов с РА, СКВ и СС.

Материалы и методы

Исследование включало в себя 143 участника: 47 пациентов с РА, 45 пациентов с СКВ, 34 пациента с СС и 17 человек без АРЗ и других хронических заболеваний, сопоставимых по полу и возрасту.

Критерии включения в исследование: мужчины и женщины в возрасте от 18 до 78 лет с подтвержденным диагнозом РА, СКВ и СС; отсутствие терапии глюкокортикоидами. Критерии исключения: возраст моложе 18 и старше 78 лет; наличие диагноза сахарный диабет; декомпенсированные почечная или печеночные недостаточности, хроническая сердечная недостаточность III-IV класс NYHA. Исследование проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией 1975 г. и ее пересмотренной версией 2013 г. Протокол исследования одобрен Локальным этическим комитетом ФГБНУ НИИР им. В.А. Насоновой 10 февраля 2022 г. Все участники предоставили письменные информированные согласия до включения в исследование.

Забор цельной крови, которая была использована для выделения первичной культуры моноцитов, производили утром натощак в стерильные вакуумные пробирки, поверхность которых покрыта дикалием ЭДТА (конечная концентрация ЭДТА 18,0 мг; Bection Dickinson and Company, США). Для выделения первичной культуры моноцитов была использована стандартная методика получения лейкоцитарной фракции в градиенте фиколла (НПП «ПанЭко», Россия) с дальнейшей магнитной сепарацией CD14⁺ клеток на колонках (Miltenyi Biotec Inc., США) с помощью парамагнитных наночастиц (Miltenyi Biotec Inc., США). После выделения CD14⁺ моноциты культивировали в количестве 500 000 клеток в первой лунке в течение 24 часов в чистой среде X-VIVO 10 с L-глутамином, гентамицином и феноловым красным (Lonza, Германия) для последующего определения базальной секреции и во второй лунке с добавлением липополисахарида (ЛПС) Escherichia coli О111:В4 (Sigma-Aldrich, США) для последующего определения ЛПС-стимулированной секреции. Концентрация ЛПС была подобрана с использованием литературных данных и составила 1 мкг/мл [4]. В качестве фактора дифференцировки в макрофаги использовали макрофагальный фактор роста M-CSF (SIGMA-ALDRICH, США), который добавляли к культуральной среде в концентрации 50 нг/мл.

После 24 часов инкубации была получена культуральная жидкость для проведения оценки секреции IL-8 макрофагами с использованием коммерческих наборов Human IL-8/CXCL8 DuoSet ELISA (R&D Systems Inc., США).

Статистический анализ данных, полученных в ходе исследования, был проведен с использованием языка программирования R для статистических вычислений. Для статистической обработки были использованы следующие библиотеки: outliers, readxl, psych, ggplot2, FSA, car, ggstatsplot; команды: ggbetweenstats, kruskal.test, pairwise.wilcox.test, dunnTest. Данные представлены в виде медианы и квартилей – Me (Q_0,25-Q_0,75), в виде среднего значения и стандартного отклонения – Mean (SD).

Результаты и обсуждение

Возраст, длительность заболевания, распределение по полу и основные маркеры воспаления пациентов с РА, СКВ и СС, а также контрольной группы, представлены в таблице 1.

 

ТАБЛИЦА 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПАЦИЕНТОВ С РА, СКВ, СС И КОНТРОЛЬНОЙ ГРУППЫ, MEAN (SD)

TABLE 1. GENERAL CHARACTERISTICS OF PATIENTS WITH RA, SLE, SSC AND THE CONTROL GROUP, MEAN (SD)

	РА RA n = 47	СКВ SLE n = 45	СС SSc n = 34	Контроль Control n = 17
Возраст, лет Age, years	55 (13)	41 (13)	50 (12)	48 (10)
Длительность заболевания, годы Duration of disease, years	5,1 (6,7)	8,5 (9,0)	6,5 (6,1)	–
Пол, ж/м, % Gender, f/m, %	73,6/26,4	86,7/13,3	85,3/14,7	76,5/23,5
СРБ, мг/л CRP, mg/L	29 (45)**	6 (16)	5 (10)	2 (1)
СОЭ, мм/ч ESR, mm/h	44 (40)***	24 (31)**	14 (11)*	5 (3)

Примечание. Данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения (Mean (SD)). РА – ревматоидный артрит, СКВ – системная красная волчанка, СС – системный склероз, СРБ – С-реактивный белок, СОЭ – скорость оседания эритроцитов; * – уровень значимости по отношению к контрольной группе p < 0,05; ** – уровень значимости по отношению к контрольной группе p < 0,01; *** – уровень значимости по отношению к контрольной группе p < 0,001.

Note. Data are presented as mean and standard deviation (Mean (SD)). RA, rheumatoid arthritis; SLE, systemic lupus erythematosus; Ssc, systemic sclerosis; CRP, C-reactive protein; ESR, erythrocyte sedimentation rate; *, significance level in relation to the control group p < 0.05; **, significance level in relation to the control group p < 0.01; ***, significance level in relation to the control group p < 0.001.

