Оценка влияния синтетического пептида активного центра гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора – ZP2 на ростовые свойства Corynebacterium spp.

Обложка


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Цель – изучить влияние синтетического пептида активного центра гранулоцитарно-макрофагального колиниестимулирующего фактора ZP2 на ростовые свойства и биопленкообразование микроорганизмов рода Corynebacterium spp.

Опыты in vitro проведены на 13 изолятах Corynebacterium spp., включая С. amycolatum (n = 7), С. propinquum (n = 2) и C. pseudodiphtheriticum (n = 4)), выделенных ранее от здоровых лиц и хранящихся в Сетевой коллекции симбиотических микроорганизмов и их консорциумов Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН. Влияние различных концентраций пептида ZP2 на ростовые свойства (прирост планктонной культуры и биопленкообразование) тест-штаммов оценивали в 96-луночных полистироловых планшетах. Угнетающее действие пептида ZP2 на прирост планктонной культуры оценивали по Индексу ингибирования (%), на биопленкообразование – по Степени ингибирования биопленкообразования (%).

Экспериментально установлено, что через 2, 4, 6 и 24 часа наблюдалось дозо-зависимое ингибирование прироста планктонной культуры всех исследуемых штаммов бактерий под влиянием различных концентраций ZP2 (0,5-2,0 мкг/мл). При этом ингибирующий эффект пептида ZP2 зависел как от его концентрации в среде культивирования, так и от фазы роста тест-штамма бактерий. Максимальное ингибирование прироста планктонной культуры всех исследуемых бактериальных штаммов под влиянием различных концентраций пептида ZP2 наблюдалось через 24 часа и составило у С. amycolatum от 89,3±1,9 до 94,1±1,8%, у С. propinquum от 90,0±0,6 до 96,7±0,3%, у C. pseudodiphtheriticum от 92,2±2,1 до 95,1±1,3. Пептид ZP2 также оказывал существенное влияние на биопленкообразование всех исследуемых тест-культур. Снижение биопленкообразования зависело от концентрации пептида и составило у С. amycolatum от 62,4% до 78,4%, у С. propinquum от 70,9 до 79,6% и у C. pseudodiphtheriticum от 76 до 82,7%.

Таким образом, выявлено антибактериальное действие пептида ZP2 в отношении изученных штаммов коринебактерий видов С. amycolatum, С. propinquum и C. pseudodiphtheriticum. По имеющимся данным, пептид ZP2 является препаратом с широким спектром действия, оказывающим ингибирующее влияние не только на изученные актинобактерии, но и, согласно литературным данным, на стафилококки и энтеробактерии. Важной перспективой исследования является раскрытие механизма антибактериального действия пептида ZP2 с характеристикой эффективной концентрации вещества в отношении патогенов и представителей нормофлоры.

Полный текст

Введение

В последние десятилетия внимание ученых ведущих стран мира привлекают исследования препаратов на основе антимикробных пептидов, которые рассматриваются в качестве альтернативы традиционным антибиотикам [13]. Известно, что антимикробные пептиды обладают слабой антимикробной активностью, но выраженным иммуномодулирующим эффектом при вторжении в организм хозяина патогенных микроорганизмов или вирусов. Они не активируют адаптивный иммунитет, а скорее повышают его эффективность за счет адъювантной активности [12, 17].

В отношении бактерий, действие антимикробных пептидов до конца не изучено, однако показано, что их основными мишенями являются клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана и внутриклеточные молекулы [11, 14]. Одним из хорошо изученных антимикробных пептидов является синтетический аналог активного центра гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) – пептид ZP2 [4]. Ранее было установлено, что данный пептид проявляет плейотропные эффекты, обладая не только иммунотропными и репаративными свойствами, но и антимикробной активностью, в отношении оппортунистических патогенов [2, 3]. Однако на сегодняшний день остается не изученным влияние синтетического пептида ZP2 на представителей нормофлоры, в частности коринебактерии.

