Immune alterations in children with autism spectrum disorders

Cover Page


Cite item

Full Text

Abstract

Autism spectrum disorders (ASD) are a heterogeneous group of mental and nervous system disorders. Patients with ASD are characterized by communication and cognitive impairments and obsessive behavior. The pathogenesis and etiology of ASD are still unclear. According to the literature, patients suffering from ASD have not only mental, but also somatic disorders, including changes in the immune system. The aim of this work was to study the concentration of cytokines in the blood plasma of children with ASD and the level of expression of proinflammatory genes in peripheral blood mononuclear cells. The clinical group included 71 children aged 4-12 years with a diagnosis of ASD (F84.02). Patients scored more than 36 on the Childhood Autism Rating Scale (CARS). The control sample included 27 apparently healthy children of the same age. The following methods were used in this study: isolation of mononuclear cells from heparinized peripheral blood, Ficoll-Verografin density gradient centrifugation, evaluation of cytokine blocks using commercially available enzyme immunoassay kits, isolation of random total RNA, reverse transcription using hexaprimers, and real-time polymerase chain reaction using intercalating dye SYBR Green. The concentration of proinflammatory cytokines IL-1β, IL-8, and IL-17A in the peripheral blood plasma of children with ASD was statistically significantly increased compared to the control sample. Moreover, the concentration of the anti-inflammatory cytokine IL-10 in patients with ASD was 3.6 times lower compared to the control sample (p < 0.001). The level of expression of the NF-κB1, IL1β, IL8 and TNFα genes at the RNA level in peripheral blood mononuclear cells was increased by 2.8, 2.5, 4.8 and 4.2 times in patients with ASD compared to the control sample (all p < 0.01). The results obtained indicate an increase in the concentration of proinflammatory cytokines (IL-1β, IL-8, IL-17A) in the blood plasma and a decrease in the concentration of anti-inflammatory cytokines (IL-10) in patients with ASD compared to the control sequence.

Full Text

Введение

Расстройство аутистического спектра (РАС) – это группа нарушений нервно-психического развития, характеризующаяся трудностями в социальном общении и взаимодействии, а также повторяющимися моделями поведения и интересов. Распространенность заболевания в мире на 2020 оценивалась как 1 пациент с РАС на 59 человек [5].

Этиология и механизмы патогенеза РАС до сих пор до конца не ясны, так как исследования в этой области осложняются гетерогенностью заболевания. Этиопатогенез РАС связывают с дисфункцией иммунной системы, нарушением активности митохондрий и окислительным стрессом [6]. Посмертные исследования тканей мозга пациентов с РАС выявили признаки нейровоспаления: активация микроглии, повышение экспрессии генов провоспалительных факторов [7, 14]. Кроме того, в плазме и сыворотке пациентов с РАС было обнаружено повышение концентрации провоспалительных цитокинов, положительно коррелировавшее с выраженностью поведенческих нарушений [8, 12]. Современные исследования показали повышенную частоту встречаемости аллергических и аутоиммунных заболеваний у пациентов с РАС [13, 15].

Характерной особенностью РАС является истощение антиоксидантных систем и развитие хронического оксидативного стресса [1, 6]. На клеточном уровне избыточная продукция свободных радикалов может приводить к активации транскрипционного фактора NF-κB1 и повышению экспрессии провоспалительных цитокинов [10].

Целью данной работы явилось исследование уровня экспрессии провоспалительных цитокинов и транскрипционного фактора NF-κB1 в мононуклеарах периферической крови пациентов с тяжелым течением РАС.

Материалы и методы

Пациенты. В исследовании принимали участия пациенты (n = 71) с диагнозом «РАС» (F84.02) в возрасте 4-12 лет, наблюдавшиеся в стационаре ФГБНУ «Научный центр психического здоровья».

Все пациенты были охарактеризованы с использованием международных шкал AMSE (Исследование психического статуса при аутизме) [2], CARS (шкала оценки детского аутизма [11], SCQ (анкета общения [9]). Для участия в исследовании отбирались пациенты с тяжелым течением РАС, набравшие по шкале CARS более 36 баллов, без нарушений нервной системы известной этиологии (синдром Ретта, туберозный склероз, синдром Мартина–Белл). Контрольная группа включала 27 условно здоровых детей соответствующего возраста, прошедших физический осмотр, ЭЭГ и анализ крови. Исследование было одобрено этическим комитетом ФГБНУ МГНЦ.

Выделение мононуклеаров периферической крови. Забор венозной крови в количестве 4 мл осуществлялся с использованием пробирок с антикоагулянтом (Li-Heparin).

Мононуклеары периферической крови (МПК) выделяли по стандартной методике, центрифугированием в градиенте плотности фиколла-верографина (1,077 г/см3) (НПП «ПанЭко», Россия).

Исследование концентрации цитокинов. Забор венозной крови в количестве 4 мл осуществлялся с использованием пробирок с антикоагулянтом (К3-ЭДТА). В образцах плазмы определяли содержание цитокинов (IL-1β, TNFα, IL-8, IL-17A, IL-10 и IFNγ) с использованием коммерчески доступных иммуноферментных наборов (ООО «Цитокин», Россия).

Оценка уровня экспрессии генов транскрипционных факторов и провоспалительных цитокинов в МПК. Тотальная РНК выделялась с использованием набора RNeasy Mini kit Qiagen (Германия) по стандартной методике. Реакцию обратной транскрипции проводили в амплификаторе «Терцик» (ООО «ДНК-Технология», Россия) с использованием случайных гексапраймеров. ПЦР в реальном времени проводили в трех повторах в амплификаторе Quant Studio 5 (Applied Biosystems, США) с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green. В качестве референсного гена был выбран ген TBP. Анализ результатов поводили с использованием калибровочной кривой. Использованные в исследование праймеры представлены в таблице 1.

 

ТАБЛИЦА 1. ПРАЙМЕРЫ, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В ИССЛЕДОВАНИИ

TABLE 1. PRIMERS USED IN THE STUDY

Ген

Gene

Праймеры

Primers

F

R

IL1β

TTCGACACATGGGATAACGAGG

TTTTTGCTGTGAGTCCCGGAG

IL8

GCACCGACTTTGGAGTTGG

GGACCCCTCAAACGACTGT

TNFα

CAGCCTCTTCTCCTTCCTGAT

GCCAGAGGGCTGATTAGAGA

NF-κB1

CAGATGGCCCATACCTTCAAAT

CGGAAACGAAATCCTCTCTGTT

ТВР

GCCCGAAACGCCGAATAT

CCGTGGTTCGTGGCTCTCT

 

Статистический анализ данных проводился с использованием MS Excel, Statistica 6.0 и StatGraph с помощью U-критерия Манна–Уитни. Различия считались статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

На рисунке 1 представлены результаты исследования концентрации цитокинов в образцах плазмы пациентов с РАС и условно здорового контроля. У детей с РАС уровни провоспалительных цитокинов IL-1β, IL-8, IL-17A были статистически значимо выше соответствующих показателей в контрольной группе. В то же время концентрация противовоспалительного цитокина IL-10 в группе с РАС была в 3,6 раза ниже, чем у детей из контрольной группы (p < 0,001).

 

Рисунок 1. Концентрации цитокинов в плазме здорового контроля и пациентов с РАС

Примечание. * – p < 0,005 согласно критерию Манна–Уитни. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение.

Figure 1. Cytokine concentrations in plasma of healthy controls and ASD patients

Note. *, p < 0.005 according to the Mann–Whitney test. Data are presented as mean ± standard deviation.

 

Группы детей с РАС и здорового контроля не отличались между собой по уровню IFNγ. Концентрация TNFα в образцах плазмы большинства участников исследования были ниже порога чувствительности метода. Корреляционный анализ не выявил зависимости между значениями показателей тяжести заболевания CARS и уровнем цитокинов.

На рисунке 2 представлены результаты исследования уровней экспрессии транскрипционного фактора NF-κB1 и генов провоспалительных цитокинов IL-1β, IL-8 и TNFα в МПК пациентов РАС и здорового контроля. Как видно на рисунке, уровень РНК-транскриптов NF-κB1 у детей с РАС был в 2,8 раза выше соответствующего показателя в контрольной группе (р < 0,01). Сходным образом в группе детей с РАС содержание РНК-транскриптов провоспалительных цитокинов IL-1β, IL-8 и TNFα в 2,5, 4,8 и 4,2 раза превышало соответствующие параметры в группе контроля (все р < 0,01).

 

Рисунок 2. Экспрессия NF-κB1 и провоспалительных цитокинов IL-1β, IL-8 и TNFα в МПК здорового контроля и детей с РАС

Примечание. * – p < 0,01 согласно критерию Манна–Уитни. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение.

Figure 2. Expression of NF-κB1 and pro-inflammatory cytokines IL-1β, IL-8 and TNFα in peripheral blood mononuclear cells of healthy controls and children with ASD

Note. *, p < 0.01 according to the Mann–Whitney test. Data are presented as mean ± standard deviation.

 

Заключение

Полученные нами результаты подтверждают гипотезу о роли иммунной системы в патогенезе РАС. Недавние исследования выявили признаки нарушения целостности гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) у пациентов с РАС [4]. Таким образом, есть все основания полагать, что провоспалительные цитокины и МПК с высокой экспрессией провоспалительных факторов могут проникать в ЦНС из системного кровотока и усиливать нейровоспаление за счет активации клеток микроглии [3].

×

About the authors

Yu. M. Chudakova

Research Centre For Medical Genetics

Author for correspondence.
Email: julia.chudakova@yandex.ru

PhD (Biology), Research Associate, Laboratory of Molecular Biology

Russian Federation, 1 Moskvorechye St, Moscow, 115478

S. G. Nikitina

Mental Health Research Center

Email: julia.chudakova@yandex.ru

PhD (Medicine), Senior Research Associate, Department of Child Psychiatry

Russian Federation, Moscow

E. E. Balakireva

Mental Health Research Center

Email: julia.chudakova@yandex.ru

PhD (Medicine), Acting Head of Department, Leading Research Associate, Department of Child Psychiatry

Russian Federation, Moscow

V. V. Shmarin

Research Centre For Medical Genetics; I. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: julia.chudakova@yandex.ru

Research Assistant, Laboratory of Molecular Biology, Research Centre For Medical Genetics; 5th year Student, I. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Russian Federation, 1 Moskvorechye St, Moscow, 115478; Moscow

T. A. Salimova

Research Centre For Medical Genetics; MIREA – Russian Technological University

Email: julia.chudakova@yandex.ru

Research Assistant, Laboratory of Molecular Biology, Research Centre For Medical Genetics; Student, MIREA – Russian Technological University

Russian Federation, 1 Moskvorechye St, Moscow, 115478; Moscow

A. V. Martynov

Research Centre For Medical Genetics

Email: julia.chudakova@yandex.ru

PhD (Biology), Senior Research Associate, Laboratory of Molecular Biology

Russian Federation, 1 Moskvorechye St, Moscow, 115478

G. V. Shmarina

Research Centre For Medical Genetics; P. Lumumba Peoples’ Friendship University of Russia

Email: julia.chudakova@yandex.ru

PhD (Medicine), Associate Professor, Leading Research Associate, Laboratory of Molecular Biology, Research Centre For Medical Genetics; Associate Professor, Department of Biology, Faculty of Medicine, P. Lumumba Peoples’ Friendship University of Russia

Russian Federation, 1 Moskvorechye St, Moscow, 115478; Moscow

S. V. Kostyuk

Research Centre For Medical Genetics

Email: julia.chudakova@yandex.ru

PhD, MD (Biology), Associate Professor, Head, Laboratory of Molecular Biology

Russian Federation, 1 Moskvorechye St, Moscow, 115478

References

  1. Никитина С.Г., Ершова Е.С., Чудакова Ю.М., Шмарина Г.В., Вейко Н.Н., Мартынов А.В., Костюк С.Э., Модестов А.А., Рожнова Н.М., Ижевская В.Л., Костюк С.В., Симашкова Н.В. Окислительные повреждения ДНК клеток периферической крови и внеклеточной ДНК плазмы крови как показатель тяжести окислительного стресса при расстройствах аутистического спектра и шизофрении у детей // Психиатрия, 2021. Т. 19. С. 15-25. [Nikitina S.G., Ershova E.S., Chudakova J.M., Shmarina G.V., Veiko N.N., Martynov A.V., Kostuk S.E., Modestov A.А., Rozhnova T.M., Izhevskaya V.L., Kostuk S.V., Simashkova N.V. Oxidative DNA damage of peripheral blood cells and blood plasma сell-free DNA as an indicator of the oxidative stress level in children with autism spectrum disorders and schizophrenia. Psikhiatriya = Psychiatry, 2021, Vol. 19, no. 4, pp. 15-25. (In Russ.)]
  2. American Psychiatric Association. Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (DSM-5), Fifth Edition. Amer. Psychiatric Pub. Inc., 2022. 50 p. Available at: https://www.psychiatry.org/psychiatrists/practice/dsm.
  3. Arenella M., Matuleviciute R., Tamouza R., Leboyer M., McAlonan G., Bralten J., Murphy D. Immunogenetics of autism spectrum disorder: A systematic literature review. Brain. Behav. Immun., 2023, Vol. 114, pp. 488-499.
  4. Cheng Y., Desse S., Martinez A., Worthen R.J., Jope R.S., Beurel E. TNFα disrupts blood brain barrier integrity to maintain prolonged depressive-like behavior in mice. Brain. Behav. Immun., 2018, Vol. 69, pp. 556-567.
  5. Chiarotti F., Venerosi A. Epidemiology of autism spectrum disorders: a review of worldwide prevalence estimates since 2014. Brain Sci., 2020, Vol. 10, 274. doi: 10.3390/brainsci10050274.
  6. Hallmayer J., Cleveland S., Torres A., Phillips J., Cohen B., Torigoe T., Miller J., Fedele A., Collins J., Smith K., Lotspeich L., Croen L.A., Ozonoff S., Lajonchere C., Grether J.K., Risch N. Genetic heritability and shared environmental factors among twin pairs with autism. Arch. Gen. Psychiatry, 2011, Vol. 68, pp. 1095-102.
  7. Lee A.S., Azmitia E.C., Whitaker-Azmitia P.M. Developmental microglial priming in postmortem autism spectrum disorder temporal cortex. Brain. Behav. Immun., 2017, Vol. 62, pp. 193-202.
  8. Masi A., Glozier N., Dale R., Guastella A.J. The immune system, cytokines, and biomarkers in autism spectrum disorder. Neurosci. Bull., 2017, Vol. 33, pp. 194-204.
  9. Moody E.J., Reyes N., Ledbetter C., Wiggins L., DiGuiseppi C., Alexander A., Jackson S., Lee L.-C., Levy S.E., Rosenberg S.A. Screening for Autism with the SRS and SCQ: Variations across Demographic, Developmental and Behavioral Factors in Preschool Children. J. Autism Dev. Disord., 2017, Vol. 47, pp. 3550-3561.
  10. Mulero M.C., Huxford T., Ghosh G. NF-κB, IκB, and IKK: Integral Components of Immune System Signaling. Adv. Exp. Med. Biol., 2019, Vol. 1172, pp. 207-226.
  11. Scholper E., van Bourgondien M.E., Wellman G.J., Love S.R. (CARS-2) Childhood Autism Rating Scale. Pro Ed, 2010.
  12. Siniscalco D., Schultz S., Brigida A.L., Antonucci N. Inflammation and neuro-immune dysregulations in autism spectrum disorders. Pharmaceuticals (Basel), 2018, Vol. 11, pp. 1-14.
  13. Takada R., Toritsuka M., Yamauchi T., Ishida R., Kayashima Y., Nishi Y., Ishikawa M., Yamamuro K., Ikehara M., Komori T., Noriyama Y., Kamikawa K., Saito Y., Okano H., Makinodan M. Granulocyte macrophage colony-stimulating factor-induced macrophages of individuals with autism spectrum disorder adversely affect neuronal dendrites through the secretion of pro-inflammatory cytokines. Mol. Autism, 2024, Vol. 15, 10. doi: 10.1186/s13229-024-00589-2.
  14. Velmeshev D., Schirmer L., Jung D., Haeussler M., Perez Y., Mayer S., Bhaduri A., Goyal N., Rowitch D.H., Kriegstein A.R. Single-cell genomics identifies cell type-specific molecular changes in autism. Science, 2019, Vol. 364, pp. 685-689.
  15. Xu G., Snetselaar L.G., Jing J., Liu B., Strathearn L., Bao W. Association of food allergy and other allergic conditions with autism spectrum disorder in children. JAMA Netw. Open, 2018, Vol. 1, pp. e180279. doi: 10.1001/jamanetworkopen.2018.0279.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Figure 1. Cytokine concentrations in plasma of healthy controls and ASD patients Note. *, p < 0.005 according to the Mann–Whitney test. Data are presented as mean ± standard deviation.

Download (199KB)
Indexing metadata
3. Figure 2. Expression of NF-κB1 and pro-inflammatory cytokines IL-1β, IL-8 and TNFα in peripheral blood mononuclear cells of healthy controls and children with ASD Note. *, p < 0.01 according to the Mann–Whitney test. Data are presented as mean ± standard deviation.

Download (152KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2024 Chudakova Y.M., Nikitina S.G., Balakireva E.E., Shmarin V.V., Salimova T.A., Martynov A.V., Shmarina G.V., Kostyuk S.V.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № 77 - 11525 от 04.01.2002.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies