Признаки иммунных нарушений у детей с расстройствами аутистического спектра

Обложка


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Расстройства аутистического спектра (РАС) – это гетерогенная группа нарушений развития психики и нервной системы. Пациенты с РАС характеризуются нарушениями коммуникативной, когнитивной сфер и навязчивым поведением. Патогенез и этиология РАС до сих пор не ясны. Согласно литературным данным, пациенты, страдающие РАС, имеют не только психические, но и соматические нарушения, в том числе и изменения иммунной системы.

Целью настоящей работы было исследование концентраций цитокинов в плазме крови детей с РАС и оценка уровня экспрессии провоспалительных генов в мононуклеарах периферической крови.

В клиническую группу вошел 71 ребенок в возрасте 4-12 лет с диагнозом «РАС» (F84.02). Пациенты набрали более 36 балов по шкале оценки детского аутизма (CARS). В контрольную выборку вошли 27 условно здоровых детей того же возраста.

В данном исследовании использовались следующие методы: выделение мононуклеаров из гепаринизированной периферической крови центрифугированием в градиенте плотности фиколла-верографина, оценка концентрации цитокинов с использованием коммерчески доступных иммуноферментных наборов, выделение тотальной РНК, обратная транскрипция с использованием случайных гексапраймеров, полимеразная цепная реакция в реальном времени с использованием интерколирующего красителя SYBR Green.

Концентрация провоспалительных цитокинов IL-1β, IL-8, IL-17A в плазме периферической крови детей с РАС была статистически значимо повышена в сравнении с контрольной выборкой. При этом концентрация противовоспалительного цитокина IL-10 у пациентов с РАС была в 3,6 раза ниже в сравнении с контрольной выборкой (p < 0,001).

Уровень экспрессии генов NF-κB1, IL1β, IL8 и TNFα на уровне РНК в мононуклеарах периферической крови был значимо повышен в 2,8, 2,5, 4,8 и 4,2 раза у пациентов с РАС в сравнении с контрольной выборкой (все р < 0,01).

Полученные результаты свидетельствуют о значимом повышении концентраций провоспалительных цитокинов (IL-1β, IL-8, IL-17A) в плазме крови и понижении концентраций противоспалительных цитокинов (IL-10) у больных РАС по сравнению с контрольной группой.

Полный текст

Введение

Расстройство аутистического спектра (РАС) – это группа нарушений нервно-психического развития, характеризующаяся трудностями в социальном общении и взаимодействии, а также повторяющимися моделями поведения и интересов. Распространенность заболевания в мире на 2020 оценивалась как 1 пациент с РАС на 59 человек [5].

Этиология и механизмы патогенеза РАС до сих пор до конца не ясны, так как исследования в этой области осложняются гетерогенностью заболевания. Этиопатогенез РАС связывают с дисфункцией иммунной системы, нарушением активности митохондрий и окислительным стрессом [6]. Посмертные исследования тканей мозга пациентов с РАС выявили признаки нейровоспаления: активация микроглии, повышение экспрессии генов провоспалительных факторов [7, 14]. Кроме того, в плазме и сыворотке пациентов с РАС было обнаружено повышение концентрации провоспалительных цитокинов, положительно коррелировавшее с выраженностью поведенческих нарушений [8, 12]. Современные исследования показали повышенную частоту встречаемости аллергических и аутоиммунных заболеваний у пациентов с РАС [13, 15].

Характерной особенностью РАС является истощение антиоксидантных систем и развитие хронического оксидативного стресса [1, 6]. На клеточном уровне избыточная продукция свободных радикалов может приводить к активации транскрипционного фактора NF-κB1 и повышению экспрессии провоспалительных цитокинов [10].

Целью данной работы явилось исследование уровня экспрессии провоспалительных цитокинов и транскрипционного фактора NF-κB1 в мононуклеарах периферической крови пациентов с тяжелым течением РАС.

Материалы и методы

Пациенты. В исследовании принимали участия пациенты (n = 71) с диагнозом «РАС» (F84.02) в возрасте 4-12 лет, наблюдавшиеся в стационаре ФГБНУ «Научный центр психического здоровья».

Все пациенты были охарактеризованы с использованием международных шкал AMSE (Исследование психического статуса при аутизме) [2], CARS (шкала оценки детского аутизма [11], SCQ (анкета общения [9]). Для участия в исследовании отбирались пациенты с тяжелым течением РАС, набравшие по шкале CARS более 36 баллов, без нарушений нервной системы известной этиологии (синдром Ретта, туберозный склероз, синдром Мартина–Белл). Контрольная группа включала 27 условно здоровых детей соответствующего возраста, прошедших физический осмотр, ЭЭГ и анализ крови. Исследование было одобрено этическим комитетом ФГБНУ МГНЦ.

Выделение мононуклеаров периферической крови. Забор венозной крови в количестве 4 мл осуществлялся с использованием пробирок с антикоагулянтом (Li-Heparin).

Мононуклеары периферической крови (МПК) выделяли по стандартной методике, центрифугированием в градиенте плотности фиколла-верографина (1,077 г/см3) (НПП «ПанЭко», Россия).

Исследование концентрации цитокинов. Забор венозной крови в количестве 4 мл осуществлялся с использованием пробирок с антикоагулянтом (К3-ЭДТА). В образцах плазмы определяли содержание цитокинов (IL-1β, TNFα, IL-8, IL-17A, IL-10 и IFNγ) с использованием коммерчески доступных иммуноферментных наборов (ООО «Цитокин», Россия).

Оценка уровня экспрессии генов транскрипционных факторов и провоспалительных цитокинов в МПК. Тотальная РНК выделялась с использованием набора RNeasy Mini kit Qiagen (Германия) по стандартной методике. Реакцию обратной транскрипции проводили в амплификаторе «Терцик» (ООО «ДНК-Технология», Россия) с использованием случайных гексапраймеров. ПЦР в реальном времени проводили в трех повторах в амплификаторе Quant Studio 5 (Applied Biosystems, США) с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green. В качестве референсного гена был выбран ген TBP. Анализ результатов поводили с использованием калибровочной кривой. Использованные в исследование праймеры представлены в таблице 1.

 

ТАБЛИЦА 1. ПРАЙМЕРЫ, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В ИССЛЕДОВАНИИ

TABLE 1. PRIMERS USED IN THE STUDY

Ген

Gene

Праймеры

Primers

F

R

IL1β

TTCGACACATGGGATAACGAGG

TTTTTGCTGTGAGTCCCGGAG

IL8

GCACCGACTTTGGAGTTGG

GGACCCCTCAAACGACTGT

TNFα

CAGCCTCTTCTCCTTCCTGAT

GCCAGAGGGCTGATTAGAGA

NF-κB1

CAGATGGCCCATACCTTCAAAT

CGGAAACGAAATCCTCTCTGTT

ТВР

GCCCGAAACGCCGAATAT

CCGTGGTTCGTGGCTCTCT

 

Статистический анализ данных проводился с использованием MS Excel, Statistica 6.0 и StatGraph с помощью U-критерия Манна–Уитни. Различия считались статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

На рисунке 1 представлены результаты исследования концентрации цитокинов в образцах плазмы пациентов с РАС и условно здорового контроля. У детей с РАС уровни провоспалительных цитокинов IL-1β, IL-8, IL-17A были статистически значимо выше соответствующих показателей в контрольной группе. В то же время концентрация противовоспалительного цитокина IL-10 в группе с РАС была в 3,6 раза ниже, чем у детей из контрольной группы (p < 0,001).

 

Рисунок 1. Концентрации цитокинов в плазме здорового контроля и пациентов с РАС

Примечание. * – p < 0,005 согласно критерию Манна–Уитни. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение.

Figure 1. Cytokine concentrations in plasma of healthy controls and ASD patients

Note. *, p < 0.005 according to the Mann–Whitney test. Data are presented as mean ± standard deviation.

 

Группы детей с РАС и здорового контроля не отличались между собой по уровню IFNγ. Концентрация TNFα в образцах плазмы большинства участников исследования были ниже порога чувствительности метода. Корреляционный анализ не выявил зависимости между значениями показателей тяжести заболевания CARS и уровнем цитокинов.

На рисунке 2 представлены результаты исследования уровней экспрессии транскрипционного фактора NF-κB1 и генов провоспалительных цитокинов IL-1β, IL-8 и TNFα в МПК пациентов РАС и здорового контроля. Как видно на рисунке, уровень РНК-транскриптов NF-κB1 у детей с РАС был в 2,8 раза выше соответствующего показателя в контрольной группе (р < 0,01). Сходным образом в группе детей с РАС содержание РНК-транскриптов провоспалительных цитокинов IL-1β, IL-8 и TNFα в 2,5, 4,8 и 4,2 раза превышало соответствующие параметры в группе контроля (все р < 0,01).

 

Рисунок 2. Экспрессия NF-κB1 и провоспалительных цитокинов IL-1β, IL-8 и TNFα в МПК здорового контроля и детей с РАС

Примечание. * – p < 0,01 согласно критерию Манна–Уитни. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение.

Figure 2. Expression of NF-κB1 and pro-inflammatory cytokines IL-1β, IL-8 and TNFα in peripheral blood mononuclear cells of healthy controls and children with ASD

Note. *, p < 0.01 according to the Mann–Whitney test. Data are presented as mean ± standard deviation.

 

Заключение

Полученные нами результаты подтверждают гипотезу о роли иммунной системы в патогенезе РАС. Недавние исследования выявили признаки нарушения целостности гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) у пациентов с РАС [4]. Таким образом, есть все основания полагать, что провоспалительные цитокины и МПК с высокой экспрессией провоспалительных факторов могут проникать в ЦНС из системного кровотока и усиливать нейровоспаление за счет активации клеток микроглии [3].

×

Об авторах

Ю. М. Чудакова

ФГБНУ «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова»

Автор, ответственный за переписку.
Email: julia.chudakova@yandex.ru

к.б.н., научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии 

Россия, 115478, Москва, ул. Москворечье, 1

С. Г. Никитина

ФГБНУ «Научный центр психического здоровья»

Email: julia.chudakova@yandex.ru

к.м.н., старший научный сотрудник отдела детской психиатрии 

Россия, Москва

Е. Е. Балакирева

ФГБНУ «Научный центр психического здоровья»

Email: julia.chudakova@yandex.ru

к.м.н., и.о. руководителя отдела, ведущий научный сотрудник отдела детской психиатрии 

Россия, Москва

В. В. Шмарин

ФГБНУ «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова»; ФГАОУ «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения РФ (Сеченовский университет)

Email: julia.chudakova@yandex.ru

лаборант-исследователь лаборатории молекулярной биологии ФГБНУ «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова»; студент 5-го курса ФГАОУ «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения РФ (Сеченовский университет)

Россия, 115478, Москва, ул. Москворечье, 1; Москва

Т. А. Салимова

ФГБНУ «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова»; ФГБОУ ВО «МИРЭА – Российский технологический университет»

Email: julia.chudakova@yandex.ru

лаборант-исследователь лаборатории молекулярной биологии ФГБНУ «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова»; студентка ФГБОУ ВО «МИРЭА – Российский технологический университет»

Россия, 115478, Москва, ул. Москворечье, 1; Москва

А. В. Мартынов

ФГБНУ «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова»

Email: julia.chudakova@yandex.ru

к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии 

Россия, 115478, Москва, ул. Москворечье, 1

Г. В. Шмарина

ФГБНУ «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова»; ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов имени Патриса Лумумбы»

Email: julia.chudakova@yandex.ru

к.м.н., доцент, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии ФГБНУ «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова»; доцент кафедры биологии медицинского факультета ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов имени Патриса Лумумбы»

Россия, 115478, Москва, ул. Москворечье, 1; Москва

С. В. Костюк

ФГБНУ «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова»