 

Важной характеристикой для АРЗ является возраст пациентов. Было обнаружено статистически значимое различие по возрасту между группами РА и СКВ (p < 0,001), между группами СКВ и СС (p = 0,01). Исследуемые заболевания отличны по своей манифестации, так как РА чаще всего диагностируется в 40-55 лет, а для СКВ характерно раннее начало, при этом пик заболеваемости приходится на 15-25 лет. Начало СС наиболее часто встречается в возрасте 30-50 лет. Несмотря на этот факт, между группами пациентов и контрольной группой достоверных различий по возрасту обнаружено не было (p > 0,05).

Другой важной особенностью АРЗ является пол пациентов. Из таблицы 1 видно, что во всех группах преобладает женский пол, что связано с тем, что АРЗ поражают преимущественно женщин.

Большинство пациентов с РА имели развернутую (51%) и раннюю (38%) стадию заболевания, поздняя стадия заболевания была у 11% пациентов. Также для характеристики заболевания используется индекс воспалительной активности РА – DAS 28 (Disease Activity Score-28). Среднее значение по DAS 28 составило 5,1 (1,4). Активность РА была высокой у большей части пациентов – 57%, умеренной у 28% и низкой у 15%.

Среди группы с СКВ наибольшую часть составили пациенты с хроническим течением заболевания – 71%, подострое и острое течение было характерно для 13% и 16% пациентов соответственно. Средняя активность СКВ характерна для большинства пациентов – 44%, низкая активность заболевания встречается у 27%, высокая у 25% о очень высокая у 4% пациентов.

В группе пациентов с СС большинство пациентов имели лимитированную форму заболевания – 85%, соответственно, остальные 15% пациентов относились к диффузной форме заболевания.

Для оценки воспалительного статуса макрофагов была измерена базальная и ЛПС-стимулированная секреция IL-8. Результаты исследования для всех исследуемых групп представлены в таблице 2.

 

ТАБЛИЦА 2. КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА СЕКРЕЦИИ IL-8 МАКРОФАГАМИ В ИССЛЕДУЕМЫХ ГРУППАХ (пг/мл), Me (Q_0,25-Q_0,75)

TABLE 2. QUANTITATIVE ASSESSMENT OF IL-8 SECRETION BY MACROPHAGES IN THE STUDY GROUPS (pg/mL), Me (Q_0.25-Q_0.75)

	РА RA n = 47	СКВ SLE n = 45	СС SSc n = 34	Контроль Control n = 17	Уровень значимости Significance level
	1	2	3	4
Базальная секреция, пг/мл Basal secretion, pg/mL	37278 (8264-62142)	7660 (4978-31319)	29429 (13192-47089)	8513 (6723-18103)	p1-2 < 0,01 p1-4 < 0,001 p3-4 < 0,01 p2-3 < 0,01
ЛПС-стимулированная секреция, пг/мл LPS-stimulated secretion, pg/mL	148657 (123216-172750)	152097 (131805-175644)	504508 (106094-600938)	307603 (141988-348669)	p1-3 < 0,001 p2-3 < 0,05

Примечание. РА – ревматоидный артрит, СКВ – системная красная волчанка, СС – системный склероз, p – уровень значимости.

Note. RA, rheumatoid arthritis; SLE, systemic lupus erythematosus; Ssc, systemic sclerosis; p, significance level.

 

Полученные результаты демонстрируют, что базальная секреция IL-8 макрофагами значимо выше в группе пациентов с РА по сравнению с группой СКВ и контрольной группой (p < 0,01 и p < 0,001 соответственно). ЛПС-стимулированная секреция IL-8 макрофагами имеет статистически значимые различия между группами РА и СС (p < 0,001), СКВ и СС (p < 0,05). Известно, что IL-8 является одним из основных хемоаттрактантов нейтрофилов и иммунных клеток, которые активно участвуют в патогенезе АРЗ. При РА увеличенная секреция IL-8 приводит не только к привлечению лейкоцитов в синовиальную оболочку, но и к активации остеакластоподобных клеток из мононуклеарных клеток периферической крови [11]. Также установлено, что концентрация IL-8 увеличена в сыворотке крови и синовиальной оболочке у пациентов с РА, что способствует нарушению ангиогенеза при РА [7].

При этом базальная и ЛПС-стимулированная секреция IL-8 макрофагами у пациентов с СКВ не имеет значимых по отношению к группе лиц без АРЗ. Для СКВ нет однозначных данных об изменении секреции IL-8. В одном из исследований у пациентов с СКВ обнаруживаются увеличенные уровни IL-8 в плазме, которые положительно коррелируют с активностью заболевания [14]. В другом исследовании показано, что концентрация IL-8 в сыворотке крови не отличается между группой СКВ и контрольными лицами [3].

Также нами были выявлены высокие уровни базальной секреции для группы с СС, которые значимо отличаются от группы с СКВ (p < 0,001) и контрольной группы (p < 0,001). ЛПС-стимулированная секреция IL-8 макрофагами у пациентов с СС имеет достоверно более высокие значения по сравнению с группой пациентов с РА (p < 0,001) и СКВ (p < 0,05). IL-8 обладает множественными эффектами в патогенезе СС, например, активация фибробластов и ангиогенеза, которые приводят к повреждению сосудов. В исследовании спонтанной и ЛПС/IFNγ-стимулированной экспрессии IL-8 циркулирующими моноцитами показано увеличение данного показателя [5].

Провоспалительную активацию макрофагов рассчитывали как отношение ЛПС-стимулированной секреции к базальной секреции IL-8.

Провоспалительная активация макрофагов была статистически значимо ниже в группе с РА по сравнению с контрольной группой и группой пациентов с СКВ, для группы пациентов с СС сниженные значения данного показателя по отношению к контрольной группе (рис. 1).

 

Рисунок 1. Сравнение провоспалительной активации макрофагов по IL-8 во всех исследуемых группах

Примечание. p – уровень значимости, РА – ревматоидный артрит, СКВ – системная красная волчанка, СС – системный склероз, К – контрольная группа.

Figure 1. Comparison of pro-inflammatory activation of macrophages by IL-8 in all study groups

Note. p, level of significance; RA, rheumatoid arthritis; SLE, systemic lupus erythematosus; SS, systemic sclerosis; K, control group.

 

Снижение уровня провоспалительной активации макрофагов можно объяснить высокими значениями базальной секреции IL-8 макрофагами у пациентов с РА и СС. При этом ЛПС-стимулированная секреция IL-8 макрофагами у пациентов с РА не имела статистически значимых отличий по сравнению с контрольной группой. Для пациентов с СС, наоборот, показаны высокие значения ЛПС-стимулированной секреции IL-8 макрофагами. Предыдущие исследования по изучению провоспалительной активации циркулирующих моноцитов также демонстрируют снижение данного показателя у пациентов с РА [8].

Заключение

В настоящем исследовании выявлено, что высокая базальная секреция IL-8 макрофагами в группе пациентов с РА обуславливает низкие уровни секреции данного провоспалительного цитокина после стимуляции ЛПС. Истощение макрофагов после выброса основного количества цитокина может участвовать в нарушении иммунного ответа, что в итоге приводит к развитию хронического воспаления при РА. Несмотря на высокие уровни ЛПС-стимулированной секреции IL-8 макрофагами в группе СС также наблюдается снижение провоспалительной активации вследствие высокого уровня базальной секреции. Высокие уровни базальной секреции IL-8 могут свидетельствовать о том, что гиперсекреция данного провоспалительного цитокина макрофагами может быть одним из важных патогенетических факторов развития РА и СС. Дальнейшие исследования, направленные на изучение механизмов участия IL-8 в развитии хронического воспаления при АРЗ могут стать основой для разработки терапевтических стратегий в отношении этих заболеваний.

Публикация размещена при участии Балтийского федерального университета им. И. Канта.

Об авторах

А. И. Богатырева

ГНЦ РФ ФГБНУ «Российский научный центр хирургии имени академика Б.В. Петровского»

Автор, ответственный за переписку.
Email: nastya.bogatyreva.96@mail.ru

научный сотрудник лаборатории клеточной и молекулярной патологии сердечно-сосудистой системы 

Россия, 119435, Москва, Абрикосовский пер. 2

Д. Г. Киселева

ГНЦ РФ ФГБНУ «Российский научный центр хирургии имени академика Б.В. Петровского»; ФГБОУ ВО «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова»

Email: nastya.bogatyreva.96@mail.ru

младший научный сотрудник кафедры биофизики биологического факультета ФГБОУ ВО «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова»; младший научный сотрудник лаборатории клеточной и молекулярной патологии сердечно-сосудистой системы ГНЦ РФ ФГБНУ «Российский научный центр хирургии имени академика Б.В. Петровского»

Россия, 119435, Москва, Абрикосовский пер. 2; Москва

В. Р. Чередниченко

ГНЦ РФ ФГБНУ «Российский научный центр хирургии имени академика Б.В. Петровского»

Email: nastya.bogatyreva.96@mail.ru

младший научный сотрудник лаборатории клеточной и молекулярной патологии сердечно-сосудистой системы 

Россия, 119435, Москва, Абрикосовский пер. 2

Ю. В. Маркина

ГНЦ РФ ФГБНУ «Российский научный центр хирургии имени академика Б.В. Петровского»

Email: nastya.bogatyreva.96@mail.ru

к.м.н., старший научный сотрудник лаборатории клеточной и молекулярной патологии сердечно-сосудистой системы 

Россия, 119435, Москва, Абрикосовский пер. 2

Т. В. Кириченко

ГНЦ РФ ФГБНУ «Российский научный центр хирургии имени академика Б.В. Петровского»

Email: nastya.bogatyreva.96@mail.ru

к.м.н., старший научный сотрудник лаборатории клеточной и молекулярной патологии сердечно-сосудистой системы 

Россия, 119435, Москва, Абрикосовский пер. 2

Список литературы

Дополнительные файлы