Цибридные линии на основе THP-1 с различным митохондриальным геномом имели разный провоспалительный ответ

Полный текст

Введение

Воспаление – это защитная реакция иммунитета на патоген или повреждение. Одним из важных проявлений воспалительной реакции является секреция иммунными клетками провоспалительных цитокинов, таких как TNFα, IL-1β, IL-6, IL-8, CCL2. Это необходимо для рекрутирования в очаг воспаления иммунокомпетентных клеток и активации механизмов устранения патогена [10]. Чтобы избежать апоптоза клеток в результате высоких концентраций цитокинов и, как следствие, повреждения ткани, существует механизм толерантности врожденного иммунитета. Толерантность представляет собой механизм, при котором происходит снижение секреции провоспалительных цитокинов иммунокомпетентных клеток при повторных воздействиях патогена и способствует разрешению воспаления [2]. Если воспаление не может разрешиться, то оно перетекает в хроническое состояние [7].

Современные исследования направлены на изучение роли митохондрий в развитии хронического воспаления [1, 9]. Функциональная активность клеток, участвующих в иммунном ответе, зависит от работы митохондрий. Митохондрии представляют собой полуавтономные органеллы, обладающие собственной митохондриальной ДНК (мтДНК). Мутации в мтДНК происходят чаще из-за близости к активным формам кислорода, кольцевой структуры, несовершенной репарации [5]. Поэтому клетке необходимо своевременно устранять поврежденные органеллы. Контроль качества митохондрий осуществляется несколькими механизмами, одним из которых является митофагия. Митофагия обеспечивает селективное удаление поврежденных митохондрий. Снижение эффективности митофагии приводит к накоплению дефектных митохондрий, что в дальнейшем может привести к повышенному уровню секреции провоспалительных цитокинов и, как следствие, чрезмерному воспалению [3, 11].

Удобной моделью для изучения функциональной значимости митохондрий являются цитоплазматические гидриды (цибриды). Цибриды были созданы нашей лабораторией ранее, для этого безмитохондриальные клетки THP-1 слили с тромбоцитами от пациентов. Таким образом, все цибриды несут единый ядерный геном и уникальный митохондриальный геном [6].

Целью настоящего исследования было изучение способности цибридных линий, несущих разный митохондриальный геном, генерировать провоспалительный ответ, а также формировать толерантность.

Материалы и методы

Для изучения взаимосвязи между мутациями мтДНК и воспалительным ответом были выбраны цибридные линии. Для получения цибридных линий на THP-1 воздействовали бромистым этидием для угнетения митохондрий. После того, как в клетках не осталось митохондрий, они кокультивировались с тромбоцитами от пациентов с хроническими заболеваниями. Особенность этих линий в том, что у них единый ядерный геном. Цибридные линии были получены нашей лабораторией ранее [6].

Для воспалительной реакции и толерантности к липополисахариду (LPS) цибридные линии высевали в стерильные 6-луночные планшеты по две лунки в концентрации 1 млн клеток/мл по 2 мл в каждую лунку. В одну из лунок к клеткам добавляли LPS в концентрации 1 мкг/мл. Клетки с LPS инкубировали в течение 4 ч в CO₂-инкубаторе при 37 °С (95% воздуха и 5% CO₂). Через 4 ч клетки откручивали при 300 g в течение 5 мин, отмывали при помощи PBS, добавляли 2 мл RPMI-1640 (10% сыворотки, 100 ед/ мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина) и высевали по 1 мл в 24-луночный планшет. Затем добавляли в одну из лунок LPS в концентрации 1 мкг/ мл. Клетки с LPS инкубировали в течение 20 ч в CO₂-инкубаторе при 37 °С (95% воздуха и 5% CO₂). Спустя 20 ч образцы культуральной среды отбирали в пробирки, центрифугировали в течение 5 минут при 300 g. Супернатант отбирали в отдельные пробирки для оценки секреции панели цитокинов методом ИФА с использованием реагентов R&D Systems. Проведение ИФА согласно протоколу анализа. Оптическую плотность калибраторов и исследуемых образцов измеряли на планшетном ридере CLARIOstar.

Статистический анализ проводили при помощи программного обеспечения SPSS Statistics 26.

Результаты и обсуждение

Мы решили оценить способность исследуемых клеточных линий генерировать провоспалительный ответ при стимуляции LPS, а также дальнейшую способность клеток формировать иммунную толерантность.

Цибриды демонстрировали два уровня провоспалительного ответа: высокий и низкий. Более того, цибриды с высоким провоспалительным ответом можно разделить на те, которые формировали толерантность, и те, которые не формировали толерантность к LPS (рис. 1).

 

Рисунок 1. Провоспалительный ответ и способность формировать толерантность цибридными линиями

Примечание. А – секреция цитокинов TNFα, IL-1β, IL-6, IL-8, CCL2 в ответ на первую и на вторую стимуляцию LPS. По оси Y отмечен провоспалительный ответ на первую стимуляцию LPS, по оси X – на вторую стимуляции. В прямоугольник попали цибриды с низкой секреторной активностью по данному цитокину. Если точка выше линии, то цибридная линия формировала толерантность, если ниже, то не формировала. Б – способность цибридных линий формировать иммунную толерантность при двукратной стимуляции клеток LPS. Слева представлены цибридные линии, сверху цитокины. Пересечения соответствуют типу ответа и способности формировать толерантность для каждой цибридной линии по каждому цитокину. Серый прямоугольник – низкий провоспалительный ответ, белый – высокий провоспалительный ответ, формировали толерантность, черный – высокий провоспалительный ответ, не формировали толерантность.

Figure 1. Pro-inflammatory response and ability to form tolerance in cybrid lines

Note. A, secretion of cytokines TNFα, IL-1β, IL-6, IL-8, CCL2 in response to the first and second LPS stimulation. The Y axis shows the proinflammatory response to the first LPS stimulation, and the X axis to the second stimulation. The rectangle contains cybrids with low secretory activity for this cytokine. If the point is above the line, then the cybrid line has formed tolerance, if below, then it has not. B, the ability of cybrid lines to form immune tolerance upon double stimulation of cells with LPS. On the left are cybrid lines, on top are cytokines. The intersections correspond to the type of response and the ability to form tolerance for each cybrid line for each cytokine. Gray rectangle – low pro-inflammatory response, white – high pro-inflammatory response, tolerance was formed, black – high pro-inflammatory response, tolerance was not formed.

 

Оказалось, что цибридные линии HSM1, HSM2, TC-520, TC-521, TCI-521 не реагировали на секрецию LPS по всем исследуемым цитокинам. TCN-521 не реагировала по четырем цитокинам и не формировал толерантность по IL-8. LSM1, HSMAM2 имели низкую секрецию по IL-1β, IL-6, CCL2 и не формировали толерантность по TNFα, IL-8. LSM2 формировала толерантность по TNFα и по CCL2, не формировала толерантность по IL-1β, IL-6, IL-8. HSMAM3 формировала толерантность по TNFα, IL-1β, IL-6 и не формировала по IL-8, CCL2. HSMAM1, TC-522, TCP-521 формировали по CCL2, и не формировали по TNFα, IL-1β, IL-6, IL-8.

Таким образом, клетки, различающиеся по митохондриальному геному, качественно отличались по типу воспалительной реакции.

Ранее группа ученых провела клиническое исследование и показала, что у пациентов с мутациями или делециями в мтДНК секреция провоспалительных цитокинов TNFα, IL- 6, IL- 1β лейкоцитами была выше в ответ на LPS [4]. Можно предположить, что ответственным за накопление мутация мтДНК могло быть нарушение в митофагии. Более того, было показано, что нарушения в секреции PINK1 и/или PARKIN, ключевых белков митофагии, также вело к повышенному содержанию IL-1β, IL-6, CCL2 [8].

Заключение

В своем исследовании мы продемонстрировали, что клетки, различающиеся между собой только митохондриальным геномом, качественно отличались по типу воспалительной реакции. Наше исследование, безусловно, имеет ряд ограничений. Так, мы не продемонстрировали роль конкретных мутаций мтДНК в нарушениях иммунной реакции, а также не осветили механизмы этих нарушений. Однако, вероятно, митохондриальные мутации, а значит, и митохондриальная дисфункция, действительно могут лежать в основе нарушений функций иммунных клеток. Раскрытие механизмов влияния мутаций мтДНК на формирование иммунного ответа и толерантности представляется крайне перспективным направлением для разработки эффективной и безопасной терапии заболеваний воспалительного генеза.

Благодарности

Авторы выражают благодарность Центру высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины ИБГ РАН, за возможность использования научного оборудования.

Об авторах

А. Д. Журавлев

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии»; Научно-исследовательский институт морфологии человека имени академика А.П. Авцына ФГБНУ «Российский научный центр хирургии имени академика Б.В. Петровского»

Автор, ответственный за переписку.
Email: Zhuravel17@yandex.ru

аспирант, младший научный сотрудник лаборатории ангиопатологии; младший научный сотрудник

Россия, Москва; Москва

С. С. Верхова

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии»; Научно-исследовательский институт морфологии человека имени академика А.П. Авцына ФГБНУ «Российский научный центр хирургии имени академика Б.В. Петровского»

Email: Zhuravel17@yandex.ru

старший лаборант; аспирант

Россия, Москва; Москва

М. В. Кубекина

Центр коллективного пользования и Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины ФГБУН «Институт биологии гена Российской академии наук»

Email: Zhuravel17@yandex.ru

к.б.н., научный сотрудник

Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы