Studying the anti-inflammatory activity of  Bifidobacterium bifidum  supernatants and chicken embryo cells on a model of opisthochic invasion

E. G. Kostolomova; Костоломова Е. Г.; P. B. Lozovaya; Лозовая П. Б.; E. D. Polyanskih; Полянских Е. Д.; T. Kh. Timokhina; Тимохина Т. Х.; Ya. I. Paromova; Паромова Я. И.

doi:10.46235/1028-7221-16675-STA

Изучение противовоспалительной активности супернатантов Bifidobacterium bifidum и клеток куриного эмбриона на модели описторхозной инвазии

Авторы: Костоломова Е.Г.¹, Лозовая П.Б.¹, Полянских Е.Д.¹, Тимохина Т.Х.¹, Паромова Я.И.¹
Учреждения:
1. ФГБОУ ВО «Тюменский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ
Выпуск: Том 27, № 2 (2024)
Страницы: 181-186
Раздел: КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
Дата подачи: 27.03.2024
Дата принятия к публикации: 31.03.2024
Дата публикации: 12.08.2024
URL: https://rusimmun.ru/jour/article/view/16675
DOI: https://doi.org/10.46235/1028-7221-16675-STA
ID: 16675

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Морфологические изменения печени, как основного органа, в котором локализуется Opisthorchis felineus, по данным литературы характеризуются значительными структурными изменениями. Так же недавние исследования показывают, что инфекция O. felineus модифицирует иммунную реактивность за счет увеличения синтеза супрессоров иммунного ответа IL10 и TGF-β и снижения уровня провоспалительных маркеров IL-4, IL-5. Эксперимент проведен на 15 сирийских золотых хомячках (Mesocricetus auratus) в возрасте от 4 до 6 недель. Животные были разделены на 3 равные группы. Длительность наблюдения составила 24 дня. Живые метацеркарии Opisthorchis felineus были выделены из зараженной рыбы семейства карповых. Заражение проводилось путем их перорального введения (доза заражения – 50 метацеркариев). Животным в экспериментальных группах при заражении метацеркариями внутрибюшинно параллельно вводили 1 мл исследуемых супернатантов. Гистологический материал обработан стандартными методами. Гистологические препараты исследованы методами светооптической микроскопии с иммерсией, видеомикроскопии с морфометрией. В результате исследования установлено, что в острую фазу описторхоза преобладает общая инфильтрация области портального тракта. Клеточный состав инфильтратов характеризовался наличием лимфоцитов, макрофагов, фибробластов, эпителиоидных клеток и клеток инородных тел. Описанные изменения клеток связаны с локальным снижением доступа кислорода к гепатоцитам периферической зоны дольки из-за их сдавления фиброзной тканью. В печени экспериментальных групп отмечались лишь тканеспецифические изменения, а поражения гепатоцитов были наименее выраженные в группе с введением супернатанта B. bifidum. Цитокиновый профиль в контрольной группе соответствовал Th1-варианту. В экспериментальной группе 1 при применении супернатанта B. bifidum в сравнении с контролем в 4 раза уменьшалась способность лимфоцитов продуцировать основной провоспалительный цитокин – TNFα, также супрессирующий эффект наблюдался в отношении IL-1β, IL-2, IL-6, IL-8, IFNγ. Вместе с тем наблюдалось угнетение продукции основного противовоспалительного цитокина IL-10, при этом в сравнении с контролем увеличивается уровень IL-4, IL-5. При применении супернатанта клеток куриного эмбриона, мы наблюдали схожие результаты с 1-й группой: супрессирующий эффект в отношении провоспалительных и активацию продукции противовоспалительных цитокинов. Уровень IL-17 снижался в обеих экспериментальных группах. Активация продукции противовоспалительных цитокинов в обеих экспериментальных группах модулирует иммунный ответ в сторону Th2, что способствует блокированию воспалительных эффектов.

Ключевые слова

Bifidobacterium bifidum, клетки куриного эмбриона, Opisthorchis felineus, печень, цитокины

Полный текст

Введение

Описторхоз из группы биогельминтозов считается эндемичным и гиперэндемичным заболеванием [1]. Большая часть мирового ареала описторхоза находится на территории России. Самые крупные очаги находятся на территории Ханты-Мансийского и Ямало-Ненецкого автономных округов, а также Тюменской, Томской, Омской и Новосибирской областей [5]. Естественное течение инфекции Opisthorchis felineus характеризуется острой фазой, сопровождающейся миграцией ювенильного паразита через стенку кишечника в паренхиму печени, и хронической фазой, в которой зрелые паразиты обструктируют и вызывают воспаление желчевыводящих путей. На обеих стадиях заболевание оказывает большое влияние на здоровье человека вследствие своей высокой патогенности и иммуномодуляции [3]. Недавние исследования показывают, что описторхозная инвазия модифицирует иммунную реактивность за счет увеличения синтеза супрессоров иммунного ответа IL10 и TGF-β и снижения уровня провоспалительных маркеров IL-4, IL-5 [4]. В настоящее время важно понимать взаимодействие между паразитами, кишечной микробиотой и их влияние на здоровье хозяина. Кроме того, было описано, что Opisthorchis felineus может модулировать иммунную систему и ее реакцию на различные антигены, в том числе антигены резидентных бактерий, составляющих микробиоту кишечника [6].

Цель исследования – оценить и сравнить противовоспалительную активность супернатанта Bifidobacterium bifidum и клеток куриного эмбриона на модели сирийских золотистых хомячков, зараженных Opisthorchis felineus в эксперименте in vivo.

Материалы и методы

Живые метацеркарии были выделены Opisthorchis felineus (Of) из зараженной рыбы семейства карповых. Супернатант Bifidobacterium bifidum (Bb) получали по ранее описанной методике [2]. Для получения супернатанта клеток куриного эмбриона (ККЭ) использовали авторскую методику [7]. Эксперимент проведен на 15 сирийских золотых хомячках (Mesocricetus auratus) в возрасте от 4 до 6 недель. Животные были разделены на 3 равные группы по 5 особей в каждой:

Контрольная группа (КГ), зараженные метацеркариями Of.
Экспериментальная группа 1 (ЭГ 1), зараженные метацеркариями Of с внутрибрюшинным введением Bb (1 мл).
Экспериментальная группа (ЭГ 2), зараженные метацеркариями Of с внутрибрюшинным введением KКЭ (1 мл).

Заражение проводилось путем перорального введения метацеркариев Of всем трем группам (доза заражения: 50 метацеркариев). Длительность наблюдения составила 24 дня, во время которых экспериментальные группы ежедневно получали по 3 капли Bb и ККЭ перорально. Условия содержания, экспериментальной работы и вывода животных из эксперимента соответствовали Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (1986), и российскому законодательству (ГОСТ 33215-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными» от 01.07.2016). По истечению времени эксперимента была изъята печень и кровь хомячков всех групп для гистологического исследования и определения количества цитокинов. Для описательной морфологии органа использовали метод световой микроскопии. Гистологические препараты изучали с использованием бинокулярного светового микроскопа. Срезы изготавливались с помощью автоматического ротационного микротома Leica RM 2255 («Лейка Биосистемс Нуслох ГмбХ», Германия. Толщина 5 мкм. Межгрупповое сравнение данных проводили в соответствии протоколом «Морфологические ведомости» – Morphological Newsletter: 2022 Том (Volume) 30 Выпуск (Issue) с помощью непараметрического критерия Манна–Уитни (U) для парных выборок с ненормальным распределением, при уровне доверительной вероятности р ≤ 0,05.

Количество Th1 (IL-1, IL-2, IFNγ, TNFα, IL- 6, IL-8) и Th2 (IL-4, IL-10) и Th17 (IL-17) цитокинов в сыворотке крови определяли с помощью панели Bio-Plex Pro™ Mouse Cytokine 23-plex для анализа цитокинов мыши (M60009RDPD) методом xMAP мультиплексного ИФА. При помощи анализатора Bio-Plex (Luminex) 200, MAGPIX.

Все статистические анализы проводились с использованием SPSS версии 15 для Windows (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс, США). Значение p менее 0,05 считалось значимой разницей.

Результаты и обсуждение

Патоморфологическое изучение печени контрольной группы (рис. 1А, см. 3-ю стр. обложки) показало выраженные органо- и тканеспецифические изменения в виде нарушения структур классических долек за счет гиперплазии соединительной ткани из области портальных трактов. Вследствие чего часть долек имеет нетипичную форму и уменьшенные размеры. Синусоидные капилляры расширены, стенки крупных желчных протоков утолщены, в них сформировались паразитарные гранулемы, в центре которых обнаруживались яйца описторхов, лимфоциты, плазматические и эпителиоидные клетки, эозинофилы. Тканеспецифические изменения обусловили появление гепатоцитов крупных размеров, имеющих полигональную и округлую формы, со светлой, почти неокрашенной, набухшей цитоплазмой и одним круглым базофильным ядром. Описанные изменения клеток связаны с локальным снижением доступа кислорода к гепатоцитам периферической зоны дольки из-за их сдавления фиброзной тканью. Развитие фиброзных изменений печени коррелировало с количеством провоспалительных цитокинов TNFα (r = 0,78), IL-6 (r = 0,75), IL-1β (r = 0,71), IL-8 (r = 0,51).

Рисунок 1. Патоморфологическое изменение печени в изучаемых группах при заражении Opisthorchis felineus

Примечание. Гистологические срезы печени. Толщина 5 мм. Исходное увеличение, ×1000, масштабная линейка 10 мкм. А – контрольная группа. Б – экспериментальная группа 1. В – экспериментальная группа 2. Взрослый червь (стрелка) в печени контрольной группы. При исследовании печени экспериментальных групп заражения не наблюдалось.

Figure 1. Pathomorphological changes in the liver in the studied groups during infection with Opisthorchis felineus

Note. Histological sections of the liver. Thickness 5 mm. Original magnification, ×1000, scale bar 10 µm. A, control group. B, Experimental group 1. C, Experimental group 2. Adult worm (arrow) in the liver of the control group. When examining the livers of the experimental groups, no contamination was observed.

В печени экспериментальных групп (рис. 1Б, В, см. 3-ю стр. обложки) отмечались лишь тканеспецифические изменения. Поражения гепатоцитов наименее выраженные у ЭГ 1 (рис. 1Б, см. 3-ю стр. обложки).

При оценке результатов было установлено, что профиль и уровень цитокинов изменялся в зависимости от вводимого супернатанта (рис. 2). В контрольной группе наблюдалось повышение количества провоспалительных цитокинов. В экспериментальной группе ЭГ 1 в сравнении с контролем в 4 раза уменьшалась способность лимфоцитов продуцировать основной провоспалительный цитокин TNFα. Супрессирующий эффект наблюдался и в отношении IL-1β, IL-2, IL-6, IL-8, IFNγ (на 83,9±0,2; 43,1±0,3; 73,7±1,0; 48,0±1,1; 82,2±0,7% соответственно). Вместе с тем отмечалось угнетение продукции основного противовоспалительного цитокина IL-10 на 64±1,04%, но при этом в сравнении с контролем увеличивался уровень IL-4, IL-5 на 87,5±0,2 и 95,9±0,2% соответственно. После введения ККЭ в ЭГ 2 мы наблюдали схожие результаты с ЭГ 1: супрессирующий эффект в отношении провоспалительных цитокинов (IL-1β, IL-2, IL-6, IL-8, IFNγ на 80,8±0,1; 63,3±0,5; 71,0±1,1; 40,7±1,5; 69,3±1,4% соответственно), активацию продукции лимфоцитами IL-4 и IL-5 на 40,6±0,9% и 80,6±0,3% в сравнении с контролем. Уровень IL- 17 снижался в обеих ЭГ, причем в ЭГ 1 в 10 раз (на 89,9±0,8%), а в ЭГ 2 в 5 раз (на 80,8±1,2%), что объясняется тем, что IL-17 располагается в слизистой оболочке кишечника, которую в большей степени населяют Bb. Активация продукции противовоспалительных цитокинов в обеих группах модулирует иммунный ответ в сторону Th2, что способствует блокированию воспалительных эффектов.

Рисунок 2. Профиль и уровень цитокинов в сыворотке крови животных

Примечание. Уровень и профиль цитокинов, изменялся в зависимости от вводимого супернатанта. Представлены результаты среднего значения из пяти независимых экспериментов, планки погрешности соответствуют стандартной ошибке среднего. Статистическая достоверность различий опытных групп с контрольными проверялась с использованием t критерия Стьюдента, * соответствуют p < 0,05, n = 5.

Figure 2. Profile and level of cytokines in animal blood serum

Note. The level and profile of cytokines changed depending on the administered supernatant. Results are shown as the average of five independent experiments, with error bars representing the standard error of the mean. The statistical significance of the differences between the experimental groups and the control groups was tested using Student’s t test, * corresponds to p < 0.05, n = 5.

Заключение

Морфологическую картину печени при развивающемся описторхозе можно охарактеризовать как тенденцию к увеличению проявлений тканевой атипии. В острой фазе гепатоциты печеночных долек, лежащие периферически, имеют более выраженные изменения, по сравнению с центральными. Это свидетельствует о нарушении функционального состояния печени.

Введение супернатантов Bifidobacterium bifidum и клеток куриного эмбриона предупреждает проникновение Opisthorchis felineus в печень экспериментальных животных. Супернатанты Bifidobacterium bifidum более активно снижают количество провоспалительных цитокинов, чем супернатанты клеток куриного эмбриона.

Активация продукции противовоспалительных цитокинов в обеих экспериментальных группах модулирует иммунный ответ в сторону Th2, что способствует блокированию воспалительных эффектов и, возможно, предотвращению образования фиброзных изменений в печени при описторхозной инвазии.

Таким образом, результаты проведенного пилотного исследования применения супернатантов Bifidobacterium bifidum и клеток куриного эмбриона дают основание считать состояние нормальной микробиоты макроорганизма определяющим в предупреждении поражения гепатоцитов при описторхозной инвазии и возможность рассматривать Bifidobacterium bifidum для профилактики описторхозной инвазии.