Известно, что микроорганизмы рода Corynebacterium являются резидентными представителями индигенной флоры тела человека [8]. В последнее время появляется все больше исследований о важной роли отдельных видов коринебактерий в поддержании колонизационной резистентности различных биотопов тела человека. Так, Corynebacterium glutamicum, C. pseudodiphtheriticum, C. accolens, C. parvum [7, 8, 9] рассматриваются в качестве симбиотически-значимых микроорганизмов, обладающих антимикробной активностью по отношению к условно-патогенным бактериям. В то же время установлено, что у иммуносупрессированных пациентов представители данного рода могут вызывать различные тяжелые заболевания [16].

Цель исследования – оценить влияние синтетического пептида ZP2 на ростовые свойства и биопленкообразование микроорганизмов рода Corynebacterium spp., выделенных из различных биотопов тела человека.

Материалы и методы

Объектами исследования служили 13 штаммов бактерий рода Corynebacterium, а именно видов С. amycolatum (n = 7), С. propinquum (n = 7) и C. pseudodiphtheriticum (n = 4), выделенных ранее от здоровых лиц (влагалище, кожа, верхние дыхательные пути) и хранящихся в Сетевой коллекции симбиотических микроорганизмов и их консорциумов Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН – обособленного структурного подразделения ОФИЦ УрО РАН (Оренбург, Россия),

Ранее выделенные штаммы коринебактерий были идентифицированы с помощью масс-спектрометрии с матричной лазерной десорбцией и ионизацией, и временем пролета (MALDI-TOF). Микроорганизмы хранили в сердечно-мозговом бульоне (СМБ) (HiMedia Laboratories Pvt. Ltd., Мумбаи, Индия, Мэриленд, США), содержащем 20% (по объему) глицерина, при -80 °С. Для эксперимента штаммы выращивали в СМБ при 37 °C в течение 24 часов и однократно субкультивировали в той же среде при 37 °C в течение 24 часов перед использованием.

Исследование влияния синтетического пептида ZP2 на рост планктонной культуры исследуемых штаммов производилось согласно методике [1] с незначительными изменениями в следующем порядке: аликвоты по 25 мкл суточных агаровых культур (5 × 108 КОЕ/мл), приготовленных на изотоническом растворе NaCl, переносили в лунки 96-луночного планшета и добавляли по 225 мкл СМБ с пептидом ZP2 (в конечных концентрациях: 0,5; 1,0 и 2,0 мкг/мл). Контрольные лунки содержали тестируемый штамм и СМБ. После инкубирования в течение 24 часов при 37 °С, замеряли оптическую плотность культур (OД) при длине волны (λ) 492 нм на спектрофотометре StatFax 2100 (CША). ОД культур замерялась на 0 (исходное значение), 2, 4, 6 и 24 часах инкубации.

Влияние пептида ZP2 на рост планктонной культуры исследуемых штаммов бактерий рассчитывали по формуле [1]:

ИИ = (OДк – Oдо)/Oдк × 100%,

где ИИ – Индекс ингибирования (%); OДк и OДо – оптическая плотность контроля и опыта соответственно. Индекс ингибирования оценивался через 2, 4, 6 и 24 часов.

Изучение влияния синтетического пептида ZP2 на биопленкообразование (БПО) исследуемых тест-культур определяли с помощью «планшетного метода» с незначительными модификациями [15]. Аликвоты по 25 мкл суточных агаровых культур (5 × 108 КОЕ/мл), приготовленных на изотоническом растворе NaCl, переносили в каждую лунку 96-луночного планшета и добавляли по 225 мкл ZP2 (в концентрациях: 0,5; 1,0 и 2,0 мкг/мл, предварительно разведенных в СМБ). Контрольные лунки содержали тестируемый штамм и СМБ. После инкубирования в течение 24 часов при 37 °С среду сливали, а планктонные клетки удаляли из каждой лунки путем двойной осторожной промывки стерильным фосфатно-солевым буфером (PBS). После этого биопленки фиксировали 200 мкл метанола в течение 10 мин, окрашивали 200 мкл 0,1% кристаллического фиолетового в течение 10 мин и аккуратно трижды промывали водой. Кристаллический фиолетовый, прикрепленный к образцам биопленок, растворяли в 200 мкл 95% этанола. Оптическую плотность (ОД, у.е.) 125 мкл экстрактов измеряли при 540 нм с использованием микропланшетного спектрофотометра StatFax 2100 (CША) как величину, отражающую выраженность биопленки. Ингибирование биопленки (%) рассчитывали по следующему уравнению:

Степень ингибирования БПО (%) = (1-OДо/OДк) × 100,

где OДо – оптическая плотность опыта (СМБ, содержащий различные концентрации пептида ZP2), OДк – оптическая плотность контроля (СМБ без пептида ZP2).

Все эксперименты повторялись трижды. Экспериментальные данные обработаны методами вариационной статистики с вычислением из 3 измерений средней арифметической и ее ошибки (M±m). О достоверности отличий между контролем и опытом судили по критерию Стьюдента – t [6].

Результаты и обсуждение

Полученные результаты в эксперименте in vitro свидетельствовали, что внесенный в жидкую питательную среду синтетический пептид активного центра ГМ-КСФ – ZP2 ингибировал рост изученных изолятов С. amycolatum, С. propinquum и C. pseudodiphtheriticum, дозо-зависимо снижая биомассу, оцениваемую по величине оптической плотности контрольных и опытных культур в динамике их развития (рис. 1). При этом ингибирующий эффект пептида ZP2 в отношении С. amycolatum, С. propinquum и C. pseudodiphtheriticum зависел как от концентрации фактора в среде культивирования, так и от фазы роста изолятов бактерий (табл. 1).

 

Рисунок 1. Рост штаммов С. amycolatum (А), С. propinquum (Б) и C. pseudodiphtheriticum (В) под влиянием различных концентраций ZP2

Примечание. 1 – 0,5 мкг/мл; 2 – 1,0 мкг/мл; 3 – 2,0 мкг/мл; К – контроль.

Figure 1. Growth of strains C. amycolatum (A), C. propinquum (B), and C. pseudodiphtheriticum (C) under the influence of different concentrations of ZP2

Note. 1, 0.5 μg/ml; 2, 1.0 µg/ml; 3, 2.0 µg/ml; K, control.

 

ТАБЛИЦА 1. Индекс ингибирования (ИИ, %) роста штаммов С. amycolatum, С. propinquum и C. pseudodiphtheriticum под влиянием различных концентраций ZP2

TABLE 1. Inhibition index (AI, %) of growth of strains C. amycolatum, C. propinquum and C. pseudodiphtheriticum under the influence of various concentrations of ZP2

Время культивирования

Cultivation time

Индекс ингибирования (ИИ,%) роста бактерий

при разных концентрациях ZP2 в питательной среде

Bacterial growth inhibition index (II,%)

at different concentrations of ZP2 in the nutrient medium

0,5 мкг/мл

0.5 µg/mL

1,0 мкг/мл

1.0 µg/mL

2,0 мкг/мл

2.0 µg/mL

С. amycolatum

С. propinquum

C. pseudodiphtheriticum

С. amycolatum

С. propinquum

C. pseudodiphtheriticum

С. amycolatum

С. propinquum

C. pseudodiphtheriticum

2 часа

2 hours

10,2±1,8*

8,1±2,3

11,0±0,8*

7,4±1,8

15,1±0,5*

17,0±1,3*

2,0±0

5,1±0,5

3,3±0,8

4 часа

4 hours

34,5±3,5*

34,8±1,3*

38,5±1,2*

38,5±7,5*

37,0±2,5*

40,8±2,1*

35,1±2,1*

40,5±1,5*

43,3±0,9*

6 часов

6 hours

17,3±4,1*

12,0±2,8*

19,3±2,3*

18,9±1,8*

16,3±1,6*

18,6±1,5*

45,3±1,5*

35,6±2,5*

58,2±0,9*

24 часа

24 hours

89,3±1,9*

90,0±0,6*

92,2±2,1*

92,0±2,5*

90,0±1,3*

95,1±1,3*

94,1±1,8*

96,7±0,3*

92,3±0,8*

           

Примечание. * – достоверные отличия от контроля (p < 0,05).

Note. *, significant differences from control (p < 0.05).

 

Следует отметить, что через 2 часа инкубирования Corynebacterium spp. в присутствии пептида ZP2 заметного снижения прироста планктонной культуры микроорганизмов не наблюдалось. Более того, в отношении С. amycolatum, С. propinquum и C. pseudodiphtheriticum регистрировалась слабо выраженная (2,0±0; 5,1±0,5 и 3,3±0,8% соответственно) стимуляция роста бактерий под действием пептида ZP2 в концентрации 2,0 мкг/ мл. Установлено, что в диапазоне изученных концентраций ZP2 (0,5-2,0 мкг/мл) индекс ингибирования роста культур С. propinquum и C. pseudodiphtheriticum градиентно увеличивался через 4, 6 и 24 часа культивирования, свидетельствуя о дозо-зависимом эффекте влияния данного соединения на прирост планктонной культуры Corynebacterium spp. в жидкой питательной среде (СМБ).

Через 24 часа наблюдалось максимальное угнетение прироста планктонной культуры всех исследуемых штаммов под влиянием различных концентраций пептида ZP2: 0,5; 1,0; 2,0 мкг/мл, что составило соответственно у С. amycolatum – 89,3±1,9; 92,0±2,5; 94,1±1,8%, С. propinquum – 90,0±0,6; 90,0±1,3; 96,7±0,3%, C. Pseudodiphtheriticum – 92,2±2,1; 95,1±1,3; 92,3±0,8%.

Синтетический пептид ZP2 также оказывал существенное ингибирующее влияние на биопленкообразование всех исследуемых тест-культур коринебактерий (рис. 2). Снижение биопленкообразования зависело от концентрации и составило у С. amycolatum от 62,4% до 78,4%, у С. propinquum от 70,9% до 79,6% и у C. pseudodiphtheriticum от 76,0% до 82,7%.

 

Рисунок 2. Степень ингибирования биопленкообразования штаммов С. amycolatum, С. propinquum и C. pseudodiphtheriticum в зависимости от концентрации пептида ZP2

Figure 2. Degree of inhibition of biofilm formation of C. amycolatum strains, C. propinquum and C. pseudodiphtheriticum in depending on the concentration of the ZP2 peptide

 

Заключение

Таким образом, выявлено антибактериальное действие синтетического аналога активного центра гранулоцитарно-макрофагального колиниестимулирующего фактора – пептида ZP2 в отношении изученных штаммов коринебактерий С. amycolatum, С. propinquum и C. pseudodiphtheriticum. Указанные микроорганизмы являются представителями нормальной микробиоты различных биотопов тела человека (влагалище, верхние дыхательные пути, кожа и др.), а отдельные штаммы этих видов бактерий в настоящее время рассматриваются как перспективные пробиотики, рост и размножение которых может находиться под влиянием пептида ZP2, что необходимо учитывать при использовании в клинической/косметологической практике создаваемых на его основе новых лекарственных препаратов [4].

Безусловный интерес представляют полученные результаты об угнетении пептидом ZP2 способности коринебактерий формировать биопленки, которые обеспечивают микроорганизмам возможность колонизации биотопов и длительной персистенции в них [3, 8]. В будущем следует выяснить, является эффект ингибирования пептидом ZP2 биопленкообразования коринебактериями, сопряженным только с угнетением роста этих микроорганизмов, или он реализуется через иные механизмы воздействия на бактериальные клетки.

По имеющимся данным, пептид ZP2 является препаратом с широким спектром действия, оказывающим ингибирующее влияние не только на изученные актинобактерии, но и, согласно литературным источникам, на стафилококки и энтеробактерии [5]. Важной перспективой дальнейших исследований является раскрытие механизма антибактериального действия пептида ZP2 с характеристикой эффективной концентрации вещества в отношении патогенов и представителей нормофлоры.

×

Об авторах

В. А. Гриценко

Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук – обособленное структурное подразделение ФГБУН «Оренбургский федеральный исследовательский центр» Уральского отделения Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: vag59@mail.ru

д.м.н., профессор, главный научный сотрудник лаборатории персистенции и симбиоза микроорганизмов

Россия, Оренбург

Н. В. Морозова

Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук – обособленное структурное подразделение ФГБУН «Оренбургский федеральный исследовательский центр» Уральского отделения Российской академии наук

Email: vag59@mail.ru

к.б.н., научный сотрудник лаборатории персистенции и симбиоза микроорганизмов

Россия, Оренбург

И. В. Гладышева

Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук – обособленное структурное подразделение ФГБУН «Оренбургский федеральный исследовательский центр» Уральского отделения Российской академии наук

Email: vag59@mail.ru

к.м.н., старший научный сотрудник лаборатории биомедицинских технологий, Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза

Россия, Оренбург

С. В. Черкасов

Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук – обособленное структурное подразделение ФГБУН «Оренбургский федеральный исследовательский центр» Уральского отделения Российской академии наук

Email: vag59@mail.ru

д.м.н., член-корр. РАН, главный научный сотрудник лаборатории биомедицинских технологий

Россия, Оренбург

Список литературы

  1. Бухарин О.В., Гриценко В.А. Влияние in vitro препарата лейкоцитарного катионного белка «Интерцид» на Escherichia coli // Антибиотики и химиотерапия, 2000. № 45 (1). C. 16-20. [Bukharin O.V., Gritsenko V.A. In vitro influence of the leukocyte cationic protein drug “Intertsid” on Escherichia coli. Antibiotiki i khimioterapiya = Antibiotics and Chemotherapy, 2000, no. 45 (1), pp. 16-20. (In Russ.)]
  2. Гриценко В.А., Тяпаева Я.В., Добрынина М.А., Зурочка А.В. Сравнительный анализ бактерицидных свойств синтетического пептида активного центра ГМ-КСФ – ZP2 в отношении грамотрицательных бактерий разной таксономической принадлежности // Российский иммунологический журнал, 2021. Т. 24, № 2. С. 221-228. [Gritsenko V.A., Tyapaeva Ya.V., Dobrynina M.A., Zurochka A.V. Comparative analysis of the bactericidal properties of the synthetic peptide of the active center of GM-CSF – ZP2 in relation to gram-negative bacteria of different taxonomic affiliations. Rossiyskiy immunologicheskiy zhurnal = Russian Journal of Immunology, 2021, Vol. 24, no. 2, pp. 221-228. (In Russ.)] doi: 10.46235/1028-7221-1016-CAO.
  3. Добрынина М.А., Зурочка А.В., Тяпаева Я.В., Белозерцева Ю.П., Гриценко В.А. Оценка влияния синтетического пептида активного центра гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора – ZP2 на рост и биопленкообразование клинических изолятов энтеробактерий in vitro // Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН, 2018. № 4. 17 c. [Dobrynina M.A., Zurochka A.V., Tyapaeva Ya.V., Belozertseva Yu.P., Gritsenko V.A. Assessment of the influence of the synthetic peptide of the active center of the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor – ZP2 on the growth and biofilm formation of clinical isolates of enterobacteria in vitro. Byulleten Orenburgskogo nauchnogo tsentra UrO RAN = Bulletin of the Orenburg Scientific Center of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, 2018, no. 4, 17 p. (In Russ.)]
  4. Зурочка А.В., Гриценко В.А., Зурочка В.А., Добрынина М.А., Черешнев В.А. Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) и его синтетические аналоги: иммунобиологические эффекты и клиническое применение. Екатеринбург: УрО РАН, 2021. 288 с. [Zurochka A.V., Gritsenko V.A., Zurochka V.A., Dobrynina M.A., Chereshnev V.A. Granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and its synthetic analogues: immunobiological effects and clinical application]. Yekaterinburg: Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, 2021. 288 p.
  5. Зурочка А.В., Добрынина М.А., Зурочка В.А., Гриценко В.А. Чувствительность музейных и клинических штаммов энтеробактерий к синтетическому пептиду активного центра ГМ-КСФ – ZP2 // Российский иммунологический журнал, 2020. Т. 23, № 4. С. 403-410. [Zurochka A.V., Dobrynina M.A., Zurochka V.A., Gritsenko V.A. Sensitivity of museum and clinical strains of enterobacteria to the synthetic peptide of the active center of GM-CSF – ZP2. Rossiyskiy immunologicheskiy zhurnal = Russian Journal of Immunology, 2020, Vol. 23, no. 4, pp. 403-410. doi: 10.46235/1028-7221-503-SOA.
  6. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1990. 352 с. [Lakin G.F. Biometrics]. Moscow: Vysshaya shkola, 1990. 352 p.
  7. Bomar L., Brugger S.D., Yost B.H., Davies S.S., Lemon K.P. Corynebacterium accolens releases antipneumococcal free fatty acids from human nostril and skin surface triacylglycerols. mBio, 2016, Vol. 7, no. 1, e01725-15. doi: 10.1128/mBio.01725-15.
  8. Graevenitz A., Bernard K. “The genus Corynebacterium-medical” in The Prokaryotes. J. New York, NY: Springer, 2006, pp. 819-842.
  9. Kataoka N., Vangnai A.S., Pongtharangkul T., Yakushi T., Wada M., Yokota A., Matsushita K. Engineering of Corynebacterium glutamicum as a prototrophic pyruvate-producing strain: characterization of a ramA-deficient mutant and its application for metabolic engineering. J. Biosci. Biotechnol. Biochem., 2019, Vol. 83, no. 2, pp. 372-380.
  10. Lappan R., Peacock C.S. Corynebacterium and Dolosigranulum: future probiotic candidates for upper respiratory tract infections. Microbiol. Aust., 2019, Vol. 40, no. 4, pp. 172-177. Nicias P. Multifunctional host defense peptides: Intracellular-targeting antimicrobial peptides. FEBS, 2009, Vol. 276, no. 22, pp. 6483-6496.
  11. Oppenheim J.J., Biragyn A., Kwak L.W., Yang D. Roles of antimicrobial peptides such as defensins in innate and adaptive immunity. Ann. Rheum. Dis., 2003, no. 62, pp. 17-21.
  12. Park S-C., Park Y., and Hahm K-S. The Role of Antimicrobial Peptides in Preventing Multidrug-Resistant Bacterial Infections and Biofilm Formation. Int. J. Mol. Sci., 2011, Vol. 12, no. 9, pp. 5971-5992.
  13. Pieters R.J., Arnusch C.J., Breukink E. Membrane permeabilization by multivalent anti-microbial peptides. Protein Pept. Lett., 2009, Vol. 16, no. 7, pp. 736-742.
  14. Stepanovic S., Vukovic D., Hola V., Djukic S., Cirkovic I., Ruzicka F. Quantification of biofilm in microtiter plates: overview of testing conditions and practical recommendations for assessment of biofilm production by staphylococci. APMIS, 2007, Vol. 115, no. 8, pp. 891-899.
  15. Zasada A.A., Mosie E. Contemporary microbiology and identifcation of Corynebacteria spp. causing infections in human. Lett. Appl. Microbiol., 2018, no. 66, pp. 472-483.
  16. Zasloff M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature, 2002, no. 415 (6870), pp. 389-395.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рисунок 1. Рост штаммов С. amycolatum (А), С. propinquum (Б) и C. pseudodiphtheriticum (В) под влиянием различных концентраций ZP2 Примечание. 1 – 0,5 мкг/мл; 2 – 1,0 мкг/мл; 3 – 2,0 мкг/мл; К – контроль.

Скачать (239KB)
Метаданные
3. Рисунок 2. Степень ингибирования биопленкообразования штаммов С. amycolatum, С. propinquum и C. pseudodiphtheriticum в зависимости от концентрации пептида ZP2

Скачать (175KB)
Метаданные

© Гриценко В.А., Морозова Н.В., Гладышева И.В., Черкасов С.В., 2024

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № 77 - 11525 от 04.01.2002.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах