Авидин-позитивные тучные клетки печени при воздействии водорастворимого кремния в течение девяти месяцев

Полный текст

Введение

Тучные клетки – многофункциональные клетки, задействованные во многих физиологических и патологических процессах, происходящих в организме [1, 5]. Ранее нами было обнаружено, что хроническое поступление с питьевой водой кремния приводит к изменению микроморфологического строения печени лабораторных крыс, а также увеличению средней площади тучных клеток, выявляемых толуидиновым синим [2]. Окраска толуидиновым синим позволяет оценить степень зрелости гепарина визуально, его количество можно рассчитать только с помощью индекса сульфатированности [3]. В то же время авидин связывается с гепарином и его флуоресценция прямо пропорциональна количеству гепарина в гранулах тучных клеток [1]. Гепарин – гликозаминогликан, являющийся матриксом для обеспечения оптимального расположения, хранения и регуляции экспорта синтезируемых в клетке медиаторов, в отношении которых он проявляет регуляторные свойства. Кроме того, гепарин, связываясь со многими белками, может препятствовать рекрутированию провоспалительных клеток, адгезию нейтрофилов к эндотелиальным клеткам сосудов [4]. Таким образом, целью работы явилось изучение реакции авидин-позитивных тучных клеток печени на поступление кремния с питьевой водой в концентрации 20 мг/л в течение девяти месяцев.

Материалы и методы

Эксперимент проводился на белых нелинейных крысах-самцах, находившихся в обычных условиях вивария при естественном освещении. Животные (n = 6) были разделены на две группы: контрольную (n = 3), которая получала питьевую бутилированную воду; опытную (n = 3), получавшую ту же самую воду, но с добавлением девятиводного метасиликата натрия в концентрации 10 мг/л в пересчете на кремний. Определение массовой концентрации растворенных форм кремния проводилось с помощью спектрометра эмиссионного с индуктивно связанной плазмой 5110 ICP-OES. Так, в питьевой воде, получаемой животными контрольной группы, содержалось 10 мг/л кремния, а в воде, получаемой опытной группой, – 20 мг/л.

Через девять месяцев животные были выведены из эксперимента, печень извлечена и помещена в 10% нейтральный формалин для последующей заливки в парафин. Срезы печени толщиной 6 мкм после депарафинизации инкубировались 30 минут с авидином, меченным флуоресцентной меткой зеленого цвета. Рабочий раствор готовился из готового меченого авидина (Avidin, Alexa Fluor^® 488 conjugate, Invitrogen, Германия) и 0,1 М фосфатного буфера в соотношении 1:200. Раствор авидина сливался, срезы тщательно промывались в фосфатном буфере. После промывки в фосфатном буфере срезы заключались под покровное стекло в раствор, содержащий фосфатный буфер и глицерин (1:1). Препараты анализировались под люминесцентным микроскопом при длине волны возбуждающего света 495 нм [1, 5].

Микрофотографии с полей зрения, полученные при увеличении объектива × 40, обрабатывали в программе AmScope: подсчитывали среднее количество авидин-позитивных клеток, измеряли площадь и интенсивность флуоресции клеток с помощью функции «цветной куб» в автоматическом режиме.

В целях определения взаимосвязи между площадью клетки и ее интенсивностью флуоресценции рассчитывали коэффициент ранговой корреляции Спирмена (r_s). При этом сила корреляционной связи считалась слабой при 0 < r_s < 0,29, средней – при 0,3 < r_s < 0,69, сильной – при 0,7 < r_s < 1,0.

Полученные в ходе измерения выборки проверяли на нормальность распределения с использованием критериев Шапиро–Уилка и Колмогорова–Смирнова. Данные имеющие нормальное распределение представляли как среднюю арифметическую со стандартной ошибкой среднего значения, в виде M±m. Статистическую значимость отличий определяли с помощью t-критерия Стьюдента для независимых выборок. При ненормальном распределении выборок данные представлялись как медиана (Me) и интерквартильный размах (Q_0,25-Q_0,75). В этом случае для определения статистической значимости использовали U-критерий Манна–Уитни. Различия в обоих случаях считали статистически значимыми при р < 0,05.

Результаты и обсуждение

Авидин-позитивные тучные клетки обладали зеленой флуоресценцией и преимущественно располагались в области портальных зон печени. Визуальная оценка обнаружила увеличение их количества в печени крыс, получавших водорастворимый кремний в концентрации 20 мг/л в течение девяти месяцев, особенно за счет клеток со слабой флуоресценцией, которые, вероятно, содержали слабо сульфатированный гепарин. Также отмечалось увеличение числа дегранулированных клеток в печени крыс опытной группы. Подсчитывали среднее количество клеток в области портальных зон печеночной дольки, так, в контрольной группе их количество составило 15±1,41, а в опытной группе – 17,6±0,71 клеток (р = 0,156). При этом в контрольной группе 26,7% клеток имели слабую флуоресценцию, в опытной – 31,8%. С помощью функции «цветной куб» определяли медиану площади флуоресцирующих клеток, которая составила 14,66 (5,37-34,17) и 20,73 (9,5-48,73) для контрольной и опытной группы соответственно (p = 0,001). Площади клеток распределяли с помощью гистограммы на три группы: малые по размеру (< 38,62 мкм²), средние (38,62-74,80 мкм²) и большие (> 74,80 мкм²) по размеру. Так, в контрольной группе распределение составило 77%, 13% и 10%, а в опытной – 67%, 21% и 12%. Т. е. медиана площади тучных клеток изменялась за счет уменьшения количества клеток малого размера и увеличения количества клеток среднего и большого размера. Определяли среднюю интенсивность флуоресценции среди малых, средних и больших клеток, так, в контрольной группе их интенсивность составила 40,94±2,88 у. е., 60,34±6,54 у. е. и 79,54±6,07 у. е., а в опытной – 78,28±3,83 у. е., 118,25±5,17 у. е. и 103,21±4,68 у. е. соответственно. Проведенный корреляционный анализ подтвердил наличие прямой сильной корреляционной связи между площадью клетки и ее интенсивностью в контрольной группе (r_s = 0,73; p < 0,05) и прямой средней силы корреляционной связи в опытной (r_s = 0,67; p < 0,05) группе.

Исходя из вышеизложенного, можно заключить, что в печени крыс, наряду с увеличением площади авидин-позитивных тучных клеток, происходит увеличение количества гепарина; возрастает количество гепарина в тучных клетках печени крыс опытной группы в сравнении с контрольной.

Заключение

Таким образом, можно сделать вывод, что кремний, поступающий с питьевой водой в концентрации 20 мг/л в течение девяти месяцев, приводит к увеличению медианы площади авидин-позитивных тучных клеток в печени, интенсивности их флуоресценции, а также их количества в области портальных зон за счет клеток со слабой флуоресценцией.

Об авторах

Е. А. Григорьева

ФГБОУ ВО «Чувашский государственный университет имени И.Н. Ульянова»

Автор, ответственный за переписку.
Email: shgrev@yandex.ru

ассистент кафедры медицинской биологии с курсом микробиологии и вирусологии

Россия, Чебоксары

В. С. Гордова

ФГАОУ ВО «Балтийский федеральный университет имени Иммануила Канта»

Email: shgrev@yandex.ru

к.м.н., доцент кафедры фундаментальной медицины медицинского института

Россия, Калининград

В. Е. Сергеева

ФГБОУ ВО «Чувашский государственный университет имени И.Н. Ульянова»

Email: shgrev@yandex.ru

д.б.н., профессор кафедры медицинской биологии с курсом микробиологии и вирусологии

Россия, Чебоксары

А. Т. Смородченко

Медицинская школа Берлина – Университет здоровья и медицины

Email: shgrev@yandex.ru

д.м.н., профессор кафедры анатомии

Германия, Берлин

Н. В. Смирнова

ФГБОУ ВО «Чувашский государственный университет имени И.Н. Ульянова»

Email: shgrev@yandex.ru

заведующая кафедрой медицинской биологии с курсом микробиологии и вирусологии

Россия, Чебоксары

Список литературы

Дополнительные файлы