Studying the anti-inflammatory activity of  Bifidobacterium bifidum  supernatants and chicken embryo cells on a model of opisthochic invasion

E. G. Kostolomova; Костоломова Е. Г.; P. B. Lozovaya; Лозовая П. Б.; E. D. Polyanskih; Полянских Е. Д.; T. Kh. Timokhina; Тимохина Т. Х.; Ya. I. Paromova; Паромова Я. И.

doi:10.46235/1028-7221-16675-STA

Studying the anti-inflammatory activity of Bifidobacterium bifidum supernatants and chicken embryo cells on a model of opisthochic invasion

Authors: Kostolomova E.G.¹, Lozovaya P.B.¹, Polyanskih E.D.¹, Timokhina T.K.¹, Paromova Y.I.¹
Affiliations:
1. Tyumen State Medical University
Issue: Vol 27, No 2 (2024)
Pages: 181-186
Section: SHORT COMMUNICATIONS
Submitted: 27.03.2024
Accepted: 31.03.2024
Published: 12.08.2024
URL: https://rusimmun.ru/jour/article/view/16675
DOI: https://doi.org/10.46235/1028-7221-16675-STA
ID: 16675

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Morphological changes in the liver during infection with Opisthorchis felineus are characterized by significant structural changes. It has been proven that O. felineus modifies immune reactivity by increasing the synthesis of IL-10 and TGF-β and decreasing the levels of IL-4 and IL-5. The experiment was carried out on 15 Mesocricetus auratus aged from 4 to 6 weeks. The animals were divided into 3 equal groups. The duration of observation was 24 days. Live metacercariae of O. felineus were isolated from infected cyprinid fish. Infection was carried out by oral administration of 50 metacercariae. Animals in the experimental groups were injected intraperitoneally with 1 ml of the test supernatants. Histological preparations were examined by video microscopy with morphometry. It has been established that in the acute phase of opisthorchiasis, general infiltration of the portal tract area predominates. The cellular composition of infiltrates is characterized by the presence of lymphocytes, macrophages, fibroblasts, epithelioid cells and foreign body cells. The described cell changes are associated with a local decrease in oxygen access to hepatocytes in the peripheral zone of the lobule due to their compression by fibrous tissue. In the liver of the experimental groups, only tissue-specific changes were noted, and the damage to hepatocytes was the least pronounced in the group with the introduction of B. bifidum supernatant. The cytokine profile in the control group corresponded to the Th1 variant. In experimental group 1, when using the supernatant of B. bifidum, in comparison with the control, the ability of lymphocytes to produce the main pro-inflammatory cytokine, TNFα, decreased 4 times; a suppressive effect was also observed in relation to IL-1β, IL-2, IL-6, IL-8, and IFNγ. Inhibition of IL-10 production was observed, while the level of IL-4 and IL-5 increased in comparison with the control. When using the supernatant of chicken embryo cells, we observed similar results to group 1: a suppressive effect on pro-inflammatory and activation of the production of anti-inflammatory cytokines. IL-17 levels decreased in both experimental groups. Activation of the production of anti-inflammatory cytokines in experimental groups modulates the immune response towards Th2, which helps block inflammatory effects.

Keywords

Bifidobacterium bifidum, chicken embryo cells, Opisthorchis felineus, liver, cytokines

Full Text

Введение

Описторхоз из группы биогельминтозов считается эндемичным и гиперэндемичным заболеванием [1]. Большая часть мирового ареала описторхоза находится на территории России. Самые крупные очаги находятся на территории Ханты-Мансийского и Ямало-Ненецкого автономных округов, а также Тюменской, Томской, Омской и Новосибирской областей [5]. Естественное течение инфекции Opisthorchis felineus характеризуется острой фазой, сопровождающейся миграцией ювенильного паразита через стенку кишечника в паренхиму печени, и хронической фазой, в которой зрелые паразиты обструктируют и вызывают воспаление желчевыводящих путей. На обеих стадиях заболевание оказывает большое влияние на здоровье человека вследствие своей высокой патогенности и иммуномодуляции [3]. Недавние исследования показывают, что описторхозная инвазия модифицирует иммунную реактивность за счет увеличения синтеза супрессоров иммунного ответа IL10 и TGF-β и снижения уровня провоспалительных маркеров IL-4, IL-5 [4]. В настоящее время важно понимать взаимодействие между паразитами, кишечной микробиотой и их влияние на здоровье хозяина. Кроме того, было описано, что Opisthorchis felineus может модулировать иммунную систему и ее реакцию на различные антигены, в том числе антигены резидентных бактерий, составляющих микробиоту кишечника [6].

Цель исследования – оценить и сравнить противовоспалительную активность супернатанта Bifidobacterium bifidum и клеток куриного эмбриона на модели сирийских золотистых хомячков, зараженных Opisthorchis felineus в эксперименте in vivo.

Материалы и методы

Живые метацеркарии были выделены Opisthorchis felineus (Of) из зараженной рыбы семейства карповых. Супернатант Bifidobacterium bifidum (Bb) получали по ранее описанной методике [2]. Для получения супернатанта клеток куриного эмбриона (ККЭ) использовали авторскую методику [7]. Эксперимент проведен на 15 сирийских золотых хомячках (Mesocricetus auratus) в возрасте от 4 до 6 недель. Животные были разделены на 3 равные группы по 5 особей в каждой:

Контрольная группа (КГ), зараженные метацеркариями Of.
Экспериментальная группа 1 (ЭГ 1), зараженные метацеркариями Of с внутрибрюшинным введением Bb (1 мл).
Экспериментальная группа (ЭГ 2), зараженные метацеркариями Of с внутрибрюшинным введением KКЭ (1 мл).

Заражение проводилось путем перорального введения метацеркариев Of всем трем группам (доза заражения: 50 метацеркариев). Длительность наблюдения составила 24 дня, во время которых экспериментальные группы ежедневно получали по 3 капли Bb и ККЭ перорально. Условия содержания, экспериментальной работы и вывода животных из эксперимента соответствовали Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (1986), и российскому законодательству (ГОСТ 33215-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными» от 01.07.2016). По истечению времени эксперимента была изъята печень и кровь хомячков всех групп для гистологического исследования и определения количества цитокинов. Для описательной морфологии органа использовали метод световой микроскопии. Гистологические препараты изучали с использованием бинокулярного светового микроскопа. Срезы изготавливались с помощью автоматического ротационного микротома Leica RM 2255 («Лейка Биосистемс Нуслох ГмбХ», Германия. Толщина 5 мкм. Межгрупповое сравнение данных проводили в соответствии протоколом «Морфологические ведомости» – Morphological Newsletter: 2022 Том (Volume) 30 Выпуск (Issue) с помощью непараметрического критерия Манна–Уитни (U) для парных выборок с ненормальным распределением, при уровне доверительной вероятности р ≤ 0,05.

Количество Th1 (IL-1, IL-2, IFNγ, TNFα, IL- 6, IL-8) и Th2 (IL-4, IL-10) и Th17 (IL-17) цитокинов в сыворотке крови определяли с помощью панели Bio-Plex Pro™ Mouse Cytokine 23-plex для анализа цитокинов мыши (M60009RDPD) методом xMAP мультиплексного ИФА. При помощи анализатора Bio-Plex (Luminex) 200, MAGPIX.

Все статистические анализы проводились с использованием SPSS версии 15 для Windows (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс, США). Значение p менее 0,05 считалось значимой разницей.

Результаты и обсуждение

Патоморфологическое изучение печени контрольной группы (рис. 1А, см. 3-ю стр. обложки) показало выраженные органо- и тканеспецифические изменения в виде нарушения структур классических долек за счет гиперплазии соединительной ткани из области портальных трактов. Вследствие чего часть долек имеет нетипичную форму и уменьшенные размеры. Синусоидные капилляры расширены, стенки крупных желчных протоков утолщены, в них сформировались паразитарные гранулемы, в центре которых обнаруживались яйца описторхов, лимфоциты, плазматические и эпителиоидные клетки, эозинофилы. Тканеспецифические изменения обусловили появление гепатоцитов крупных размеров, имеющих полигональную и округлую формы, со светлой, почти неокрашенной, набухшей цитоплазмой и одним круглым базофильным ядром. Описанные изменения клеток связаны с локальным снижением доступа кислорода к гепатоцитам периферической зоны дольки из-за их сдавления фиброзной тканью. Развитие фиброзных изменений печени коррелировало с количеством провоспалительных цитокинов TNFα (r = 0,78), IL-6 (r = 0,75), IL-1β (r = 0,71), IL-8 (r = 0,51).

Рисунок 1. Патоморфологическое изменение печени в изучаемых группах при заражении Opisthorchis felineus

Примечание. Гистологические срезы печени. Толщина 5 мм. Исходное увеличение, ×1000, масштабная линейка 10 мкм. А – контрольная группа. Б – экспериментальная группа 1. В – экспериментальная группа 2. Взрослый червь (стрелка) в печени контрольной группы. При исследовании печени экспериментальных групп заражения не наблюдалось.

Figure 1. Pathomorphological changes in the liver in the studied groups during infection with Opisthorchis felineus

Note. Histological sections of the liver. Thickness 5 mm. Original magnification, ×1000, scale bar 10 µm. A, control group. B, Experimental group 1. C, Experimental group 2. Adult worm (arrow) in the liver of the control group. When examining the livers of the experimental groups, no contamination was observed.

В печени экспериментальных групп (рис. 1Б, В, см. 3-ю стр. обложки) отмечались лишь тканеспецифические изменения. Поражения гепатоцитов наименее выраженные у ЭГ 1 (рис. 1Б, см. 3-ю стр. обложки).

При оценке результатов было установлено, что профиль и уровень цитокинов изменялся в зависимости от вводимого супернатанта (рис. 2). В контрольной группе наблюдалось повышение количества провоспалительных цитокинов. В экспериментальной группе ЭГ 1 в сравнении с контролем в 4 раза уменьшалась способность лимфоцитов продуцировать основной провоспалительный цитокин TNFα. Супрессирующий эффект наблюдался и в отношении IL-1β, IL-2, IL-6, IL-8, IFNγ (на 83,9±0,2; 43,1±0,3; 73,7±1,0; 48,0±1,1; 82,2±0,7% соответственно). Вместе с тем отмечалось угнетение продукции основного противовоспалительного цитокина IL-10 на 64±1,04%, но при этом в сравнении с контролем увеличивался уровень IL-4, IL-5 на 87,5±0,2 и 95,9±0,2% соответственно. После введения ККЭ в ЭГ 2 мы наблюдали схожие результаты с ЭГ 1: супрессирующий эффект в отношении провоспалительных цитокинов (IL-1β, IL-2, IL-6, IL-8, IFNγ на 80,8±0,1; 63,3±0,5; 71,0±1,1; 40,7±1,5; 69,3±1,4% соответственно), активацию продукции лимфоцитами IL-4 и IL-5 на 40,6±0,9% и 80,6±0,3% в сравнении с контролем. Уровень IL- 17 снижался в обеих ЭГ, причем в ЭГ 1 в 10 раз (на 89,9±0,8%), а в ЭГ 2 в 5 раз (на 80,8±1,2%), что объясняется тем, что IL-17 располагается в слизистой оболочке кишечника, которую в большей степени населяют Bb. Активация продукции противовоспалительных цитокинов в обеих группах модулирует иммунный ответ в сторону Th2, что способствует блокированию воспалительных эффектов.

Рисунок 2. Профиль и уровень цитокинов в сыворотке крови животных

Примечание. Уровень и профиль цитокинов, изменялся в зависимости от вводимого супернатанта. Представлены результаты среднего значения из пяти независимых экспериментов, планки погрешности соответствуют стандартной ошибке среднего. Статистическая достоверность различий опытных групп с контрольными проверялась с использованием t критерия Стьюдента, * соответствуют p < 0,05, n = 5.

Figure 2. Profile and level of cytokines in animal blood serum

Note. The level and profile of cytokines changed depending on the administered supernatant. Results are shown as the average of five independent experiments, with error bars representing the standard error of the mean. The statistical significance of the differences between the experimental groups and the control groups was tested using Student’s t test, * corresponds to p < 0.05, n = 5.

Заключение

Морфологическую картину печени при развивающемся описторхозе можно охарактеризовать как тенденцию к увеличению проявлений тканевой атипии. В острой фазе гепатоциты печеночных долек, лежащие периферически, имеют более выраженные изменения, по сравнению с центральными. Это свидетельствует о нарушении функционального состояния печени.

Введение супернатантов Bifidobacterium bifidum и клеток куриного эмбриона предупреждает проникновение Opisthorchis felineus в печень экспериментальных животных. Супернатанты Bifidobacterium bifidum более активно снижают количество провоспалительных цитокинов, чем супернатанты клеток куриного эмбриона.

Активация продукции противовоспалительных цитокинов в обеих экспериментальных группах модулирует иммунный ответ в сторону Th2, что способствует блокированию воспалительных эффектов и, возможно, предотвращению образования фиброзных изменений в печени при описторхозной инвазии.

Таким образом, результаты проведенного пилотного исследования применения супернатантов Bifidobacterium bifidum и клеток куриного эмбриона дают основание считать состояние нормальной микробиоты макроорганизма определяющим в предупреждении поражения гепатоцитов при описторхозной инвазии и возможность рассматривать Bifidobacterium bifidum для профилактики описторхозной инвазии.