Email: julia.chudakova@yandex.ru

д.б.н., доцент, заведующий лабораторией молекулярной биологии

Россия, 115478, Москва, ул. Москворечье, 1

Список литературы

  1. Никитина С.Г., Ершова Е.С., Чудакова Ю.М., Шмарина Г.В., Вейко Н.Н., Мартынов А.В., Костюк С.Э., Модестов А.А., Рожнова Н.М., Ижевская В.Л., Костюк С.В., Симашкова Н.В. Окислительные повреждения ДНК клеток периферической крови и внеклеточной ДНК плазмы крови как показатель тяжести окислительного стресса при расстройствах аутистического спектра и шизофрении у детей // Психиатрия, 2021. Т. 19. С. 15-25. [Nikitina S.G., Ershova E.S., Chudakova J.M., Shmarina G.V., Veiko N.N., Martynov A.V., Kostuk S.E., Modestov A.А., Rozhnova T.M., Izhevskaya V.L., Kostuk S.V., Simashkova N.V. Oxidative DNA damage of peripheral blood cells and blood plasma сell-free DNA as an indicator of the oxidative stress level in children with autism spectrum disorders and schizophrenia. Psikhiatriya = Psychiatry, 2021, Vol. 19, no. 4, pp. 15-25. (In Russ.)]
  2. American Psychiatric Association. Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (DSM-5), Fifth Edition. Amer. Psychiatric Pub. Inc., 2022. 50 p. Available at: https://www.psychiatry.org/psychiatrists/practice/dsm.
  3. Arenella M., Matuleviciute R., Tamouza R., Leboyer M., McAlonan G., Bralten J., Murphy D. Immunogenetics of autism spectrum disorder: A systematic literature review. Brain. Behav. Immun., 2023, Vol. 114, pp. 488-499.
  4. Cheng Y., Desse S., Martinez A., Worthen R.J., Jope R.S., Beurel E. TNFα disrupts blood brain barrier integrity to maintain prolonged depressive-like behavior in mice. Brain. Behav. Immun., 2018, Vol. 69, pp. 556-567.
  5. Chiarotti F., Venerosi A. Epidemiology of autism spectrum disorders: a review of worldwide prevalence estimates since 2014. Brain Sci., 2020, Vol. 10, 274. doi: 10.3390/brainsci10050274.
  6. Hallmayer J., Cleveland S., Torres A., Phillips J., Cohen B., Torigoe T., Miller J., Fedele A., Collins J., Smith K., Lotspeich L., Croen L.A., Ozonoff S., Lajonchere C., Grether J.K., Risch N. Genetic heritability and shared environmental factors among twin pairs with autism. Arch. Gen. Psychiatry, 2011, Vol. 68, pp. 1095-102.
  7. Lee A.S., Azmitia E.C., Whitaker-Azmitia P.M. Developmental microglial priming in postmortem autism spectrum disorder temporal cortex. Brain. Behav. Immun., 2017, Vol. 62, pp. 193-202.
  8. Masi A., Glozier N., Dale R., Guastella A.J. The immune system, cytokines, and biomarkers in autism spectrum disorder. Neurosci. Bull., 2017, Vol. 33, pp. 194-204.
  9. Moody E.J., Reyes N., Ledbetter C., Wiggins L., DiGuiseppi C., Alexander A., Jackson S., Lee L.-C., Levy S.E., Rosenberg S.A. Screening for Autism with the SRS and SCQ: Variations across Demographic, Developmental and Behavioral Factors in Preschool Children. J. Autism Dev. Disord., 2017, Vol. 47, pp. 3550-3561.
  10. Mulero M.C., Huxford T., Ghosh G. NF-κB, IκB, and IKK: Integral Components of Immune System Signaling. Adv. Exp. Med. Biol., 2019, Vol. 1172, pp. 207-226.
  11. Scholper E., van Bourgondien M.E., Wellman G.J., Love S.R. (CARS-2) Childhood Autism Rating Scale. Pro Ed, 2010.
  12. Siniscalco D., Schultz S., Brigida A.L., Antonucci N. Inflammation and neuro-immune dysregulations in autism spectrum disorders. Pharmaceuticals (Basel), 2018, Vol. 11, pp. 1-14.
  13. Takada R., Toritsuka M., Yamauchi T., Ishida R., Kayashima Y., Nishi Y., Ishikawa M., Yamamuro K., Ikehara M., Komori T., Noriyama Y., Kamikawa K., Saito Y., Okano H., Makinodan M. Granulocyte macrophage colony-stimulating factor-induced macrophages of individuals with autism spectrum disorder adversely affect neuronal dendrites through the secretion of pro-inflammatory cytokines. Mol. Autism, 2024, Vol. 15, 10. doi: 10.1186/s13229-024-00589-2.
  14. Velmeshev D., Schirmer L., Jung D., Haeussler M., Perez Y., Mayer S., Bhaduri A., Goyal N., Rowitch D.H., Kriegstein A.R. Single-cell genomics identifies cell type-specific molecular changes in autism. Science, 2019, Vol. 364, pp. 685-689.
  15. Xu G., Snetselaar L.G., Jing J., Liu B., Strathearn L., Bao W. Association of food allergy and other allergic conditions with autism spectrum disorder in children. JAMA Netw. Open, 2018, Vol. 1, pp. e180279. doi: 10.1001/jamanetworkopen.2018.0279.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рисунок 1. Концентрации цитокинов в плазме здорового контроля и пациентов с РАС Примечание. * – p < 0,005 согласно критерию Манна–Уитни. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение.

Скачать (199KB)
Метаданные
3. Рисунок 2. Экспрессия NF-κB1 и провоспалительных цитокинов IL-1β, IL-8 и TNFα в МПК здорового контроля и детей с РАС Примечание. * – p < 0,01 согласно критерию Манна–Уитни. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение.

Скачать (152KB)
Метаданные

© Чудакова Ю.М., Никитина С.Г., Балакирева Е.Е., Шмарин В.В., Салимова Т.А., Мартынов А.В., Шмарина Г.В., Костюк С.В., 2024

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № 77 - 11525 от 04.01.2002.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах