Features of proinflammatory activation of macrophages in patients with rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus

Full Text

Работа выполнена при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (НИОКТР № 123030700026-8).

Введение

Аутоиммунные ревматические заболевания (АРЗ) – это хронические состояния, при которых происходит аномальная активация иммунной системы, что приводит к поражению кожи и внутренних органов, инвалидности и преждевременной смертности. Эпидемиологические исследования демонстрируют, что данные патологии охватывают от 3% до 5% населения [10]. Одними из наиболее распространенных АРЗ являются ревматоидный артрит (РА), системная красная волчанка (СКВ) и системный склероз (СС). Несмотря на то, что точный патогенез АРЗ остается неизвестным, важно отметить, что сочетание генетических, иммунологических, гормональных и экологических факторов приводит к возникновению АРЗ [15]. Установлено, что компонентами врожденного иммунитета, моноциты и макрофаги, играют решающую роль в развитии, прогрессировании и разрешении АРЗ за счет миграции в очаг воспаления, удаления аутоантигенов, секреции провоспалительных цитокинов и хемокинов. Эти события приводят к активации Т- и В-клеток, которые атакуют здоровые ткани и вызывают хроническое воспаление [9].

РА характеризуется хроническим воспалением, которое приводит к разрушению суставов и хрящей. Было обнаружено, что число макрофагов синовиальной оболочки положительно коррелирует со степенью эрозии суставов и служит ранним признаком развития РА [15]. Кроме того, за счет продукции фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) макрофаги опосредуют хемотаксис и пролиферацию эндотелиальных клеток в синовиальной оболочке, что способствует образованию паннуса и дополнительной инфильтрации воспалительных клеток в суставе [12].

СКВ – это хроническое системное аутоиммунное заболевание, при котором происходит накопление иммунных комплексов и поражение внутренних органов и кожи. Нарушение активации циркулирующих и тканевых макрофагов является важным фактором для возникновения и прогрессирования СКВ. При этом механизм активации макрофагов в настоящее время неясен [1].

Для СС характерно развитие фиброза кожи и внутренних органов, а также васкулопатия. При СС макрофаги могут участвовать в образовании фиброза за счет выработки провоспалительных цитокинов [2].

Аномальная активация макрофагов приводит к повышенной секреции провоспалительных цитокинов и хемокинов, в том числе IL-1β, TNFα и IL-8. IL-8, продуцируемый моноцитами, макрофагами, нейтрофилами, эндотелиальными клетками и фибробластами, является одним из основных провоспалительных цитокинов, который способен привлекать полиморфноядерные нейтрофилы и другие иммунные клетки в очаг воспаления, что приводит к развитию системного воспаления. При этом секреция IL-8 часто стимулируется IL-1β и TNFα, что приводит к хронизации процесса воспаления [6]. Отмечено увеличение экспрессии IL-8 при АРЗ, которое коррелирует с тяжестью заболевания [13]. Целью настоящего исследования была оценка воспалительного ответа макрофагов в отношении секреции IL-8 у пациентов с РА, СКВ и СС.

Материалы и методы

Исследование включало в себя 143 участника: 47 пациентов с РА, 45 пациентов с СКВ, 34 пациента с СС и 17 человек без АРЗ и других хронических заболеваний, сопоставимых по полу и возрасту.

Критерии включения в исследование: мужчины и женщины в возрасте от 18 до 78 лет с подтвержденным диагнозом РА, СКВ и СС; отсутствие терапии глюкокортикоидами. Критерии исключения: возраст моложе 18 и старше 78 лет; наличие диагноза сахарный диабет; декомпенсированные почечная или печеночные недостаточности, хроническая сердечная недостаточность III-IV класс NYHA. Исследование проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией 1975 г. и ее пересмотренной версией 2013 г. Протокол исследования одобрен Локальным этическим комитетом ФГБНУ НИИР им. В.А. Насоновой 10 февраля 2022 г. Все участники предоставили письменные информированные согласия до включения в исследование.

Забор цельной крови, которая была использована для выделения первичной культуры моноцитов, производили утром натощак в стерильные вакуумные пробирки, поверхность которых покрыта дикалием ЭДТА (конечная концентрация ЭДТА 18,0 мг; Bection Dickinson and Company, США). Для выделения первичной культуры моноцитов была использована стандартная методика получения лейкоцитарной фракции в градиенте фиколла (НПП «ПанЭко», Россия) с дальнейшей магнитной сепарацией CD14⁺ клеток на колонках (Miltenyi Biotec Inc., США) с помощью парамагнитных наночастиц (Miltenyi Biotec Inc., США). После выделения CD14⁺ моноциты культивировали в количестве 500 000 клеток в первой лунке в течение 24 часов в чистой среде X-VIVO 10 с L-глутамином, гентамицином и феноловым красным (Lonza, Германия) для последующего определения базальной секреции и во второй лунке с добавлением липополисахарида (ЛПС) Escherichia coli О111:В4 (Sigma-Aldrich, США) для последующего определения ЛПС-стимулированной секреции. Концентрация ЛПС была подобрана с использованием литературных данных и составила 1 мкг/мл [4]. В качестве фактора дифференцировки в макрофаги использовали макрофагальный фактор роста M-CSF (SIGMA-ALDRICH, США), который добавляли к культуральной среде в концентрации 50 нг/мл.

После 24 часов инкубации была получена культуральная жидкость для проведения оценки секреции IL-8 макрофагами с использованием коммерческих наборов Human IL-8/CXCL8 DuoSet ELISA (R&D Systems Inc., США).

Статистический анализ данных, полученных в ходе исследования, был проведен с использованием языка программирования R для статистических вычислений. Для статистической обработки были использованы следующие библиотеки: outliers, readxl, psych, ggplot2, FSA, car, ggstatsplot; команды: ggbetweenstats, kruskal.test, pairwise.wilcox.test, dunnTest. Данные представлены в виде медианы и квартилей – Me (Q_0,25-Q_0,75), в виде среднего значения и стандартного отклонения – Mean (SD).

Результаты и обсуждение

Возраст, длительность заболевания, распределение по полу и основные маркеры воспаления пациентов с РА, СКВ и СС, а также контрольной группы, представлены в таблице 1.

 

ТАБЛИЦА 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПАЦИЕНТОВ С РА, СКВ, СС И КОНТРОЛЬНОЙ ГРУППЫ, MEAN (SD)

TABLE 1. GENERAL CHARACTERISTICS OF PATIENTS WITH RA, SLE, SSC AND THE CONTROL GROUP, MEAN (SD)

	РА RA n = 47	СКВ SLE n = 45	СС SSc n = 34	Контроль Control n = 17
Возраст, лет Age, years	55 (13)	41 (13)	50 (12)	48 (10)
Длительность заболевания, годы Duration of disease, years	5,1 (6,7)	8,5 (9,0)	6,5 (6,1)	–
Пол, ж/м, % Gender, f/m, %	73,6/26,4	86,7/13,3	85,3/14,7	76,5/23,5
СРБ, мг/л CRP, mg/L	29 (45)**	6 (16)	5 (10)	2 (1)
СОЭ, мм/ч ESR, mm/h	44 (40)***	24 (31)**	14 (11)*	5 (3)

Примечание. Данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения (Mean (SD)). РА – ревматоидный артрит, СКВ – системная красная волчанка, СС – системный склероз, СРБ – С-реактивный белок, СОЭ – скорость оседания эритроцитов; * – уровень значимости по отношению к контрольной группе p < 0,05; ** – уровень значимости по отношению к контрольной группе p < 0,01; *** – уровень значимости по отношению к контрольной группе p < 0,001.

Note. Data are presented as mean and standard deviation (Mean (SD)). RA, rheumatoid arthritis; SLE, systemic lupus erythematosus; Ssc, systemic sclerosis; CRP, C-reactive protein; ESR, erythrocyte sedimentation rate; *, significance level in relation to the control group p < 0.05; **, significance level in relation to the control group p < 0.01; ***, significance level in relation to the control group p < 0.001.

 

Важной характеристикой для АРЗ является возраст пациентов. Было обнаружено статистически значимое различие по возрасту между группами РА и СКВ (p < 0,001), между группами СКВ и СС (p = 0,01). Исследуемые заболевания отличны по своей манифестации, так как РА чаще всего диагностируется в 40-55 лет, а для СКВ характерно раннее начало, при этом пик заболеваемости приходится на 15-25 лет. Начало СС наиболее часто встречается в возрасте 30-50 лет. Несмотря на этот факт, между группами пациентов и контрольной группой достоверных различий по возрасту обнаружено не было (p > 0,05).

Другой важной особенностью АРЗ является пол пациентов. Из таблицы 1 видно, что во всех группах преобладает женский пол, что связано с тем, что АРЗ поражают преимущественно женщин.

Большинство пациентов с РА имели развернутую (51%) и раннюю (38%) стадию заболевания, поздняя стадия заболевания была у 11% пациентов. Также для характеристики заболевания используется индекс воспалительной активности РА – DAS 28 (Disease Activity Score-28). Среднее значение по DAS 28 составило 5,1 (1,4). Активность РА была высокой у большей части пациентов – 57%, умеренной у 28% и низкой у 15%.

Среди группы с СКВ наибольшую часть составили пациенты с хроническим течением заболевания – 71%, подострое и острое течение было характерно для 13% и 16% пациентов соответственно. Средняя активность СКВ характерна для большинства пациентов – 44%, низкая активность заболевания встречается у 27%, высокая у 25% о очень высокая у 4% пациентов.

В группе пациентов с СС большинство пациентов имели лимитированную форму заболевания – 85%, соответственно, остальные 15% пациентов относились к диффузной форме заболевания.

Для оценки воспалительного статуса макрофагов была измерена базальная и ЛПС-стимулированная секреция IL-8. Результаты исследования для всех исследуемых групп представлены в таблице 2.

 

ТАБЛИЦА 2. КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА СЕКРЕЦИИ IL-8 МАКРОФАГАМИ В ИССЛЕДУЕМЫХ ГРУППАХ (пг/мл), Me (Q_0,25-Q_0,75)

TABLE 2. QUANTITATIVE ASSESSMENT OF IL-8 SECRETION BY MACROPHAGES IN THE STUDY GROUPS (pg/mL), Me (Q_0.25-Q_0.75)

	РА RA n = 47	СКВ SLE n = 45	СС SSc n = 34	Контроль Control n = 17	Уровень значимости Significance level
	1	2	3	4
Базальная секреция, пг/мл Basal secretion, pg/mL	37278 (8264-62142)	7660 (4978-31319)	29429 (13192-47089)	8513 (6723-18103)	p1-2 < 0,01 p1-4 < 0,001 p3-4 < 0,01 p2-3 < 0,01
ЛПС-стимулированная секреция, пг/мл LPS-stimulated secretion, pg/mL	148657 (123216-172750)	152097 (131805-175644)	504508 (106094-600938)	307603 (141988-348669)	p1-3 < 0,001 p2-3 < 0,05

Примечание. РА – ревматоидный артрит, СКВ – системная красная волчанка, СС – системный склероз, p – уровень значимости.

Note. RA, rheumatoid arthritis; SLE, systemic lupus erythematosus; Ssc, systemic sclerosis; p, significance level.

 

Полученные результаты демонстрируют, что базальная секреция IL-8 макрофагами значимо выше в группе пациентов с РА по сравнению с группой СКВ и контрольной группой (p < 0,01 и p < 0,001 соответственно). ЛПС-стимулированная секреция IL-8 макрофагами имеет статистически значимые различия между группами РА и СС (p < 0,001), СКВ и СС (p < 0,05). Известно, что IL-8 является одним из основных хемоаттрактантов нейтрофилов и иммунных клеток, которые активно участвуют в патогенезе АРЗ. При РА увеличенная секреция IL-8 приводит не только к привлечению лейкоцитов в синовиальную оболочку, но и к активации остеакластоподобных клеток из мононуклеарных клеток периферической крови [11]. Также установлено, что концентрация IL-8 увеличена в сыворотке крови и синовиальной оболочке у пациентов с РА, что способствует нарушению ангиогенеза при РА [7].

При этом базальная и ЛПС-стимулированная секреция IL-8 макрофагами у пациентов с СКВ не имеет значимых по отношению к группе лиц без АРЗ. Для СКВ нет однозначных данных об изменении секреции IL-8. В одном из исследований у пациентов с СКВ обнаруживаются увеличенные уровни IL-8 в плазме, которые положительно коррелируют с активностью заболевания [14]. В другом исследовании показано, что концентрация IL-8 в сыворотке крови не отличается между группой СКВ и контрольными лицами [3].

Также нами были выявлены высокие уровни базальной секреции для группы с СС, которые значимо отличаются от группы с СКВ (p < 0,001) и контрольной группы (p < 0,001). ЛПС-стимулированная секреция IL-8 макрофагами у пациентов с СС имеет достоверно более высокие значения по сравнению с группой пациентов с РА (p < 0,001) и СКВ (p < 0,05). IL-8 обладает множественными эффектами в патогенезе СС, например, активация фибробластов и ангиогенеза, которые приводят к повреждению сосудов. В исследовании спонтанной и ЛПС/IFNγ-стимулированной экспрессии IL-8 циркулирующими моноцитами показано увеличение данного показателя [5].

Провоспалительную активацию макрофагов рассчитывали как отношение ЛПС-стимулированной секреции к базальной секреции IL-8.

Провоспалительная активация макрофагов была статистически значимо ниже в группе с РА по сравнению с контрольной группой и группой пациентов с СКВ, для группы пациентов с СС сниженные значения данного показателя по отношению к контрольной группе (рис. 1).

 

Рисунок 1. Сравнение провоспалительной активации макрофагов по IL-8 во всех исследуемых группах

Примечание. p – уровень значимости, РА – ревматоидный артрит, СКВ – системная красная волчанка, СС – системный склероз, К – контрольная группа.

Figure 1. Comparison of pro-inflammatory activation of macrophages by IL-8 in all study groups

Note. p, level of significance; RA, rheumatoid arthritis; SLE, systemic lupus erythematosus; SS, systemic sclerosis; K, control group.

 

Снижение уровня провоспалительной активации макрофагов можно объяснить высокими значениями базальной секреции IL-8 макрофагами у пациентов с РА и СС. При этом ЛПС-стимулированная секреция IL-8 макрофагами у пациентов с РА не имела статистически значимых отличий по сравнению с контрольной группой. Для пациентов с СС, наоборот, показаны высокие значения ЛПС-стимулированной секреции IL-8 макрофагами. Предыдущие исследования по изучению провоспалительной активации циркулирующих моноцитов также демонстрируют снижение данного показателя у пациентов с РА [8].

Заключение

В настоящем исследовании выявлено, что высокая базальная секреция IL-8 макрофагами в группе пациентов с РА обуславливает низкие уровни секреции данного провоспалительного цитокина после стимуляции ЛПС. Истощение макрофагов после выброса основного количества цитокина может участвовать в нарушении иммунного ответа, что в итоге приводит к развитию хронического воспаления при РА. Несмотря на высокие уровни ЛПС-стимулированной секреции IL-8 макрофагами в группе СС также наблюдается снижение провоспалительной активации вследствие высокого уровня базальной секреции. Высокие уровни базальной секреции IL-8 могут свидетельствовать о том, что гиперсекреция данного провоспалительного цитокина макрофагами может быть одним из важных патогенетических факторов развития РА и СС. Дальнейшие исследования, направленные на изучение механизмов участия IL-8 в развитии хронического воспаления при АРЗ могут стать основой для разработки терапевтических стратегий в отношении этих заболеваний.

Публикация размещена при участии Балтийского федерального университета им. И. Канта.

About the authors

A. I. Bogatyreva

Petrovsky National Research Centre of Surgery

Author for correspondence.
Email: nastya.bogatyreva.96@mail.ru

Research Associate, Laboratory of Cellular and Molecular Pathology of the Cardiovascular System

Russian Federation, 2 Abrikosovsky Lane, Moscow, 119435

D. G. Kiseleva

Petrovsky National Research Centre of Surgery; Lomonosov Moscow State University

Email: nastya.bogatyreva.96@mail.ru

Junior Research Associate, Department of Biophysics, Faculty of Biology, Lomonosov Moscow State University; Junior Research Associate, Laboratory of Cellular and Molecular Pathology of the Cardiovascular System, Petrovsky National Research Centre of Surgery

Russian Federation, 2 Abrikosovsky Lane, Moscow, 119435; Moscow

V. R. Cherednichenko

Petrovsky National Research Centre of Surgery

Email: nastya.bogatyreva.96@mail.ru

Junior Research Associate, Laboratory of Cellular and Molecular Pathology of the Cardiovascular System

Russian Federation, 2 Abrikosovsky Lane, Moscow, 119435

Yu. V. Markina

Petrovsky National Research Centre of Surgery

Email: nastya.bogatyreva.96@mail.ru

PhD (Medicine), Senior Research Associate, Laboratory of Cellular and Molecular Pathology of the Cardiovascular System

Russian Federation, 2 Abrikosovsky Lane, Moscow, 119435

T. V. Kirichenko

Petrovsky National Research Centre of Surgery

Email: nastya.bogatyreva.96@mail.ru

PhD (Medicine), Senior Research Associate, Laboratory of Cellular and Molecular Pathology of the Cardiovascular System

Russian Federation, 2 Abrikosovsky Lane, Moscow, 119435

References

Supplementary files