THP1-based cybrid cells with various mtDNA mutations differ by the ability to form inflammatory response

Cover Page


Cite item

Full Text

Abstract

Most age-related human diseases are accompanied by chronic inflammation. Modern research is aimed at studying the principles of the formation of the immune response. The reasons why the local inflammatory reaction cannot be resolved and becomes a sluggish chronic form are still unknown. Immune cells secrete cytokines in response to pathogens. To avoid cell death as a result of high concentrations of cytokines and resulting tissue damage, there is a mechanism of innate immune tolerance. Innate immune tolerance involves a decrease in the secretion of proinflammatory cytokines in response to repeated exposure to a pathogen. It is known that mitochondria play an important role in the formation of the immune response. Consequently, impaired mitochondrial function can lead to impaired immune response. To control the quality of mitochondria in the cell, there is a mechanism – mitophagy. Previously, we have created cybrid lines based on the monocytic cell line THP-1. Cybrids were obtained by fusion of THP-1 cells (mitochondria were removed) with platelets from patients. Each of the cybrid lines had the THP-1 nuclear genome and an individual patient’s mitochondrial genome. In our study, we decided to study the ability of cells carrying different mitochondrial genomes to generate a proinflammatory response, as well as to form tolerance in the future. For this purpose, we chose a model of ecdotoxin tolerance. Thus, we stimulated the cybrid lines twice with lipopolysaccharide and then assessed the secretion of the cytokines TNFα, IL-1β, IL-6, IL-8, and CCL2 using ELISA. The cybrids demonstrated two levels of proinflammatory response: high and low. Moreover, cybrids with a high proinflammatory response either did or did not develop tolerance upon repeated stimulation. In our study, cells that differed from each other only in mitochondrial genome demonstrated three types of reactions upon the induction of immune tolerance to LPS. Future studies will improve our understanding of the mechanisms of mitochondrial involvement in pathological processes. It is likely that studies of deficient mitophagy and the role of certain mtDNA mutations in its development will yield promising results.

Full Text

Введение

Воспаление – это защитная реакция иммунитета на патоген или повреждение. Одним из важных проявлений воспалительной реакции является секреция иммунными клетками провоспалительных цитокинов, таких как TNFα, IL-1β, IL-6, IL-8, CCL2. Это необходимо для рекрутирования в очаг воспаления иммунокомпетентных клеток и активации механизмов устранения патогена [10]. Чтобы избежать апоптоза клеток в результате высоких концентраций цитокинов и, как следствие, повреждения ткани, существует механизм толерантности врожденного иммунитета. Толерантность представляет собой механизм, при котором происходит снижение секреции провоспалительных цитокинов иммунокомпетентных клеток при повторных воздействиях патогена и способствует разрешению воспаления [2]. Если воспаление не может разрешиться, то оно перетекает в хроническое состояние [7].

Современные исследования направлены на изучение роли митохондрий в развитии хронического воспаления [1, 9]. Функциональная активность клеток, участвующих в иммунном ответе, зависит от работы митохондрий. Митохондрии представляют собой полуавтономные органеллы, обладающие собственной митохондриальной ДНК (мтДНК). Мутации в мтДНК происходят чаще из-за близости к активным формам кислорода, кольцевой структуры, несовершенной репарации [5]. Поэтому клетке необходимо своевременно устранять поврежденные органеллы. Контроль качества митохондрий осуществляется несколькими механизмами, одним из которых является митофагия. Митофагия обеспечивает селективное удаление поврежденных митохондрий. Снижение эффективности митофагии приводит к накоплению дефектных митохондрий, что в дальнейшем может привести к повышенному уровню секреции провоспалительных цитокинов и, как следствие, чрезмерному воспалению [3, 11].

Удобной моделью для изучения функциональной значимости митохондрий являются цитоплазматические гидриды (цибриды). Цибриды были созданы нашей лабораторией ранее, для этого безмитохондриальные клетки THP-1 слили с тромбоцитами от пациентов. Таким образом, все цибриды несут единый ядерный геном и уникальный митохондриальный геном [6].

Целью настоящего исследования было изучение способности цибридных линий, несущих разный митохондриальный геном, генерировать провоспалительный ответ, а также формировать толерантность.

Материалы и методы

Для изучения взаимосвязи между мутациями мтДНК и воспалительным ответом были выбраны цибридные линии. Для получения цибридных линий на THP-1 воздействовали бромистым этидием для угнетения митохондрий. После того, как в клетках не осталось митохондрий, они кокультивировались с тромбоцитами от пациентов с хроническими заболеваниями. Особенность этих линий в том, что у них единый ядерный геном. Цибридные линии были получены нашей лабораторией ранее [6].

Для воспалительной реакции и толерантности к липополисахариду (LPS) цибридные линии высевали в стерильные 6-луночные планшеты по две лунки в концентрации 1 млн клеток/мл по 2 мл в каждую лунку. В одну из лунок к клеткам добавляли LPS в концентрации 1 мкг/мл. Клетки с LPS инкубировали в течение 4 ч в CO2-инкубаторе при 37 °С (95% воздуха и 5% CO2). Через 4 ч клетки откручивали при 300 g в течение 5 мин, отмывали при помощи PBS, добавляли 2 мл RPMI-1640 (10% сыворотки, 100 ед/ мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина) и высевали по 1 мл в 24-луночный планшет. Затем добавляли в одну из лунок LPS в концентрации 1 мкг/ мл. Клетки с LPS инкубировали в течение 20 ч в CO2-инкубаторе при 37 °С (95% воздуха и 5% CO2). Спустя 20 ч образцы культуральной среды отбирали в пробирки, центрифугировали в течение 5 минут при 300 g. Супернатант отбирали в отдельные пробирки для оценки секреции панели цитокинов методом ИФА с использованием реагентов R&D Systems. Проведение ИФА согласно протоколу анализа. Оптическую плотность калибраторов и исследуемых образцов измеряли на планшетном ридере CLARIOstar.

Статистический анализ проводили при помощи программного обеспечения SPSS Statistics 26.

Результаты и обсуждение

Мы решили оценить способность исследуемых клеточных линий генерировать провоспалительный ответ при стимуляции LPS, а также дальнейшую способность клеток формировать иммунную толерантность.

Цибриды демонстрировали два уровня провоспалительного ответа: высокий и низкий. Более того, цибриды с высоким провоспалительным ответом можно разделить на те, которые формировали толерантность, и те, которые не формировали толерантность к LPS (рис. 1).

 

Рисунок 1. Провоспалительный ответ и способность формировать толерантность цибридными линиями

Примечание. А – секреция цитокинов TNFα, IL-1β, IL-6, IL-8, CCL2 в ответ на первую и на вторую стимуляцию LPS. По оси Y отмечен провоспалительный ответ на первую стимуляцию LPS, по оси X – на вторую стимуляции. В прямоугольник попали цибриды с низкой секреторной активностью по данному цитокину. Если точка выше линии, то цибридная линия формировала толерантность, если ниже, то не формировала. Б – способность цибридных линий формировать иммунную толерантность при двукратной стимуляции клеток LPS. Слева представлены цибридные линии, сверху цитокины. Пересечения соответствуют типу ответа и способности формировать толерантность для каждой цибридной линии по каждому цитокину. Серый прямоугольник – низкий провоспалительный ответ, белый – высокий провоспалительный ответ, формировали толерантность, черный – высокий провоспалительный ответ, не формировали толерантность.

Figure 1. Pro-inflammatory response and ability to form tolerance in cybrid lines

Note. A, secretion of cytokines TNFα, IL-1β, IL-6, IL-8, CCL2 in response to the first and second LPS stimulation. The Y axis shows the proinflammatory response to the first LPS stimulation, and the X axis to the second stimulation. The rectangle contains cybrids with low secretory activity for this cytokine. If the point is above the line, then the cybrid line has formed tolerance, if below, then it has not. B, the ability of cybrid lines to form immune tolerance upon double stimulation of cells with LPS. On the left are cybrid lines, on top are cytokines. The intersections correspond to the type of response and the ability to form tolerance for each cybrid line for each cytokine. Gray rectangle – low pro-inflammatory response, white – high pro-inflammatory response, tolerance was formed, black – high pro-inflammatory response, tolerance was not formed.

 

Оказалось, что цибридные линии HSM1, HSM2, TC-520, TC-521, TCI-521 не реагировали на секрецию LPS по всем исследуемым цитокинам. TCN-521 не реагировала по четырем цитокинам и не формировал толерантность по IL-8. LSM1, HSMAM2 имели низкую секрецию по IL-1β, IL-6, CCL2 и не формировали толерантность по TNFα, IL-8. LSM2 формировала толерантность по TNFα и по CCL2, не формировала толерантность по IL-1β, IL-6, IL-8. HSMAM3 формировала толерантность по TNFα, IL-1β, IL-6 и не формировала по IL-8, CCL2. HSMAM1, TC-522, TCP-521 формировали по CCL2, и не формировали по TNFα, IL-1β, IL-6, IL-8.

Таким образом, клетки, различающиеся по митохондриальному геному, качественно отличались по типу воспалительной реакции.

Ранее группа ученых провела клиническое исследование и показала, что у пациентов с мутациями или делециями в мтДНК секреция провоспалительных цитокинов TNFα, IL- 6, IL- 1β лейкоцитами была выше в ответ на LPS [4]. Можно предположить, что ответственным за накопление мутация мтДНК могло быть нарушение в митофагии. Более того, было показано, что нарушения в секреции PINK1 и/или PARKIN, ключевых белков митофагии, также вело к повышенному содержанию IL-1β, IL-6, CCL2 [8].

Заключение

В своем исследовании мы продемонстрировали, что клетки, различающиеся между собой только митохондриальным геномом, качественно отличались по типу воспалительной реакции. Наше исследование, безусловно, имеет ряд ограничений. Так, мы не продемонстрировали роль конкретных мутаций мтДНК в нарушениях иммунной реакции, а также не осветили механизмы этих нарушений. Однако, вероятно, митохондриальные мутации, а значит, и митохондриальная дисфункция, действительно могут лежать в основе нарушений функций иммунных клеток. Раскрытие механизмов влияния мутаций мтДНК на формирование иммунного ответа и толерантности представляется крайне перспективным направлением для разработки эффективной и безопасной терапии заболеваний воспалительного генеза.

Благодарности

Авторы выражают благодарность Центру высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины ИБГ РАН, за возможность использования научного оборудования.

×

About the authors

A. D. Zhuravlev

Institute of General Pathology and Pathophysiology; Avtsyn Research Institute of Human Morphology, Petrovsky National Research Centre of Surgery

Author for correspondence.
Email: Zhuravel17@yandex.ru

Postgraduate Student, Junior Researcher Associate, Laboratory of Angiopathology; Junior Research Associate

Russian Federation, Moscow; Moscow

S. S. Verkhova

Institute of General Pathology and Pathophysiology; Avtsyn Research Institute of Human Morphology, Petrovsky National Research Centre of Surgery

Email: Zhuravel17@yandex.ru

Senior Assistant; Postgraduate Student

Russian Federation, Moscow; Moscow

M. V. Kubekina

Core Facility Center and Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine, Institute of Gene Biology, Russian Academy of Sciences

Email: Zhuravel17@yandex.ru

PhD (Biology), Research Associate

Russian Federation, Moscow

References

  1. Dela Cruz C.S., Kang M.J. Mitochondrial dysfunction and damage associated molecular patterns (DAMPs) in chronic inflammatory diseases. Mitochondrion, 2018, Vol. 41, pp. 37-44.
  2. Dominguez-Andres J., Netea M.G. Long-term reprogramming of the innate immune system. J. Leukoc. Biol., 2019, Vol. 105, no. 2, pp. 329-338.
  3. Fang E.F., Hou Y., Palikaras K., Adriaanse B.A., Kerr J.S., Yang B., Lautrup S., Hasan-Olive M.M., Caponio D., Dan X., Rocktäschel P., Croteau D.L., Akbari M., Greig N.H., Fladby T., Nilsen H., Cader M.Z., Mattson M.P., Tavernarakis N., Bohr V.A. Mitophagy inhibits amyloid- and tau pathology and reverses cognitive deficits in models of Alzheimer’s disease. Nat. Neurosci., 2019, Vol. 22 no. 3, pp. 401-412.
  4. Karan K.R., Trumpff C., Cross M., Engelstad K.M., Marsland A.L., McGuire P.J., Hirano M., Picard M. Leukocyte cytokine responses in adult patients with mitochondrial DNA defects. J. Mol. Med. (Berl.), 2022, Vol. 100, no. 6, pp. 963-971.
  5. Marian A.J. Mitochondrial genetics and human systemic hypertension. Circ. Res., 2011, Vol. 108, no. 7, pp. 784-746.
  6. Sazonova M.A., Sinyov V.V., Ryzhkova A.I., Sazonova M.D., Khasanova Z.B., Shkurat T.P., Karagodin V.P., Orekhov A.N., Sobenin I.A. Creation of cybrid cultures containing mtDNA mutations m.12315G>A and m.1555G>A, associated with atherosclerosis. Biomolecules, 2019, Vol. 9, no. 9, 499. doi: 10.3390/biom9090499.
  7. Seeley J.J., Ghosh S. Molecular mechanisms of innate memory and tolerance to LPS. J. Leukoc. Biol., 2017, Vol. 101, no. 1, pp. 107-119.
  8. Sliter D.A., Martinez J., Hao L., Chen X., Sun N., Fischer T.D., Burman J.L., Li Y., Zhang Z., Narendra D.P., Cai H., Borsche M., Klein C., Youle R.J. Parkin and PINK1 mitigate STING-induced inflammation. Nature, 2018, Vol. 561, no. 7722, pp. 258-262.
  9. Vaamonde-García C., López-Armada M.J. Role of mitochondrial dysfunction on rheumatic diseases. Biochem. Pharmacol., 2019, Vol. 165, pp. 181-195.
  10. Vacchelli E., Galluzzi L., Eggermont A., Galon J., Tartour E., Zitvogel L., Kroemer G. Trial Watch: Immunostimulatory cytokines. Oncoimmunology, 2012, Vol. 1, no. 4, pp. 493-506.
  11. Xu Y., Shen J., Ran Z. Emerging views of mitophagy in immunity and autoimmune diseases. Autophagy, 2020, Vol. 16, no. 1, pp. 3-17.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Figure 1. Pro-inflammatory response and ability to form tolerance in cybrid lines

Download (543KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2024 Zhuravlev A.D., Verkhova S.S., Kubekina M.V.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № 77 - 11525 от 04.01.2002.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies