Исследование фагоцитарной активности нейтрофильных гранулоцитов периферической крови у жителей Абхазии разных возрастов

Полный текст

Введение

Иммунная система имеет своеобразную возрастную динамику. Существуют обширные исследования последствий старения для адаптивного иммунитета, но влияние старения на факторы врожденного иммунитета остаются изученными в меньшей степени. Нейтрофильные гранулоциты (НГ) как крупнейшая популяция лейкоцитов в крови создают не только первую линию защиты от патогенных микроорганизмов, что давно было известно, но, по данным современных фундаментальных исследований, являются ключевыми эффекторными и регуляторными клетками как врожденного, так и адаптивного иммунитета, и играют решающую роль в иммунопатогенезе широкого спектра заболеваний. НГ обладают мощным рецепторным репертуаром, обеспечивающим связь между собой и клетками иммунной системы, а также связь с клетками эндотелия, эпителия и других тканей. Отсутствие адекватного реагирования, гиперактивация или блокада функций НГ приводит к развитию вялотекущих инфекционно-воспалительных заболеваний, не отвечающих на традиционную терапию, аутоиммунных и хронических заболеваний иммунозависимых процессов. Исследования invitro показывают, что функции НГ, такие как фагоцитоз, продукция активных форм кислорода (АФК), внутриклеточное уничтожение, образование нейтрофильных внеклеточных ловушек (NET) и хемотаксис, изменяются у возрастных людей, тогда как количество циркулирующих нейтрофилов не изменяется по сравнению с молодыми людьми. Однако данные различных исследований относительно функций НГ по-прежнему противоречивы, во многом из-за применения различных лабораторных методов и неоднородной когорты обследуемых пациентов [1, 2, 3, 4, 10, 11, 13]

Разработан широкий набор тестов для оценки иммунологических показателей человека [6]. Мощные потенциальные возможности проточной цитометрии привели к разработке способов регистрации функционального состояния различных клеток, оценке процессов их активации и изучению механизмов формирования дефектов их функционирования. Наиболее часто используемые приложения метода проточной цитометрии для данного рода исследований основаны на измерении различных функциональных характеристик клеток, к которым относятся фагоцитарная и бактерицидная активности нейтрофилов [7].

Целью явилось сравнительно-возрастное исследование фагоцитарной активности НГ периферической крови у жителей Абхазии методом проточной цитометрии.

Задачи исследования:

1. Отбор среди обследуемых наиболее здоровых и распределение по возрастным группам.
2. Проведение межгруппового сравнительного анализа полученных данных.

Материалы и методы

В рамках научно-исследовательской работы ГНУ «ИЭПиТ АНА» по обследованию коренных жителей Абхазии разных возрастов, проведенной при поддержке Академии наук Абхазии и Министерства здравоохранения Республики Абхазия, среди обследованных было отобрано 103 наиболее здоровых пациента, разделенных по классификации ВОЗ на четыре возрастные группы: группа 1 – молодого возраста (18-44 лет, n = 37), группа 2 – среднего возраста (45-59 лет, n = 13), группа 3 – пожилого (60-74 года, n = 27) и группа 4 – старческого возраста (75-89 лет, n = 26).

Для оценки статуса здоровья обследуемых, параллельно с клиническим осмотром, проводили гематологические, гемостазиологические, биохимические исследования, определяли концентрацию про- и противовоспалительных цитокинов, при необходимости применяли инструментальную диагностику. Обследование проводилось после информированного добровольного согласия пациентов. Взятие биологического материала осуществляли вакуумными системами утром строго натощак. Практически ко всем пациентам старческого, а иногда и пожилого возраста, исследовательская групп ИЭПиТ АНА выезжала на дом. Критериями исключения из исследования были значимые отклонения от нормы исследованных лабораторных показателей крови, обострения хронических заболеваний и наличие острых инфекционных заболеваний на момент обследования.

Фагоцитарную активность нейтрофильных гранулоцитов определяли методом проточной цитометрии с использованием цитометра EPICSXL (Beckman Coulter, США) с применением набора FagoFlowEx^® Kit (Чехия), предназначенного для оценки поглотительной (процента активно фагоцитирующих НГ – %ФАН) и переваривающей (индекс стимуляции НГ – ИС) способности НГ после стимуляции E. coli в образцах гепаринизированной цельной крови. После поглощения бактерии в фагоците активируется NADPH оксидаза, которая опосредует продукцию активных форм кислорода (респираторный взрыв). Продукты кислорода внутри фагоцита окисляют дигидрородамин 123 (DHR123) и превращают его в флуоресцентный родамин 123, который детектируется на проточном цитофлуориметре. В качестве положительного контроля используется образец стимулированный ФМА (форбол-12-миристат-13-ацетат), который инициирует кислородный взрыв без адгезии и поглощения патогена. Исследуется только гепаринизированная кровь. Флуоресценция родамина 123, возникающая при окислении DHR123, детектируется на канале для FITC. Родамин 123 быстро эвакуируется из гранулоцитов, поэтому необходимо анализировать образцы как можно скорее (в течение 1 часа после лизиса).

Анализ данных

При гейтирований количество событий должно быть в пределах 5000-10 000. Анализируются образцы на графике SSC против FSC. Гранулоциты, поглотившие бактерии, изменяют свое положение на графике SSC против FSC. В связи с этим рекомендуется корректировать положение гейта. Затем анализируются все события из региона гранулоцитов на гистограмме по интенсивности флуоресценции на канале FL1. Устанавливаются соответствующие регионы для вычисления процентного соотношения позитивных и негативных событий и средней интенсивности флуоресценции (СИФ). События с яркой флуоресценцией родамина 123 будут соответствовать активированным гранулоцитам.

Интерпретация результатов

Отношение СИФ активированных гранулоцитов стимулированных образцов и отрицательных контролей, так называемый индекс стимуляции ИС, используют для сравнения продукции активных форм кислорода в разных образцах крови. В целом, по показателю %ФАН определяется процент активно фагоцитирующих НГ, а по ИС – переваривающая кислородзависимая активность НГ.

Статистический анализ проводился с использованием программы StatTechv. 4.1.4 (разработчик – ООО «Статтех», Россия). Количественные показатели, имеющие нормальное распределение, описывались с помощью средних арифметических величин (M) и стандартных отклонений (SD), границ 95% доверительного интервала (95% ДИ). В случае отсутствия нормального распределения количественные данные описывались с помощью медианы (Me) и нижнего и верхнего квартилей (Q_0,25-Q_0,75).Сравнение трех и более групп по количественному показателю, имеющему нормальное распределение, выполнялось с помощью однофакторного дисперсионного анализа, апостериорные сравнения проводились с помощью, критерия Тьюки (при условии равенства дисперсий). Сравнение трех и более групп по количественному показателю, распределение которого отличалось от нормального, выполнялось с помощью критерия Краскела–Уоллиса, апостериорные сравнения – с помощью критерия Данна с поправкой Холма. Различия считались статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

При сравнении лейкоцитов не было выявлено статистически значимых между сравниваемыми четырьмя возрастными группами: молодого, среднего, пожилого и старческого возраста различий (p = 0,795). Для оценки функциональной активности НГ была исследована их поглотительная и переваривающая активность. В таблице 1 представлены показатели, характеризующие поглотительную (%ФАН) и переваривающую кислородзависимую активность (ИС) нейтрофильных гранулоцитов.

Абсолютное содержание НГ в периферической крови обследуемых групп значимо не отличалось (95% ДИ был в пределах 3,05-4,27), при этом процентное отношение НГ (табл. 1) имело достоверную разницу между группами пожилого и старческого возраста (p = 0,019). При оценке %ФАН в зависимости от возраста (рис. 1) были установлены статистически значимые различия между группами молодого и старческого возраста (p = 0,038).

 

Рисунок 1. Возрастная динамика процента активно фагоцитирующих НГ (%ФАН)

Figure 1. Age dynamics of percentage of actively phagocytic NG

 

Исходя из полученных данных (табл. 1, рис. 2) при сравнении ИС в зависимости от возраста, были установлены статистически значимые различия также между группами молодого и старческого возраста (p = 0,014). Достоверных отличии между другими возрастными группами не было выявлено ни по %ФАН, ни по ИС. Таким образом, среди обследуемых возрастных групп нами было выявлено статистически значимое ослабление как поглотительной так и переваривающей фагоцитарной активности нейтрофильных гранулоцитов в старческой группе.

 

Таблица 1. Показатели поглотительной и кислородзависимой переваривающей фагоцитарной активности НГ у жителей Абхазии разных возрастов, Ме (Q_0,25-Q_0,75)

Table 1. Indicators of absorption and oxygen-dependent digestive phagocytic activity of NG in resident of Abkhazia of different ages Ме (Q_0.25-Q_0.75)

Показатели Indicators	Группа 1 (18-44 года) Group 1 (18-44 years old) n = 37	Группа 2 (45-59 лет) Group 2 (45-59 years old) n = 13	Группа 3 (60-74 года) Group 3 (60-74 years old) n = 26	Группа 4 (75-89 лет) Group 4 (75-89 years old) n = 27	p
Нейтрофильные гранулоциты (НГ), % Neutrophil granulocytes (NG), %	61 54-65	63 57-65	63 60,5-67,0	56,5 52-63	p3-4 = 0,013
Процент активно фагоцитирующих НГ (%ФАН) Percentage of actively phagocytic NG	85 80-91	80 75-88	84 72,5-88,5	79 72-83	p1-4 =0,030
Индекс стимуляции НГ (ИС) NG Stimulation Index (IS)	44 41-46	43 38-45	42 37-45	40 37,25-41,75	p1-4= 0,009

Примечание. Группа 1 – молодой возраст; группа 2 – средний возраст; группа 3 – пожилой возраст; группа 4 –старческий возраст.

Note. Group 1, young age; group 2, middle age; group 3, elderly; group 4, old age.

 

Рисунок 2. Возрастная динамика индекса стимуляции (ИС) НГ

Figure 2. Age dynamics of NGStimulation Index (IS)

 

Известно, что иммунный ответ меняется с возрастом. Наиболее уязвимой возрастной группой в ряде исследований определены люди старческого возраста, которые демонстрируют предрасположенность к воспалениям и инфекциям в сочетании с увеличением заболеваемости и смертности, чаще чем у более молодых людей [10, 11, 13]. Полученные авторами данные с применением метода проточной цитометрии свидетельствуют о том, что повышение внутриклеточной концентрации кальция в покоящихся нейтрофилах и/или снижение поглощения гексозы приводит к снижению фагоцитарной способности и снижению бактерицидной активности нейтрофилов у людей старческого возраста, как и в нашем исследований [12]. Существует консенсус относительно неизменного количества нейтрофилов в кровообращении с возрастом. Кроме этого, данные об изменениях тканевой инфильтрации, фагоцитоза и взрывной способности нейтрофилов у пожилых доноров противоречивы. Возрастное снижение активности нейтрофилов и, как следствие, повышение восприимчивости к инфекциям у пожилых доноров было выявлено в более ранней работе [8]. При сравнении фагоцитарной активности пациентов пожилого и старческого возраста Севера, было обнаружено возрастное снижение не только удельного веса активно фагоцитирующих гранулоцитов крови, но и уровня компенсаторного повышения интенсивности фагоцитоза этими клетками [5]. При сравнении функциональной активности НГ у пациентов молодого, среднего и возраста долгожителей функции нейтрофилов в группе среднего возраста были хуже, чем у молодых людей и долгожителей (меньший хемотаксис, фагоцитоз и более высокие уровни адгезии и супероксид-аниона). Функции нейтрофилов долгожителей были ближе к таковым у молодых людей. Возрастные различия в функциях нейтрофилов были принципиально схожими у мужчин и женщин, за исключением внутриклеточных уровней супероксид-анионов, которые были ниже у женщин, чем у мужчин. При нормальном старении общий уровень глутатиона снижается, но у долгожителей в этом исследовании уровни были аналогичны таковым у молодых людей. Долгожители показали самую высокую активность каталазы из трех групп [9]. В нашей еще не завершенной работе с группой долгожителей также предварительно получены лучшие показатели у геронтов по сравнению с группой старческого возраста. Сохранение функций и антиоксидантных систем нейтрофилов долгожителей по всей видимости играет одну из ключевых ролей в их долголетии.

Заключение

Прогрессирующее ухудшение работы факторов иммунной системы неизбежно сопровождает старение, фагоцитарная активность НГ и поглотительная и переваривающая, по данным ряда авторов и полученными нами, снижается максимально именно в старческом возрасте.

Об авторах

Х. З. Трапш

ГНУ «Институт экспериментальной патологии и терапии Академии наук Абхазии»

Email: azmatua76@mail.ru

младший научный сотрудник лаборатории иммунологии и вирусологии

Абхазия, Сухум

А. З. Матуа

ГНУ «Институт экспериментальной патологии и терапии Академии наук Абхазии»

Автор, ответственный за переписку.
Email: azmatua76@mail.ru

к.б.н., доцент, заместитель директора по научной работе, зав. лабораторией иммунологии и вирусологии

Абхазия, Сухум

Т. С. Амаба

ГНУ «Институт экспериментальной патологии и терапии Академии наук Абхазии»

Email: azmatua76@mail.ru

младший научный сотрудник лаборатории иммунологии и вирусологии

Абхазия, Сухум

Ф. А. Горухчиева

ГНУ «Институт экспериментальной патологии и терапии Академии наук Абхазии»

Email: azmatua76@mail.ru

младший научный сотрудник лаборатории иммунологии и вирусологии

Абхазия, Сухум

С. Д. Смыр

ГНУ «Институт экспериментальной патологии и терапии Академии наук Абхазии»

Email: azmatua76@mail.ru

младший научный сотрудник лаборатории иммунологии и вирусологии

Абхазия, Сухум

И. Г. Конджария

ГНУ «Институт экспериментальной патологии и терапии Академии наук Абхазии»

Email: azmatua76@mail.ru

к.б.н., доцент, старший научный сотрудник лаборатории иммунологии и вирусологии

Абхазия, Сухум

З. Я. Миквабия

ГНУ «Институт экспериментальной патологии и терапии Академии наук Абхазии»

Email: azmatua76@mail.ru

д.м.н., профессор, академик Академии наук Абхазии, директор

Абхазия, Сухум

Список литературы

Дополнительные файлы